肾上腺髓质素对豚鼠心室肌细胞L-型钙通道的作用及其信号转导机制

目的: 研究肾上腺髓质素( adrenomedullin, ADM)抑制豚鼠心室肌细胞L-型钙通道的信号转导机制。方法: 应用全细胞膜片钳技术,记录应用ADM(1-100 nmol·L^-1)前后L-型钙电流(I_Ca,L),以及分别记录应用ADM特异性受体拮抗剂ADM_22-52(100 nmol·L^-1)+ADM(100 nmol·L^-1)、蛋白激酶A (PKA) 特异性拮抗剂H-89(10 μmol·L^-1) + ADM(100 nmol·L^-1)、蛋白激酶C (PKC) 特异性拮抗剂PKC_19-36(10 μmol·L^-1)+ADM(100 nmol·L^-1)、PKC特异性激动剂PMA(1 μmol·L^-1)前后I_Ca,L。结果: ADM(1-100 nmol·L^-1)浓度依赖性地抑制豚鼠心室肌细胞I_Ca,L,并可被ADM_22-52(100 nmol·L^-1)完全阻断;H-89(10 μmol·L^-1)对ADM抑制I_Ca,L的作用无影响。PKC_19-36(10 μmol·L^-1)可完全阻断ADM 对I_Ca,L的抑制效应,且PMA(1 μmol·L^-1)可模拟ADM 对I_Ca,L的抑制效应。结论: ADM作用于特异性ADM受体可浓度依赖性地抑制豚鼠心室肌细胞I_Ca,L,此作用有可能与PKC激活相关。     

转基因细胞系CHL-3A4可使硝苯吡啶的多药耐药逆转作用丧失

目的:检测本实验室构建的表达人细胞色素P450 3A4同功酶转基因细胞系CHL-3A4的硝苯吡啶氧化酶活性。方法:利用多药耐药细胞K562r的阿霉素(ADR)耐药性可被硝苯吡啶逆转,而硝苯吡啶又可特异地被CYP3A4代谢,观察硝苯吡啶在CHL-3A4 S9混合物 (S9 mix) 中孵育前后的生物学活性变化来判断CHL-3A4细胞的CYP3A4硝苯吡啶氧化酶活性。结果:K562r细胞在含有硝苯吡啶(NIF) (12.5 μg·L^-1)的培养基中培养时,对阿霉素的IC₅₀值从不含NIF时的(6.47±0.60) mg·L^-1降至(0.89±0.15) mg·L^-1(P＜0.01)。K562r细胞在含有分别经CHL-3A4、CHL细胞的S9组分和灭活的CHL-3A4细胞的S9组分预处理的NIF(12.5 μg·L^-1)的培养基中培养时,阿霉素对其的IC₅₀值分别为(6.10±0.50) mg·L^-1、(0.32±0.09) mg·L^-1和(0.32±0.04) mg·L^-1。前者和后两者相比P＜0.01。 结论:实验室构建的表达人细胞色素P450 3A4同功酶转基因细胞系CHL-3A4具有硝苯吡啶氧化酶活性,从而进一步确证其表达产物为人CYP3A4同功酶。并为今后检测CYP同功酶活性提供了一种新的途径。     

金属硫蛋白对羟自由基损伤的大鼠肝细胞核核苷三磷酸酶的保护作用

目的:研究金属硫蛋白(MTs)是否对羟自由基(hydroxylradical,·OH^-)损伤的大鼠肝细胞核核苷三磷酸酶(NTPase)具有保护作用。方法:以羟自由基发生系统Fe³⁺/H₂O₂单独或与MTs共同孵育大鼠离体肝细胞核,检测分别用ATP和GTP作底物时大鼠肝细胞核NTPase活性。结果:不同浓度Fe³⁺/H₂O₂(μmol·L^-1/μmol·L^-1:0.1/0.5、0.5/2.5、1/5、5/25)孵育肝细胞核,浓度依赖地增强核NTPase活性,与对照组差异显著(P＜0.01)。用不同浓度的MT(10^-9-10^-4mol·L^-1)与Fe²⁺/H₂O₂(1μmol·L^-1/5μmol·L^-1)共孵育,浓度依赖地拮抗Fe³⁺/H₂O₂诱导的效应(P＜0.01)。用MT单独孵育肝细胞核对NTPase的活性没有影响(P＞0.05)。结论:Fe³⁺/H₂O₂系统产生的·OH对核NTPase活性具有强烈的抑制效应,MT浓度依赖地拮抗·OH导致的NTPase活性降低。     

钙调神经磷酸酶在血管紧张素Ⅱ刺激的大鼠心肌细胞肥大中的作用及其活性调节

目的:观察钙调神经磷酸酶(CaN)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激的大鼠心肌细胞肥大中的作用及其活性调节。方法:建立AngⅡ诱导的大鼠心肌细胞肥大模型,观察CaN抑制剂对AngⅡ刺激的心肌细胞 [³H]-亮氨酸掺入的影响,以及各种因素对心肌细胞CaN酶活性的影响。结果:10、 100、 1000 nmol·L^-1的AngⅡ作用12 h分别使心肌细胞的CaN活性增加了13%、 57%(P＜0.05)、 228%(P＜0.01)。AngⅡ(10 nmol·L^-1)刺激心肌细胞2 h内,CaN活性与对照组无明显差异(P＜0.05);AngⅡ刺激心肌细胞12 h以上,CaN活性才明显增高(P＜0.05)。Losartan(50 μmol·L^-1)、H₇(50 μmol·L^-1)及Fura-2/AM(4 μmol·L^-1)可明显抑制AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性;而PD98059(50 μmol·L^-1)对AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性无明显影响。AngⅡ(10^-7mol/L)刺激的大鼠心肌细胞 [³H]-亮氨酸掺入明显高于对照组(P＜0.01),而CaN特异性抑制剂-环孢素A(0.5~5 μg/mL)可以明显抑制AngⅡ刺激的心肌细胞 [³H]-亮氨酸掺入。结论:依赖Ca²⁺/CaM活化的CaN可能在AngⅡ刺激的心肌细胞肥大中起重要作用;CaN的活化可能有赖于胞内Ca²⁺水平的持续升高,另外,CaN的活性还可能受到蛋白激酶C等信号分子的磷酸化调节。     

汉防己碱与1, 6-二磷酸果糖对兴奋性氨基酸所致突触体内游离钙浓度升高的影响

目的:研究汉防己碱(Tet)与1, 6-二磷酸果糖(FDP)对兴奋性氨基酸(EAA)诱导的突触体内游离钙浓度升高的影响。方法:制备大鼠脑突触体, 以荧光法测定突触体内游离钙浓度;加入谷氨酸(Glu, 100μmol·L^-1), 天冬氨酸(Asp, 100μmol·L^-1), N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA, 100μmol·L^-1)及Glu+Asp(50μmol·L^-1+50μmol·L^-1)后, 测定突触体内游离钙浓度的变化;提前给予Tet(10、30、60μmol·L^-1), FDP(15、30、75、150μmol·L^-1), MK-801(10、20μmol·L^-1)及Tet+FDP(10+15, 30+30μmol·L^-1)预孵, 再加入上述浓度的Glu、Asp、NMDA及Glu+Asp, 观察突触体内游离钙浓度的变化。结果:Glu、Asp、NMDA及Glu+Asp均呈剂量依赖性升高突触体内游离钙浓度, 提前给予不同浓度的Tet、FDP、MK-801及Tet+FDP, 均可使突触体内游离钙浓度呈剂量依赖性降低, 且以Tet+FDP的作用最明显。结论:Tet与FPD可显著抑制EAA诱导的突触体内游离钙浓度的升高, 这可能是二者保护缺血脑细胞的作用机制之一。Tet与FDP联合应用可能对缺血脑细胞有更强的保护作用。     

5-羟色胺对心肌细胞增殖及蛋白激酶C活性的影响

目的：观察5-羟色胺（5-HT）对新生大鼠心肌细胞增殖及蛋白激酶C（PKC）活性的影响，探讨5-HT在心肌肥大发病中的作用。方法：培养乳鼠心肌细胞,应用BCA法测定细胞总蛋白；流式细胞仪测定DNA含量；同位素底物掺入检测PKC活性。结果：5-HT在1 μmol·L^-1、10 μmol·L^-1和100 μmol·L^-1时均显著促进心肌细胞蛋白质和DNA合成，以10 μmol·L^-1剂量时作用最强。5-HT在1 μmol·L^-1和10 mol·L^-1剂量时可加强心肌细胞PKC活性，并促使PKC从胞浆移位到细胞膜，5-HT₂受体拮抗剂mianserin可逆转此作用。结论：5-HT可促进新生大鼠心肌细胞总蛋白和DNA合成，并通过心肌细胞5-HT₂受体激活PKC活性，促使PKC从胞浆移位到细胞膜，提示5-HT可能参与心肌肥大的发生发展过程.     

新型光敏剂治疗敏感及耐药胃癌的实验研究

目的 探讨一种新型光敏剂DTP对敏感胃癌细胞(SGC7901)及长春新碱耐药胃癌细胞(SGC7901/VCR)的光动力学治疗作用.方法 采用荧光显微镜间接确认SGC7901及SGC7901/VCR细胞膜上P-糖蛋白(P-gp)的表达情况,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测DTP对SGC7901及SGC7901/VCR细胞的光动力学杀伤作用,荧光分光光度计测定两种细胞内的DTP吸收量,激光共聚焦显微镜观察DTP在两种细胞内的分布位置.结果 SGC7901细胞膜上几乎无P-gp分布,而SGC7901/VCR细胞膜上存在P-gp高表达.新型光敏剂DTP对SGC7901及SGC7901/VCR细胞均具有较强的光动力学杀伤作用,其中对SGC7901/VCR细胞的作用相对较弱(P＜0.05),且P-gp抑制剂维拉帕米或环孢素A的存在均不能增强DTP光动力学治疗对SGC7901/VCR细胞的杀伤作用(均P＞0.05).SGC7901细胞内的DTP吸收量高于SGC7901/VCR细胞(P＜0.05),且P-gp抑制剂维拉帕米和环孢素A均不能增加SGC7901/VCR细胞内的DTP吸收量(均P＞0.05).DTP分布于SG-C7901细胞的溶酶体以及SGC7901/VCR细胞的溶酶体和线粒体内.结论 新型光敏剂DTP并非多药转运蛋白P-gp的底物,其对SGC7901/VCR细胞较弱的光动力学杀伤作用与其细胞膜上过表达的P-gp无关,可能与DTP在两种细胞内的分布位置不同有关.     

白三烯D4在促进培养的人气管 平滑肌细胞增殖中的作用

目的和方法:研究白三烯D₄(LTD₄)是否剌激培养的人气管平滑肌细胞(ASMC)增殖。将分离的人ASMC进行传代培养,在培养基中加入各种浓度的LTD₄,计数细胞并测定 [³H]-胸腺嘧啶核苷([³H]-TdR)掺入量和三磷酸肌醇(IP₃)累积量。结果: LTD₄在一定范围内(0.1 nmoL·L^-1~10 nmoL·L^-1)以浓度依赖的方式增加人ASMC(P＜0.01)。LTD₄也增加[³H]-TdR的掺入量和IP₃累积量(P＜0.01)。磷脂酶C抑制剂新霉素(1 μmol·L^-1)阻止IP₃累积量的增加(P＜0.01)。结论:LTD₄剌激培养的人ASMC增殖并且可能在哮喘的气道重塑中起了作用。     

奥曲肽抑制肝星状细胞增殖及细胞外基质合成

目的:探讨奥曲肽对肝星状细胞(HSC)增殖与细胞外基质(ECM)合成的影响。方法:采用胶原酶二步原位灌注法分离、培养大鼠HSC,并分别给予转化生长因子1(TGFβ1)(2.5μg·L^-1)、奥曲肽(Oct)(0.01-10μg·L^-1)或TGFβ1(2.5μg·L^-1)+Oct(0.01-10mg·L^-1)干预,分别用MTT法、[³H]-TdR和[³H]-脯氨酸掺入法及放射免疫法检测各处理组HSC增殖及ECM合成水平。结果:Oct能不同程度抑制HSC[³H]-TdR掺入和增殖;能够显著抑制体外培养HSC[³H]-脯氨酸掺入,降低上清液透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)和IV型胶原(CIV)水平;TGFβ1能够诱导HSC表达ECM上调,Oct能够阻断TGFβ1对HSC的调控作用。结论:Oct能够有效地抑制HSC增殖及ECM合成与分泌。     

索拉非尼抑制人肝星状细胞胶原合成

目的: 研究索拉非尼(sorafenib)对人肝星状细胞胶原合成的影响。方法: 应用人肝星状细胞株LX-2进行体外研究,采用 -脯氨酸掺入法测定胶原的合成,采用免疫细胞化学法检测I型胶原蛋白表达,采用real-time PCR法测定I型胶原α1 mRNA表达。结果: 免疫细胞化学研究显示血小板源性生长因子(PDGF)刺激可引起LX-2细胞胶原合成增加,10.0 μmol·L^-1索拉非尼作用于LX-2细胞 24 h能明显抑制I型胶原蛋白的合成。无论有无PDGF的刺激,索拉非尼均呈剂量与时间依赖性地抑制LX-2细胞胶原合成(P<0.01);在10.0 μmol·L^-1浓度下,索拉非尼作用于LX-2细胞 12 h、24 h和48 h对胶原合成的抑制率为22.69%、37.52%和71.74%。索拉非尼剂量依赖性地抑制PDGF诱导的I型胶原α1 mRNA表达上调;在2.5 μmol·L^-1、5.0 μmol·L^-1和10.0 μmol·L^-1 索拉非尼作用下,I型胶原α1 mRNA表达较PDGF刺激组分别下调58.66%、 67.06%和81.64%。结论: 索拉非尼在体外能抑制人肝星状细胞胶原的合成,抑制I型胶原的表达,有可能成为一种新型的治疗肝纤维化药物。     

槲皮苷通过抑制PI3K/AKT信号通路诱导胃癌SGC7901细胞凋亡

目的:探讨槲皮苷是否通过抑制PI3K/AKT信号通路诱导人胃癌SGC7901细胞凋亡。方法:选取SGC7901细胞作为研究对象,采用MTT法检测槲皮苷对SGC7901细胞的毒性作用并测定IC50值。实验分为对照组(不加药处理)、槲皮苷组(采用200μmol/L槲皮苷处理)、PI3K/AKT通路激动剂胰岛素样生长因子1(IGF-1)组(采用100μg/L IGF-1处理)和槲皮苷+IGF-1组(采用200μmol/L槲皮苷+100μg/L IGF-1共处理)。处理48 h后,采用流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测cleaved caspase-3、p-AKT(Ser473)、AKT、p-PI3K(Tyr508)和PI3K的蛋白水平。结果:从100μmol/L开始,随着槲皮苷处理浓度的逐渐升高,SGC7901细胞活力显著降低(P 0. 05),槲皮苷作用48 h的IC50值为275. 40μmol/L。200μmol/L槲皮苷作用SGC7901细胞48 h后,与对照组比较,细胞凋亡率和cleaved caspase-3蛋白水平显著上升(P 0. 05),p-AKT和p-PI3K蛋白水平显著降低(P 0. 05),然而IGF-1与槲皮苷共同作用时,IGF-1可逆转槲皮苷对SGC7901细胞的作用效果。结论:槲皮苷能够诱导胃癌SGC7901细胞凋亡,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路的激活有关。     

藤黄酸增强人胃癌SGC7901/DDP细胞对顺铂的敏感性

目的 探讨藤黄酸（GA）对人胃癌SGC7901/DDP细胞顺铂敏感性的影响及其分子机制。方法 采用顺铂（DDP）浓度梯度递增法构建人胃癌顺铂耐药株SGC7901/DDP细胞,采用细胞计数盒-8（CCK-8）法检测藤黄酸和顺铂对SGC7901/DDP细胞的毒性作用,采用Chou-Talalay中效分析法定量评价藤黄酸和顺铂的联合作用效果,采用流式细胞术检测细胞凋亡,采用Western blotting方法检测Bcl-2、Bax、Survivin、多药耐药相关蛋白2（MRP2）、磷酸化氨基末端蛋白激酶（p-JNK）（Thr183/Tyr185）和JNK的蛋白水平。结果 藤黄酸与顺铂各自单独作用48 h的IC₅₀分别为2.94 μmmol/L和39.76 μmmol/L;当抑制率超过20%时,两者联合应用呈协同效应;藤黄酸可协同增强顺铂诱导的细胞凋亡（P<0.05）,下调Survivin和MRP2蛋白水平（P<0.05）,上调Bax蛋白水平（P<0.05）,抑制JNK磷酸化（P<0.05）;JNK特异性抑制剂SP600125可下调MRP2蛋白水平（P<0.05）。结论 藤黄酸可增强人胃癌SGC7901/DDP细胞对顺铂的敏感性,这可能与藤黄酸通过抑制JNK信号通路下调MRP2蛋白表达,以及上调Bax蛋白表达和下调Survivin蛋白表达有关。     

Fas基因转导逆转胃癌耐药细胞的作用及其机制分析

目的　 观察Fas基因转导人胃癌耐药细胞SGC790 1/VCR对化疗药物的敏感性 ,并初步探讨其机制。方法　 以流式细胞仪检测Fas基因转导和对照胃癌细胞在细胞周期中的分布 ;用MTT实验检查癌细胞对多种药物的敏感性 ;用免疫细胞化学染色法检测胃癌细胞P 糖蛋白 (P gp)和拓扑异构酶II(TopoII)的表达。结果　与胃癌细胞SGC790 1和pBK SGC790 1/VCR相比较 ,Fas SGC790 1/VCR在G2期减少 ,S期增多 ,并出现明显的凋亡峰 ;Fas SGC790 1/VCR对DDP ,MMC和 5 Fu的敏感性增加 ,但对VCR和DOX的敏感性无明显变化 ;SGC790 1,pBK SGC790 1/VCR和Fas SGC790 1/VCRTopoII的表达无明显差别 ;Fas SGC790 1/VCRP gp的表达水平明显低于 pBK SGC790 1/VCR ,仅显示弱阳性。 结论　Fas基因可在一定程度上逆转人胃癌耐药细胞SGC790 1/VCR的多药耐药性 (MDR) ,其涉及的相关机制可能是增强细胞对凋亡诱导剂的敏感性 ,以及降低细胞P gp的表达水平     

MDR相关性单克隆抗体MGr－1逆转胃癌细胞耐药的体外研究

目的：研究胃癌细胞耐药相关性单克隆抗体ＭＧｒ－１对耐长春新碱胃癌细胞（ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ）多药耐药性（ＭＤＲ）的影响。方法：用ＭＴＴ法检测阿霉素的细胞毒性；用流式细胞仪检测阿霉素在细胞内的蓄积及潴留。结果：ＭＧｒ－１能明显逆转ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞对阿霉素的耐药性（Ｐ＜０．０１），并可增加ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞内阿霉素的蓄积（Ｐ＜０．０１）及潴留（Ｐ＜０．０１）。结论：ＭＧｒ－１具有通过增加细胞内药物蓄积及潴留逆转ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞耐药性的功能。提示ＭＧｒ－１所对应的细胞膜抗原可能为一种新的有活性功能并与ＭＤＲ相关的分子。     

MAD2 RNA干扰载体的构建及其对胃癌细胞生长的影响

目的：构建MAD2（有丝分裂阻滞缺陷蛋白2）特异性RNA干扰真核表达载体,体外观察抑制MAD2基因表达对胃癌细胞生长和细胞周期的影响.方法：构建MAD2 siRNA真核表达载体,脂质体法将pSilencer3.1空载体和pSilencer3.1/MAD2-siRNA1和pSilencer3.1/MAD2-siRNA2真核表达载体分别导入人胃癌细胞系SGC7901.稳定转染后Western blot和RT-PCR检测胃癌细胞内MAD2蛋白及mRNA水平的表达情况,挑选出抑制效果最好的单个克隆.MTF法检测各实验组细胞生长情况,流式细胞术检测纺锤体抑制剂长春新碱作用后,胃癌细胞MAD2-siRNA转染组和空载体组细胞周期的分布.结果：成功构建MAD2 siRNA真核表达载体,转染胃癌细胞SGC7901可使其MAD2蛋白及mRNA表达显著下调.MAD2表达降低的胃癌细胞生长速度明显增快（P＜0.01）,经长春新碱作用后不能被阻滞于有丝分裂期.结论：小干扰RNA技术可以有效地特异性抑制胃癌细胞纺锤体检查点关键蛋白MAD2的表达.MAD2的抑制可使胃癌细胞SGC7901生长加速,增殖能力增强,同时减弱纺锤体抑制剂长春新碱阻滞细胞周期的作用.     

人参皂苷Rg1对脂多糖诱导的C6细胞株淀粉样前体蛋白和脑啡肽酶表达的影响

目的:为寻找治疗阿尔茨海默病的有效药物,探讨人参皂苷Rg1对脂多糖(LPS)诱导的C6细胞株淀粉样前体蛋白(APP)和脑啡肽酶(NEP)表达的影响。方法:应用MTT比色法检测一定剂量LPS(100 mg·L^-1)和不同浓度人参皂苷Rg1(2.5、5、10、20 μmol·L^-1)对C6细胞存活率的影响,应用RT-PCR观察细胞中APP、NEP表达的变化。结果:LPS作用于C6细胞株,C6细胞存活率下降,细胞内APP的表达增加,NEP的表达降低。人参皂苷Rg1能提高LPS处理的C6细胞存活率,使细胞内APP的表达降低,NEP的表达升高。结论:LPS造成细胞损伤和细胞内APP表达增加、NEP表达降低,人参皂苷Rg1对LPS造成的细胞毒性具有拮抗作用,可减弱LPS引起的细胞内APP表达增强,减轻LPS对细胞内NEP表达的抑制。     

点地梅提取物saxifragifolinB体外抗实体瘤活性研究

目的: 初步探讨点地梅提取物saxifragifolin B体外抗实体瘤活性及其作用机制。方法: Saxifragifolin B作用于体外培养的人肝癌细胞BEL-7402、肺癌细胞A549和胃癌细胞SGC7901。光镜下观察肿瘤细胞形态学变化;AO/EB双染法观察细胞死亡;MTT法检测细胞增殖水平,计算IC₅₀;流式细胞术检测细胞凋亡和坏死。结果: Saxifragifolin B诱导3种实体瘤细胞出现凋亡样和坏死样改变。Saxifragifolin B以浓度依赖的方式抑制肿瘤生长,作用24 h IC₅₀分别为13.13 μmol/L、9.61 μmol/L和11.64 μmol/L。Saxifragifolin B可以诱导肿瘤细胞凋亡和坏死。结论: 点地梅提取物saxifragifolin B具有抗多种实体瘤的活性,其作用机制可能与诱导细胞凋亡和促进细胞坏死有关。