同型半胱氨酸、半胱氨酸在动脉粥样硬化发病机制中作用的对照研究

目的以动脉粥样硬化(As)病灶中的主要细胞类型—血管平滑肌细胞为模型,对比研究同型半胱氨酸(Hcy)和半胱氨酸(Cys)在致As发病效应上的异同,以期为Hcy作为As独立危验因子的分子机制提供有比较的证据。方法体外培养人脐静脉血管平滑肌细胞(VSMCs),用不同浓度的Hcy和Cys作用于细胞24h后:(1)用分光光度比色法测定细胞中SOD和MDA的含量;(2)流式细胞术检测细胞凋亡率,半定量RT-PCR方法检测caspases-3 mRNA的表达;(3)MTT法测定细胞的增殖率;(4)用1000μmol/LHcy和Cys分别作用VSMCs24、48和72h后,MS-PCR法检测ERα启动子区甲基化的状态,半定量RT-PCR法检测ERα mRNA的表达。结果(1)Hcy可导致细胞内MDA、SOD呈剂量依赖性增加,Cys使MDA、SOD增加的效应远弱于Hcy(P<0.01)。(2)流式细胞术、caspases-3 mRNA的表达和MTT试验的结果显示,Hcy、Cys对血管平滑肌细胞凋亡率和增殖率的影响差异不太明显。(3)Hcy显著增加ERα基因启动区的甲基化修饰,并使ERα mRNA的表达进行性减少。Cys不影响ERα启动子区的甲基化状态,对ERα mRNA表达的影响也远小于Hcy。结论氧化应激对DNA甲基化修饰的影响可能在Hcy致As发病的机制中占据着重要的地位,这也可能是Hcy和Cys在As发病机制中作用不同的重要原因。     

5-杂氮-2'-脱氧胞苷对HL-60细胞株Galectin-1基因的表达及甲基化影响

目的 探讨5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2dC)对HL-60细胞Galectin-1基因表达的影响,并进一步分析药物处理后Galectin-1基因启动子区域甲基化状态的改变. 方法用5 μmol/L的5-aza-2dC处理HL-60细胞,采用Real-Time RT-PCR检测Galectin-1基因在药物处理与未处理组中的mRNA表达水平,甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)榆测Galectin-1基因启动子区域在药物处理与未处理HL-60细胞中的甲基化水平.结果 Real-Time RT-PCR结果显示Galectin-1在处理后的HL-60细胞中表达上调,MSP结果显示,HL-60细胞Galectin-1基因启动子区存在高甲基化,经5-aza-2dC处理后能够使Galectin-1基因去甲基化.使其甲基化水平下降. 结论启动子区域高甲基化是Galectin-1基因低表达的原因之一,5-aza-2dC能够使Galectin-1基因去甲基化,逆转Galectin-1基因的表达,5-aza-2dC可能在抗急性髓系白血病中发挥重要作用.     

5-氮杂胞苷对宫颈癌细胞FHIT基因去甲基化及抑制增殖作用

目的:探讨5-氮杂胞苷对Hela宫颈癌细胞脆性组氨酸三联基因(Fragile histidine triad gene,FHIT)启动子去甲基化作用及对其增殖的影响。方法:采用低浓度和高浓度5-氮杂胞苷作用Hela宫颈癌细胞,分别采用BSP和RT-PCR检测处理前后FHIT基因启动子甲基化状态和mRNA表达,应用MTT法检测细胞增殖改变。结果:Hela宫颈癌细胞FHIT基因启动子表现高度甲基化状态(CG位点甲基化率为80%～100%),mRNA表达完全受到抑制,细胞呈指数增殖状态;低浓度5-氮杂胞苷作用后的甲基化率显著降低(10%～40%),细胞增殖速度降低;高浓度组FHIT基因启动子甲基化状态被完全逆转,mRNA表达明显高于低浓度组,细胞增殖速度显著低于正常组和低浓度组。结论:5-氮杂胞苷可逆转Hela宫颈癌细胞FHIT基因甲基化状态,使基因恢复表达而抑制细胞增殖,去甲基化和抑制增殖作用随5-氮杂胞苷剂量增加而增加。     

PTEN异常表达及甲基化与膀胱移行细胞癌的关系

目的:探讨PTEN基因mRNA异常表达及其启动子甲基化与膀胱移行细胞癌的关系。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测膀胱移行细胞癌组织48例和正常对照15例PTEN基因mRNA的表达水平和应用甲基化特异性PCR(MSP)法检测启动子的甲基化。结果:PTEN基因mRNA在膀胱癌患者的表达在48例中有27例,而正常对照全部有表达;正常对照全部未检测到PTEN基因启动子甲基化,而膀胱癌患者启动子甲基化有23例。结论:PTEN基因mRNA表达缺失可能与启动子甲基化有关,在膀胱移行细胞癌的发生、发展及转移过程中起重要作用。     

叶酸拮抗高同型半胱氨酸血症大鼠Bcl-2基因低甲基化研究

目的探讨叶酸对蛋氨酸饮食诱导高同型半胱氨酸血症(Hhcy)大鼠主动脉组织Bcl-2基因甲基化水平影响。方法健康6周龄雄性wistar大鼠36只,体重(160±10)g,适应性喂养一周后随机分为对照组、高同型半胱氨酸组、叶酸干预组、每组12只。对照组给予AIN-93G配方饲料,高同型半胱氨酸组饲以含1.7%蛋氨酸的AIN-93G配方饲料,叶酸干预组饲以含1.7%蛋氨酸和0.008%叶酸的AIN-93G配方饲料。喂养18周后,全自动生化仪测定血浆Hcy浓度、叶酸浓度和维生素B12浓度;免疫组化检测大鼠主动脉组织Bcl-2表达;巢式降落式PCR联合甲基化特异性PCR检测Bcl-2基因启动子区甲基化水平,荧光RT-PCR检测主动脉组织Bcl-2基因mRNA表达。结果 18周蛋氨酸饮食可以诱导大鼠高同型半胱氨酸血症(P<0.01),叶酸摄入可以拮抗血浆同型半胱氨酸水平升高(P<0.01);与对照组比较,高Hcy组大鼠主动脉组织Bcl-2阳性细胞数目增加,Bcl-2基因启动子区甲基化水平降低(P<0.05),Bcl-2 mRNA表达增加(P<0.05)。叶酸干预后,主动脉组织Bcl-2阳性细胞数目减少,Bcl-2基因启动启动子区甲基化水平高于高Hcy组(P<0.05),Bcl-2 mRNA表达低于高Hcy组(P<0.05)。结论叶酸摄入可以拮抗高同型半胱氨酸血症大鼠主动脉组织Bcl-2低甲基化,使Bcl-2表达减弱,可能是其参与抗动脉粥样硬化形成的分子机制之一。     

PDGF启动子区DNA甲基化在Hcy致VSMCs增殖的作用机制研究

目的:探讨血小板源性生长因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)DNA甲基化在同型半胱氨酸((homocysteine,Hcy)致血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖的作用机制。方法:正常人脐动脉VSMCs体外培养,随机分为对照组、治疗组(Hcy100μmol/L+叶酸30μmol/L)、Hcy干预组(50、100、200、500μmol/L)总计6组,以MTT检测VSMCs的增殖率,巢式降落式PCR(nMS-PCR)法检测PDGF启动子区DNA甲基化的改变。结果:不同浓度Hcy干预的VSMCs与对照组和治疗组相比,随着Hcy浓度的增加VSMCs增殖率增加。治疗组与对照组比所有结果均无明显变化。PDGF甲基化水平增高,100μmol/L、200μmol/L Hcy组与对照组比较差异有统计学意义(P0.01和P0.05),而治疗组与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:Hcy可导致人VSMCs PDGF启动子区域甲基化异常从而促进VSMCs的增殖。     

同型半胱氨酸对肝癌细胞基因mRNA表达的影响

目的观察同型半胱氨酸(Hcy)对人肝癌细胞株-7721细胞固醇调控元件结合蛋白-1(SREBP-1)基因mRNA表达的影响。方法用反转录多聚酶联反应法(RT-PCR)不同浓度(0．2，1和5mmol／L)、不同时间(2，4，8，24h)，Hcy对7721细胞SREBP-1基因mRNA表达的影响作用。结果Hcy可使7721细胞SREBP-1基因mRNA表达上调，在Hcy浓度为5mmol／L，作用18h SREBP-1的mRNA表达相对较高。结论Hcy使7721细胞SREBP-1基因mRNA表达上调。     

5-氮-2'脱氧胞苷逆转人卵巢癌细胞系OVCAR3和Anglne中RIZ1基因的表达

目的:观察甲基转移酶抑制剂5-氮-2'脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人卵巢癌细胞系OVCAR3和Anglne RIZ1基因启动子区甲基化状态及表达的影响,探讨人卵巢癌细胞系OVCAR3和AnglneRIZ1基因失活的机制及5-Aza-CdR对RIZ1基因表达的调控。方法:用5-Aza-CdR(浓度为5μmol/L)处理体外培养的人卵巢癌细胞系OVCAR3和Anglne后,采用MSP法检测用药前后细胞中RIZl基因的甲基化状态,RT-PCR及Western-blot法检测用药前后细胞中RIZ1基因mRNA及蛋白表达的变化。结果:在人卵巢癌细胞系OVCAR3和Anglne中,RIZ1基因启动子区呈异常甲基化状态,RIZ1基因mRNA及蛋白表达缺失,经过5-Aza-CdR处理后,RIZ1基因启动子区呈非甲基化状态,其mRNA及蛋白重表达。结论:5-Aza-CdR可改变人卵巢癌细胞系OVCAR3和Anglne中RIZ1基因甲基化状态,从而调控癌细胞中RIZ1基因的表达。     

人胚肺成纤维细胞衰老过程中Foxa2启动子区CpG岛的甲基化状态

目的探讨人胚肺成纤维细胞复制性衰老及过氧化氢诱导的早衰过程中Foxa2的表达改变及其启动子区CpG岛的甲基化水平变化。方法按传代情况将人胚肺成纤维细胞分为年轻细胞[第22代细胞,即22 PDL(populationdoubling levels,群体倍增水平)]组、中年细胞(35PDL)组、复制性衰老细胞(49PDL)组和氧化应激诱导的早衰细胞(premature senescence,PS)组。用荧光定量PCR方法检测人胚肺成纤维细胞衰老过程中Foxa2的mRNA表达改变,应用甲基化特异性PCR(MSP)检测启动子区-777～-478 bp甲基化的变化情况,并用亚硫酸氢盐修饰基因组结合克隆测序检测启动子区域CpG岛的甲基化水平。结果与年轻细胞组比较,中年细胞组人胚肺成纤维细胞Foxa2 mRNA的表达水平无明显变化;而复制性衰老细胞组和早衰细胞组人胚肺成纤维细胞Foxa2的mRNA表达水平均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。早衰细胞组的启动子区具有一定的甲基化水平;年轻细胞组、复制性衰老细胞组及早衰细胞组Foxa2启动子区CpG岛的甲基化水平分别为5.7%,17.1%和43.6%。结论人胚肺成纤维细胞衰老过程中Foxa2的mRNA表达水平逐渐降低,其启动子区CpG岛甲基化水平逐渐升高,参与其表达调控。     

B-group vitamins, MTHFR C677T polymorphism and carotid intima-media thickness in clinically healthy subjects

OBJECTIVE: Plasma B-group vitamins and age may affect the carotid intima-media thickness (IMT) in subjects with different 677TT genotype of the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene. DESIGN: A hospital-based cross-study. SETTING: Genomic and Vascular Center, Changhua Christian Hospital, Changhua, Taiwan. SUBJECTS: Five hundred and forty-one clinically healthy subjects. INTERVENTION: Fasting plasma, homocysteine (Hcy), vitamin B(6), vitamin B(12), folate and B-mode carotid ultrasound. RESULTS: MTHFR genotype, plasma concentrations of folate, vitamin B(6) and vitamin B(12) and age were significantly correlated to the plasma Hcy concentration. MTHFR 677TT carriers had higher concentrations of Hcy than did subjects with the CC and CT genotypes. Age, sex, body mass index and plasma Hcy were independent contributors to increase carotid IMT. However, with stratification by mean value of age and B-group vitamins concentrations, we found that at advanced age, lower plasma folate and vitamin B(12) were three risk factors involved in the enhancing effect of the MTHFR 677TT genotype on the increase of plasma Hcy and carotid IMT. CONCLUSION: MTHFR 677TT-related carotid atherosclerosis was only identified in healthy elderly subjects with lower level of plasma folate and vitamin B(12). SPONSORSHIP: Changhua Christian Hospital.     

辐射诱发胸腺淋巴瘤c-mye基因启动子甲基化检测

目的 研究辐射诱发小鼠胸腺淋巴瘤c-mcy基因启动子CpG岛甲基化状态和mPNA表达的变化.方法 X射线照射BALB/c小鼠建立胸腺淋巴瘤模型,采用硫化测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BCP)法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测c-myc基因启动子CpG岛甲基化状态和mRNA的表达.结果 辐射诱发胸腺淋巴瘤c-myc基因启动子CpG岛与正常胸腺组织比较呈去甲基化状态,RT-PCR检测结果显示,胸腺淋巴瘤c-myc基因mPNA相对表达量(1.12±0.99)明显高于正常胸腺组织(0.89±0.08),2组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 c-myc基因启动子去甲基化可能与辐射诱发胸腺淋巴瘤密切有关.     

Frequency of hyperhomocysteinemia in hemodialysis patients with folic acid supplementation

BACKGROUND: It is known that hyperhomocystinemia is an independent risk factor for development of atherosclerosis. In end stage renal disease the frequency of hyperhomocystinemia is much greater than in normal populations. AIM: In this study homocystein (Hcy), folic acid and vitamin B12 concentrations were determined in 125 chronic renal failure patients being on folic acid supplementation (3 mg/day). In 107 patients the frequency of C667T polymorphism of methylene tetrahyrofolate reductase (MTHFR) was also determined. The relationships between these parameters were also studied. RESULTS: It was found that in these patients who are under continuous folic acid supplementation the mean level of homocysteine was 16.8 +/- 7.2 mumol/L, a value considerably lower than the homocysteine concentration reported for non-supplemented patients. The elevation of homocysteine concentrations was independent of gender, time spent in renal replacement therapy, and the type of renal replacement therapy (hemodialysis: 17.6 +/- 12.6; hemodiafiltration: 16.6 +/- 12.9 mumol/L). Data showed an inverse relation between plasma homocysteine concentrations and the concentrations of folic acid and vitamin B12. Moderately severe hyperhomocystinemia (Hcy > 20 mumol/L) was found in about 30% of patients. In those the frequency of patients for homozygous T677 allele of MTHFR was about 25-30%. However, in all ESRD patients the frequency of the homozygotes was the same then in the normal population. Homocysteine plasma levels correlated with MTHFR polymorphism: in the wild type group Hcy was 14 +/- 7 mumol/L, in the heterozygous group was 17.2 +/- 6.2 mumol/L, and in the homozygous group was 21 +/- 19 mumol/L. CONCLUSIONS: Long-term folic acid supplementation decreased the homocysteine level in end stage renal disease patients. However, in folic acid resistant group, who were in 30% homozygotes for C667T of MTHFR (suggesting that homocysteine-methionine remethylation cycle is disturbed), instead of the administration of folic acid, methylene tetrahydrofolate supplementation might be considered.     

西藏阿里西部区域高血压与同型半胱氨酸和脑卒中风险基因的关系

目的 对西藏阿里西部区域高血压与同型半胱氨酸(Hcy)和脑卒中风险基因的关系进行分析,为更加合理地制定卫生政策、规划卫生资源提供科学的依据,有效提高西部藏族群众的健康状况。方法 分层整群随机抽样。采用“青藏高原慢性病防治”调查问卷对调查对象进行面对面调查,并进行Hcy检查和脑卒中风险基因(MTHFR基因)位点筛查。结果 高血压患病率为18.5%。Hcy中度升高者患高血压的风险是Hcy正常者的2.39倍(95%CI=1.44～3.94,P =0.001)。MTHFR A1298C 中AC基因型的患病率是AA的1.39倍(95%CI=1.05～1.85,P =0.023); MTHFR C677T和 MTHFR A1298C联合分析,CC+AC/CC和CT/TT+AC/CC两种联合方式增加了患高血压的风险(P =0.042,OR=1.47,95%CI=1.02～2.12; P =0.015,OR=1.78,95%CI=1.12～2.85)。Hcy升高合并基因突变组的高血压患病率高于Hcy正常组,差异有统计学意义(P <0.005)。结论 西藏阿里西部区域居民血浆Hcy浓度是高血压患病的影响因素; 不同基因型的联合影响高血压患病; Hcy升高与基因突变型联合显著增加了居民患高血压的风险。     

孕妇血浆同型半胱氨酸水平及影响因素分析

目的 了解孕妇孕期Hcy水平及变化趋势，探讨孕期Hcy水平的影响因素。方法 选择2019年4月-6月在成都市双流区妇幼保健院参加孕期检查并计划在该院分娩的266名孕妇为研究对象，前瞻性随访至生产。通过问卷调查收集相关信息，实验室检测孕早、中、晚血清叶酸和血浆Hcy浓度，以及孕妇MTHFR基因rs1801133和rs1801131位点基因型，采用混合效应模型分析Hcy水平的影响因素。结果 研究对象平均年龄(27.70±3.68)岁，孕妇早、中、晚期血清叶酸中位数分别为20.85、15.30和13.07nmol/L，血浆Hcy平均值分别为6.73、5.35和5.40μmol/L，Hcy水平在孕中期下降后基本保持不变。混合效应模型结果表明，孕妇孕中、晚期Hcy浓度低于孕早期水平，MTHFR rs1801133位点基因型为CT和TT的孕妇相较CC型孕妇Hcy水平更高,叶酸制剂补充周长越久的孕妇Hcy水平更低。结论 应重点关注MTHFR rs1801133基因突变的孕妇，适当延长叶酸制剂补充时长和增大补充剂量以降低孕期Hcy水平。     

孕期环境危险因素以及母亲MTHFR677C→T、血浆Hcy与儿童先天性心脏病的关系

目的:分析儿童不分型先天性心脏病(CHD)致病的危险因素,探讨CHD与母亲亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)677C→T和血浆同型半胱氨酸(Hcy)的相关性。方法:采用病例对照研究方法,分析80对CHD患儿与对照儿父母所处的环境因素并检测其MTHFR677位点的多态性和血浆Hcy的水平,进行单因素及多因素Logistic回归分析。并且通过母子配对,分析MTHFR677位点多态性和血浆Hcy水平与CHD发生的相互关联。结果:①母孕早期发烧(OR=4.465)、孕期居住乡村(OR=2.234)、孕期吸烟环境(OR=20.529)、母子血浆Hcy水平增高(OR=3.342,OR=3.069)为不分型CHD的危险因素。②儿童与母亲MTHFR677位点基因型之间没有明显的关联,双方血浆Hcy水平亦无明显关联(P均>0.05)。③病例组与对照组MTHFR677位点基因型差异无统计学意义(P>0.05),病例组母子血浆Hcy水平均显著高于对照组相应值(P均<0.01)。结论:①母孕早期发烧、孕期居住乡村、孕期吸烟环境、母子血浆Hcy水平增高为不分型CHD的危险因素。②MTHFR基因677C→T对血浆Hcy水平影响有待于进一步研究。③在CHD发生上,母子MTHFR基因677位点基因型之间和血浆Hcy水平之间均没有相关性。