硫代修饰型反义寡核苷酸抑制肺癌细胞系端粒酶活性及增殖的研究

了解人肺癌细胞系的端粒酶活性情况。探讨硫代修饰型端粒酶ＲＮＡ反义寡核苷酸封阻端粒酶ＲＮＡ,对癌细胞代谢,生长的抑制作用。方法采用端粒酶ＰＣＲ ＥＬＩＳＡ方法检测８种体外培养从肺癌细胞系端粒酶活性。合成端粒酶ＲＮＡ的反义硫代寡核苷酸（６聚体、９聚体、１２聚体）和随机序列寡核苷酸,分别导入ＬＴＥＰ－ａ－２细胞系,作用７２ｈ。采用端粒酶ＰＣＲ ＥＬＩＳＡ方法检测端粒酶活性,四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）光吸收     

表达反义Ki－ras的逆转录病毒载体对人胰腺癌细胞恶性表型的影响

用重组逆转录病毒载体构建能表达反义Ｋｉ－ｒａｓ癌基因ＲＮＡ的重组体，经磷酸钙沉淀法导入病毒包装细胞ＰＡ３１７中。ＲＮＡ杂交分析表明，转化包装细胞系中有重组病毒载体的表达。利用转化包装细胞分泌的病毒上清液感染人胰腺癌细胞系ＰＣ－２细胞，经Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ筛选得到稳定的转化细胞系。ＲＮＡ杂交证实转化的胰腺癌细胞中有病毒高度表达，靶基因表达明显减弱。反义Ｋｉ－ｒａｓＲＮＡ使人胰腺癌细胞生长速率下降约６５％。￣３Ｈ胸腺嘧啶掺入、软琼脂集落形成能力以及裸鼠致瘤能力等均显著下降。这一结果表明，反义Ｋｉ－ｒａｓ逆转录病毒载体能有效地抑制靶基因的表达，使胰腺癌细胞恶性表型部分逆转。     

反义RNA抑制肝癌细胞株端粒酶活性与p16、p21表达的关系

目的：观察反义端粒酶ＲＮＡ对ＳＭＭＣ７２２１细胞的作用,并检测ｐ１６、ｐ２１的表达情况,探讨端粒酶在肝癌发生过程中的可能作用及反义端粒酶ＲＮＡ在肝癌治疗中的意义。方法：经脂质体介导的方法将ｐＢＢＳ２１２－ｈＴＲ（反义端粒酶ＲＮＡ真核表达载体）导入ＳＭＭＣ７７２１细胞中,细胞克隆转移扩大培养后,采用流式细胞仪、ＴＲＡＰ－ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ、电镜、免疫组化技术结合图像分析,在检测ＳＭＭＣ７７２１／ｐＢ     

人乳头瘤病毒16型E6E7反义RNA抑制宫颈癌细胞恶性表型的作用

目的研究癌基因的特异性反义ＲＮＡ对癌细胞生长繁殖和恶性程度的影响。方法用逆转录病毒载体将人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）－１６Ｅ６Ｅ７反义ＲＮＡ导入ＨＰＶ－１６ＤＮＡ阳性的宫颈癌细胞株ＣａＳｋｉ中，观察该细胞在导入反义ＲＮＡ后其表型特征和在裸鼠体内致癌能力的变化。结果ＨＰＶ－１６Ｅ６Ｅ７反义ＲＮＡ能降低宫颈癌细胞ＣａＳｋｉ的生长速率，抑制其在软琼脂上的集落形成能力，并能明显地抑制其在裸鼠体内的致癌能力。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析发现ＨＰＶ－１６Ｅ６Ｅ７反义ＲＮＡ能使宫颈癌细胞中病毒ＨＰＶ－１６Ｅ６基因的表达水平降低。结论ＨＰＶ－１６Ｅ６Ｅ７反义ＲＮＡ能使宫颈癌细胞ＣａＳｋｉ恶性表型逆转；由其引起的癌细胞中ＨＰＶ－１６癌基因表达水平的降低可能是癌细胞表型逆转的原因之所在；ＨＰＶ－１６癌基因的表达水平对维持癌细胞的恶性表型起着重要作用。     

BCL—2基因表达与乳腺癌抗凋亡及免疫耐受的关系

目的 观察乳腺癌细胞株ＢＣＬ－２基因表达与其耐受肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ）免疫攻击的关系,探索应用ＢＣＬ－２硫代反义寡核苷酸（ＢＣＬ－２ＳＯＮ）治疗乳腺癌的途径。方法 ＢＣＬ－２硫代反义寡核苷酸处理乳腺癌细胞株ＭＣＦ－７,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法观察其对ＢＣＬ－２表达的抑制;并将ＭＣＦ－７细胞与乳腺标本分离出来的ＴＩＬ共同培养,通过ＪＡＭ试验观察ＴＩＬ诱导ＭＣＦ－７细胞凋亡的情况。结果 ＢＣＬ－２ＳＯＮ处理的ＭＣＦ－７细胞无ＢＣＬ－２表达,并在ＪＡＭ试验中随着ＴＩＬ浓度增加,凋亡细胞也增加,未经处理的对照组可见ＢＣＬ－２表达,ＪＡＭ试验中随着ＴＩＬ浓度增加,凋亡细胞的量无明显变化。结论 ＢＣＬ－２表达的乳腺癌细胞可对抗肿瘤浸润淋巴细胞的免疫攻击,ＢＣＬ－２ＳＯＮ可作为治疗乳腺癌的新途径。     

反义端粒酶RNA对SMMC7721细胞P16、P21表达的增强作用

目的 观察反义端粒酶RNA对SMMC7721细胞周期的影响,检测P16和P21的表达,探讨端粒酶与细胞期调控间的关系及反义端粒酶RNA在肝癌基因治疗中的意义。方法 经脂质体介导,将反义端粒RNA真核表达载体pBBS212－hTR导入SMMC7721细胞中。细胞克隆转移扩大培养后,采用流式细胞仪、TRAP－PCR－ELISA及免疫组化技术,结合图像分析,在检测SMMC7721／pBBS212－hTR细胞端粒酶活性的同时,检测P16和P21的表达。结果 与对照组相比较,反义端粒酶RNA在抑制SMMC7721／pBBS212－hTR细胞端粒酶活性的同时,检测P16和P21的表达。结果 与对照组相比较,反义端粒酶RNA在抑制SMMC7721细胞端粒酶活性的同时,P16和P21蛋白的表达水平显著增高。结论 转染反义端粒酶RNA在封闭细胞端粒活性表达的同时,伴发P21与P16表达水平的升高。本实验研究为探讨肝癌发病机制及治疗提供了一定的依据。     

人乳头瘤病毒16型E6E7反义RNA抑制宫颈癌细胞恶性？…

目的 研究癌基因的特异性反义ＲＮＡ对癌细胞生长繁殖和恶性程度的影响。方法 用逆转录病毒载体将人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）－６Ｅ６Ｅ７反义ＲＮＡ导入ＨＰＶ－１６ＤＮＡ阳性的宫颈癌细胞株ＣａＳｋｉ中，观察该细胞在导入反义ＲＮＡ后其表型特征和在裸鼠体内致癌能力的变化。结果 ＨＰＶ－１６ Ｅ６Ｅ７反义ＲＮＡ能降低宫颈癌细胞ＣａＳｋｉ的生长速率，抑制其在软琼脂上的集落形成能力，并能明显地抑制其在裸鼠体内的致癌能力     

细胞周期蛋白E对乳腺癌细胞MCF-7生长及周期相关基因的影响

观察细胞周期蛋白（ｃｙｃｌｉｎ）Ｅ的表达对乳腺癌细胞ＭＣＦ－７生长及其他周期相关基因的影响。方法构建正义和反义ｃｙｃｌｉｎ Ｅ ｃＤＮＡ真核表达载体,并采用ｌｉｐｏｆｅｃｔ ＡＭＩＮＥ转染,将其导入ＭＣＦ－７细胞,获得稳定表达正义及反义ｃｙｃｌｉｎＥ的细胞系,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测有外源性片片段的插入及表达,并作细胞生长曲线、四甲偶氮唑盐（ＭＴＴ）法和流式细胞计数分析;用     

端粒及端粒酶研究的新进展

端粒是染色体末端高度保守的重复核苷酸序列，对染色体具有保护作用，随着细胞分裂的不断进行，端粒逐渐缩短，减少到一定程度，细胞就趋向衰亡，被认为是细胞有丝分裂的“生物钟”。端粒酶是影响端粒长度的主要因素，以其ＲＮＡ为模板，向端粒末端添加（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ序列，使端粒延长，从而延长细胞的寿命甚至使其永生。端粒酶的功能区主要在ｈＴＲ的４４－２０３核苷酸区，３ｐ和１０ｐ上存在着编码调整端粒酶的基因，Ｅｓｔｌ可能是端粒末端结合蛋白，是端粒酶的识别位点。正常情况下，此酶活性较低或无活性，但在干细胞、永生型细胞或肿瘤细胞此酶活性较强。端粒酶的活性主要与细胞分裂速度、细胞周期因素及细胞分化程度有关，细胞分化程度低、细胞增生活跃及肿瘤细胞在Ｓ期时活性较高。在恶性肿瘤中端粒酶活性较高，但在良性肿瘤和非肿瘤中活性较低，因而可利用ＴＲＡＰ技术对端粒酶活性进行检测来进行肿瘤诊断及良恶性鉴别。同时可利用端粒酶抑制剂能抑制端粒酶的活性，缩短端粒，使恶化细胞良转，达到治疗肿瘤的作用，而且还可利用检测端粒酶作为治疗效果好坏的指标。     

1,25-二羟基维生素D3协同转染反义端粒酶RNA诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的观察在抑制肝癌细胞端粒酶活性表达情况下,1,25-二羟基维生素D3(1,25-VD3)对肝癌细胞凋亡的影响。方法经脂质体介导,将反义端粒酶RNA真核表达载体pBBS212/hTR导入维生素D3受体(VDR)阳性的肝癌细胞株SMMC7721细胞中培养。细胞克隆转移扩大培养,将其分为对照组、药物组、转染组和转染药物组。添加1,25-VD3,分别作用于转染药物组、药物组,用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)和电子显微镜检测肝癌细胞凋亡。结果转染组和对照组细胞的端粒酶活性分别为0.686和1.685,说明反义端粒酶RNA可显著降低肝癌细胞端粒酶活性。对照组、药物组、转染组和转染药物组细胞凋亡率分别为3.4%、12.2%、8.8%、23.6%;差异有显著统计学意义(P<0.01)。超微结构检查也证实存在凋亡发生。1,25-VD3或转染反义端粒酶RNA对肝癌细胞有促细胞凋亡作用,两者协同对肝癌细胞凋亡作用显著增强。结论转染反义端粒酶RNA,可降低肝癌细胞端粒酶活性,可显著增强1,25-VD3对肝癌细胞的促凋亡作用,并且对细胞的增殖也存在明显的抑制作用。     

端粒酶反义核酸对乳腺癌细胞生长的抑制作用

为了探讨针对人类端粒酶RNA（hTR）基因的反义寡核苷酸（AS－ODN）对乳腺癌细胞系MCF－7的影响，将AS－OND作用于细胞。进行细胞计数，MTT比色法测细胞生长抑制率，PCR－ELISA法测端粒酶活性，流式细胞仪测细胞周期与凋亡。结果表明该AS－ODN能抑制MCF－7细胞生长，降低端粒酶活性并诱导细胞凋亡。针对hTR的AS－ODN对治疗恶性肿瘤有潜在意义。     

反义人端粒酶RNA对胃癌细胞生长的抑制效应

目的 探讨反义人端粒酶ＲＮＡ（ｈＴＲ）对胃癌细胞的生长抑制作用。方法 将反义ｈＴＲ真核表达载体经脂质体介导转染入胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１,体外培养及接种裸鼠观察其基因转染细胞的细胞周期、超微结构变化、生长速率及致瘤性。结果 反义ｈＴＲ在潮霉素筛选的阳性克隆中稳定表达,正义ｈＴＲ表达下调,并出现凋亡改变。基因转染细胞体外传代培养的生长速率大多减慢,在裸鼠皮下的致瘤性明显降低。荷瘤鼠存活时间延长。结论     

反义端粒酶基因表达抑制人癌细胞恶性表型

目的 观察端粒酶基因ｈＴＲＴ,ｈＴＲ反义表达对癌细胞生物学行为的影响,探讨改变端粒酶基因表达在肿瘤治疗中的作用。方法 通过反义ｈＴＲＴ基因转染人ＨｅＬａ细胞系,反义ｈＴＲ寡核苷酸处理人肺巨细胞癌系ＰＧ,观察其对肿瘤细胞生长及恶性表型的影响。     

Dyskerin expression influences the level of ribosomal RNA pseudo-uridylation and telomerase RNA component in human breast cancer

Dyskerin is a nucleolar protein, altered in dyskeratosis congenita, which carries out two separate functions, both fundamental for proliferating cells. One function is the pseudo-uridylation of ribosomal RNA (rRNA) molecules, necessary for their processing, and the other is the stabilization of the telomerase RNA component, necessary for telomerase activity. A significant feature of dyskeratosis congenita is an increased susceptibility to cancer; so far, however, no data have been reported on dyskerin changes in human tumours. Therefore, in this study, the distribution of dyskerin in a large series of human tumours from the lung, breast, and colon, as well as from B-cell lymphomas, was analysed by immunohistochemistry. Dyskerin proved never to be lost or delocalized outside the nucleolus. A quantitative analysis of dyskerin mRNA expression was then performed in 70 breast carcinomas together with the evaluation of telomerase RNA component levels and rRNA pseudo-uridylation. Dyskerin mRNA levels were highly variable and directly associated with both telomerase RNA component levels and rRNA pseudo-uridylation. Dyskerin gene silencing in the MCF-7 human breast carcinoma cell line reduced telomerase activity and rRNA pseudo-uridylation. Significantly, patients with low dyskerin expression were characterized by a better clinical outcome than those with a high dyskerin level. These data indicate that dyskerin is not lost in human cancers and that the levels of its expression and function are associated with tumour progression.     

反义hTERT基因对白血病细胞端粒酶表达及活性的抑制作用

目的探讨反义hTERT基因体外对白血病细胞端粒酶基因表达及其活性的抑制作用。方法采用基因重组技术设计并构建了针对端粒酶活性蛋白催化亚单位mRNA的5’端序列的反义pcDNA-hTERT真核表达载体,通过SuperFect(QIAGEN)将其瞬时转染人早幼粒白血病细胞株Hk及人红白血病细胞株K562,并运用流式细胞术测定其细胞凋亡与细胞周期的变化,同时运用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法对其端粒酶蛋白催化亚单位基因的表达水平进行了检测,端粒酶活性的检测则采用了非放射性TRAP-银染法。结果成功地构建了反义pcDNA-hTERT真核表达载体,并将其转染至K562和HL60白血病细胞株。结果与空载体组、空白组相比,反义pcDNA-hTERT组体外显示出明显有效地抑制端粒酶的基因表达及其活性的作用;在细胞凋亡与细胞周期方面,反义组能引起细胞周期左移,增殖分裂能力降低,同时伴有细胞凋亡数的增加。结论研究构建的反义hTERT基因体外确实能明显有效地下调白血病细胞端粒酶的基因表达及其活性,在抗肿瘤基因治疗中具有特异的靶向性和潜在应用的广谱性。     

下调血管内皮生长因子-C基因表达对乳腺癌MCF-7细胞侵袭抑制作用的研究

目的 探讨下调乳腺癌MCF-7细胞中血管内皮生长因子(VEGF)-C基因的表达后对乳腺癌细胞侵袭能力的影响.方法 脂质体介导重组质粒pSIREN-VEGF-C转染乳腺癌MCF-7细胞株.荧光定量PCR及Western印迹检测转染后对乳腺癌MCF-7细胞VEGF-C mRNA和蛋白质水平的影响.Transwell体外侵袭实验检测转染前后乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力.RT-PCR检测转染前后乳腺癌MCF-7细胞中MMP-2、-9 mRNA表达变化.结果 转染后获得稳定表达的细胞株.转染后的乳腺癌MCF-7细胞VEGF-C mRNA及蛋白表达均明显下调,抑制率分别为95%及100%(P<0.05).Transwell体外侵袭实验显示,转染后重组质粒组与阴性质粒相比,穿膜数明显减少(29.0±1.9比59.0±2.1,P<0.05).RT-PCR显示,转染后乳腺癌细胞的MMP-2、-9 mRNA表达均明显受抑制,抑制率分别为55%、75%(P<0.05).结论 下调VEGF-C表达对乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力有显著抑制作用.     

hTERT基因反义核酸对Raji细胞端粒酶活性的影响

目的:观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASODN)对Raji细胞端粒酶活性的影响。方法: 端粒酶聚合酶链反应-酶联免疫测定法检测Raji细胞的端粒酶活性；采用逆转录-聚合酶链反应方法检测hTERT基因mRNA的表达水平；以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达含量的变化。结果:hTERTASODN作用于Raji细胞后，hTERTmRNA表达水平明显降低，ASODN与Raji细胞共同孵育48h，hTERT蛋白表达阳性率降为50.15%±3.49%，72hhTERT蛋白表达阳性率降为33.35%±2.75%。而hTERT正义核酸作用24、48、72h对hTERT蛋白表达阳性率(65%)无显著影响(P＞0.05)。hTERT基因ASODN作用于Raji细胞48h，其端粒酶活性明显降低，作用72h，端粒酶活性明显受到抑制，分别与正义寡核苷酸组、空白对照组相比有显著差异(P＜0.05)。结论:hTERT基因反义寡核苷酸特异性地抑制Raji细胞的端粒酶活性。