胚胎干细胞诱导生成的胰岛素分泌细胞的超微结构研究

我们对体外诱导生成的胰岛素分泌细胞的超微结构进行了研究,并将其与在体胰岛素分泌细胞的结构加以比较,以期为诱导生成胰岛素分泌细胞的成功提供证据。     

小鼠胚胎干细胞培养条件的探索

目的: 探讨小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的培养特点及生物学特性,为ES细胞的应用研究奠定基础.方法: 小鼠胚胎成纤维细胞原代培养,3～5代的细胞作为饲养层细胞培养ES细胞.另在无饲养层细胞、明胶包被培养皿、培养液中含白血病抑制因子条件下培养小鼠ES细胞,观察2种情况下ES细胞的生长情况.结果: 小鼠胚胎成纤维细胞呈放射状或旋涡状走行,ES细胞在2种条件下均能呈克隆状生长,且保持未分化状态,碱性磷酸酶(AKP)染色呈阳性.结论: 2种条件下ES细胞均能良好生长.     

AANAT基因工程化ES细胞减少APP高表达PC12细胞Aβ的分泌

目的 构建AANAT基因工程化的胚胎干细胞，并探讨其在阿尔茨海默氏病治疗中的可能作用。方法 将外源性neo基因转染人胚胎成纤维细胞，作为饲养层细胞用于ES细胞转基因后筛选及增殖过程的培养。将pBK-CMV/AANAT真核表面质粒转染小鼠胚胎干细胞，用RT－PCR方法筛选阳性细胞克隆，用此工程细胞的条件培养液培养APP过量表达的PC12细胞，观察β淀粉样蛋白分泌情况。结果 （1）转入neo基因的人胚胎成纤维细胞能很好维持ES2细胞的未分化。（2）AANAT基因工程培养液能减少β淀粉样蛋白的分泌。（3）褪黑素能使PC12／APP细胞Aβ分泌明显减少。结论 首次构建AANAT基因工程化的胚胎干细胞，其减少Aβ分泌的作用可能在阿尔茨海默病的治疗中具有重要应用价值。     

微波治疗后坏死肿瘤组织致敏的树突状细胞介导肿瘤免疫治疗

目的 探讨微波凝固治疗（MCT）后坏死肿瘤组织能否致敏树突状细胞（DC）,致敏DC是否具有特异性抗肿瘤作用。方法 对BALB／c小鼠皮下肿瘤结节进行MCT治疗后,取出坏死的组织碎块研磨过滤,滤液与体外培养的小鼠骨髓来源的DC共同孵育获得致敏DC。观察DC的形态并检测其表型。3↑H-TdR掺人法测定DC刺激T细胞反应性增殖和^51Cr释放测定法检测DC诱导特异性CTL的细胞毒作用,以及体内对小鼠皮下肿瘤的抑制情况。最后再检测致敏DC治疗后的荷瘤鼠脾细胞悬液提取的T细胞在体内外的杀伤特异性。结果 与MCT治疗后坏死CT-26肿瘤组织滤液共同培养的DC具有典型的致敏DC形态特征和表型。致敏DC和未致敏DC诱导T细胞增殖强度在不同DC／T比下分别为：DC／T比1510时,80±10 vs 10±5;DC／T比1：20时,58±7 vs 9±4,两两比较差异均有统计学意义（均P〈0．01）。致敏DC和未致敏DC诱导的CTL在不同E／T比下对CT-26肿瘤细胞杀伤率分别为：E／T比10时,13．6±2．5 vs 1．1±0．4;E／T比20时,27．5±4．4 vs 1．4±0．4;E／T比50时,51．2±8．1 vs 1．4±0．5,两两比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。二者诱导的CTL在不同E／T比下对MIP／NIM淋巴瘤细胞杀伤率分别为：E／T比10时,2．61±0．64 vs 0．87 ±0．15;E／T比20时,5．22±0．65VS2．18±0．41;E／T比50时,6．09 ± 0．83 vs 3．91±0．51,两两比较差异均无统计学意义（均P〉0．01）。体内实验,皮下移植瘤大小在致敏DC组、未致敏DC组和生理盐水对照组间随小鼠存活时间延长越来越明显,至40d时3组肿瘤平均重量分别为4．5g±1．1g,6．9g±1．6g,9．0g±1．5g,组间差异有统计学意义（均P〈0．01）。致敏DC治疗后的荷瘤鼠脾细胞悬液内T细胞在体内外也均显示了对CT-26肿瘤的杀伤作用。结论 作为一种全细胞抗原,MCT治疗后的肿瘤坏死组织能够致敏DC,致敏DC在体内外均具有明显的特异性抗小鼠CT-26肿瘤作用。     

bFGF对小鼠ES细胞生长增殖的影响

[目的]研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对ES细胞增殖的影响,为建立稳定的小鼠ES细胞培养和扩增打下基础.[方法]将E14小鼠胚胎干细胞分别培养于含LIF106U/L并含5μg/L、10μg/L、20μg/L3种浓度的bFGF的ES细胞基础培养液中,观察细胞形态和计数ES细胞克隆数.[结果]10μg/L和20μg/L bFGF与含LIF 106U/L的ES细胞形态相似,3 d后ES细胞克隆数分别为88±8、128±12和114±17,三者克隆数无显著差异(P＞0.05).ES细胞组化染色呈AKP和SSEA-1阳性.[结论]bFGF可促进小鼠ES细胞增殖,其最佳浓度为10 μg/L.     

BALB/cj小鼠胚胎干细胞系的建立及其嵌合体小鼠的产生

198 1年Ｅｖａｎｓ和Ｋａｕｆｍａｎ首次报道小鼠ＥＳ细胞系建立以来 ,由于ＥＳ细胞具有体外不断扩增、未分化状态和全能分化 3大特点 ,故ＥＳ细胞被广泛应用于基因同源重组 ,转基因动物产生、与生长、分化相关基因功能及调控的研究。应用之广涉及发育生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、药理学、毒理学等各个学科。尤其是在美国Ｗｉｓｃｏｓｉｎ大学ＪａｍｅｓＴｈｏｍｓｏｎ 1998年建立人胚胎干细胞系以来 ,更是成为当前生命科学的热门。胚胎干细胞建立及其嵌合体产生是一项与克隆技术相当的极其复杂的技术。我国开展胚胎干细胞分离培养技术…     

胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的实验研究进展

1型和部分2型糖尿病患者必须补充胰岛素 ,但外源性胰岛素注射治疗易产生血糖波动 ,发生低血糖等严重并发症 ,而且依从性差。胰岛细胞移植有望重建内源性胰岛素分泌系统 ,根据机体需要稳定血糖水平 ,具有安全、方便等优点。但目前人类胰岛移植的成功率比较低 ,胰岛细胞来源匮乏和移植免疫排斥两大难题是目前胰岛移植失败的主要原因 [1]。诱导胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的实验研究有望为临床移植治疗糖尿病提供崭新的供体细胞获取方法。本文将对此方面进展作一概述。胚胎干细胞是一种从囊胚内层细胞团或胚胎生殖嵴分离出来的全能干细胞 ,…     

静注免疫球蛋白对病毒性心肌炎小鼠的疗效及机理研究

目的:探讨静注免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)对病毒性心肌炎的疗效及其机理。方法:320只5周龄雄性BALB/c小鼠随机分为8组,感染组腹腔接种柯萨奇B3病毒(CVB3)制成心肌炎动物模型,在接种病毒后3、7 d分别腹腔注射IVIG(500 mg/kg.d-1)5 d和10 d,流式细胞仪定量检测心肌细胞凋亡率和坏死率,与心肌病理组织学积分和病毒滴度进行相关分析,并与中药黄芪疗效对比。结果:静注免疫球蛋白治疗组小鼠心肌内病毒滴度、心肌病理积分和心肌细胞凋亡率与坏死率明显低于病毒对照组和黄芪治疗组,以早期(感染后3 d)长程(10 d)治疗组效果最好。结论:静注免疫球蛋白通过抑制柯萨奇B3病毒,降低心肌细胞凋亡率和坏死率对病毒性心肌炎发挥疗效,其疗效高于传统中药黄芪。     

干细胞来源的胰岛素分泌细胞的研究进展

Ⅰ型糖尿病是由于胰岛β细胞被自身免疫系统攻击、破坏,不能正常释放胰岛素,导致血糖升高.患者需终生注射胰岛素,由于给药过程缺乏理想的血糖感应系统,常导致糖尿病大血管病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、神经病变及糖尿病足等慢性并发症的发生,是糖尿病死亡的主要原因[1].为了有效控制血糖,防止糖尿病并发症的发生,提高糖尿病患者的生存质量,目前主要采用两种治疗策略来改进胰岛素的治疗,一是胰岛素输入方式的改进:临床上广泛应用的胰岛素泵就是通过24 h不停地向患者体内输入微量胰岛素,模拟正常胰岛素分泌模式,控制血糖水平,减少并发症的发生.其次是寻找方法替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞,包括胰腺或胰岛移植、对非β细胞进行基因修饰以及对干细胞的诱导分化.70年代初,Lacy等成功地证明了移植胰岛细胞能够改善糖尿病大鼠的高血糖状态,胰岛细胞移植开始蓬勃开展起来.     

肺腺癌细胞系A549肿瘤始发细胞的测定

目的通过克隆形成及致瘤能力研究肺腺癌细胞系A549肿瘤始发细胞的比例。方法采用有限稀释法,检测细胞单克隆形成的数量及大小;收集来自于1个细胞形成的克隆细胞,种于BALB/C裸鼠皮下,观察其致瘤能力;采用CD133磁珠分选A549细胞,测定CD133+、CD133-细胞的克隆形成能力,测定Hoechst33342染色对非SP细胞的增殖能力和单克隆形成能力的影响。结果45%以上的A549细胞能够形成大于100个细胞的大克隆,其传代后又能形成新的克隆,来源于1个大克隆的细胞种植到BALB/C裸鼠身上,10?d左右能形成肉眼可见的肿瘤;CD133+、CD133-细胞克隆形成能力相同;Hoechst33342染色能够明显干预细胞的克隆形成及增殖能力。结论45%以上的A549细胞是肿瘤始发细胞。     

胰腺干细胞与胰岛混合培养对其转化率的影响

目的  研究胰腺干细胞与胰岛混合培养对增加胎鼠胰腺干细胞向β前体细胞转化率的作用及机制。 方法  实验分为胰腺导管干细胞单独培养组（Ⅰ组）,胰岛单独培养组（Ⅱ组）及干细胞-胰岛混合培养组（Ⅲ组）。V型胶原酶消化大鼠胰腺获得胰岛后,使用Ficoll-400梯度离心法纯化胰岛;采用胶原酶消化法获得胎鼠胰腺干细胞进行培养,通过RT-PCR及免疫组织化学染色的方法,检测细胞角蛋白-19（CK 19）、巢蛋白（Nestin）、胰高血糖素和胰岛素等干细胞相关标志物。干细胞诱导培养基中加入纯化的胰岛进行混合培养,通过观察干细胞表达胰岛素的阳性率评价其诱导转化率。结果  V型胶原酶逆行胰管灌注继而Ficoll 400梯度离心可获得生物活性良好的胰岛;所培养的干细胞表达CK-19、Nestin、胰高血糖素,诱导后部分表达胰岛素。干细胞-胰岛混合培养组及干细胞单独培养组诱导后,细胞胰岛素阳性率分别为38.2%和23.9%,差异有统计学意义(P<0.05);CK-19阳性率分别为89.3%和81.6%,其差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论  胰腺导管干细胞与胰岛混合培养可提高胰腺导管干细胞向β前体细胞的转化率,其作用与CK-19的表达密切相关。     

单细胞克隆小鼠胚胎干细胞系的建立

目的:建立胚胎干细胞的培养系统及培养方法.方法:用免疫溶解法(immunosurgery)分离3.5 d的129SvJ系小鼠囊胚内细胞团,在γ射线照射的胎鼠成纤维细胞饲养层上培养,胰酶消化传代.用组织化学法、免疫组织化学方法识别细胞表面标志,常规G带法行染色体核型分析,在体、离体分别观察细胞的多向分化能力.结果:得到一个单细胞克隆129系小鼠胚胎干细胞系G11能长期稳定增殖不分化,具有正常40XY核型,碱性磷酸酶阳性、SSEA-1阳性,在体和离体条件下可分化为多种细胞.结论:以小鼠为模型成功建立了哺乳动物胚胎干细胞的培养方法和培养系统.     

胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨胚胎干细胞（ＥＳ）向神经细胞定向分化发育的可能性。方法 ＥＳ－Ｄ３在无小鼠白血病抑制因子（ｍＬＩＦ）存在的条件下培养ＥＳ细胞４ｄ,形成ＥＳ集落（即胚胎样小体）,经胰酶消化打散后种植于粘附性培养皿上。结果 上述细胞表达ＭＡＰ－２和ＧＦＡＰ蛋白。ＲＴ－ＰＣＲ分析进一步证明这些细胞能表达γ－氨基丁酸（ＧＡＢＡ）γ亚单位和酷氨酸羟化酶以及脑因子－１神经相关基因。结论 ＥＳ细胞在体外能有效地被诱导成具有多种神经元特性的神经样细胞,可为神经移植提供源源不断的材料。     

小鼠骨髓树突状细胞的诱导培养及抗CT-26肿瘤细胞的研究

目的：研究小鼠骨髓树突状细胞的诱导培养及其抗肿瘤特性。方法：用重组的鼠粒-巨噬细胞刺激因子(GM—CSF)及白细胞介素4(IL-4)从小鼠骨髓干细胞中诱导培养树突状细胞(DC),用流式细胞仪检测DC表型。肿瘤细胞CT-26冻融液负载DC后,治疗荷瘤BALB／c小鼠,测定DC抑瘤、消瘤作用及小鼠的生存期变化。结果：诱导的DC形态典型,表面高表达CD80、CD86、I—A^d等免疫分子。抗原负载的DC能明显抑制早期肿瘤的生长,治疗组与非治疗组生存期差异有统计学意义。结论：树突状细胞早期应用具有明显抗CT-26肿瘤细胞作用,可延长荷瘤小鼠的生存期。     

无机纳米晶体发光颗粒-量子点对小鼠骨髓造血细胞的标记成像

目的：观察新型发光纳米材料—无机纳米晶体颗粒量子点对小鼠骨髓造血细胞的标记和成像,探讨它在血液细胞分化发育研究中的作用。方法：采用最大发射波长为550nm的绿色量子点转铁蛋白复合物分别在体外和体内对小鼠骨髓造血细胞进行标记研究,并观察量子点转铁蛋白复合物对骨髓造血干细胞CFU-GM的影响。结果：量子点转铁蛋白复合物可标记骨髓中大部分造血细胞,而且荧光强度强,光学和化学稳定性好,对骨髓造血干细胞的增殖分化功能无影响。结论：量子点在血液细胞成像方面表现了优良的特性,在细胞生物学研究中具有重要作用。     

尘螨Ⅱ类改组变应原对哮喘小鼠免疫治疗的效果

目的 探讨以改组尘螨Ⅱ类变应原基因Der f2和Der p2后表达的蛋白为变应原,对小鼠哮喘模型的特异性免疫治疗效果。方法 随机将160只清洁级BALB/c小鼠分为PBS组（阴性对照组）,Der f2和Der p2免疫治疗组（阳性对照组）,哮喘组,改组变应原免疫治疗M01、M03、M08、M10蛋白治疗组。用尘螨提取液于0、7、14d腹腔注射致敏激发BALB/c小鼠,第21天雾化吸入激发,连续7d,其中各免疫治疗组于第25～27天雾化前30min分别用Der f2、Der p2和改组变应原进行特异性免疫治疗,PBS组则用PBS进行腹腔注射和雾化吸入。最后1次雾化24h后,引颈处死。分别观察肺组织病理变化、支气管肺泡灌洗液（BLAF）白细胞计数,酶联免疫吸附试验（ELISA）测定BLAF和脾细胞培养上清液细胞因子IL-4、IL-17和IFN γ的含量及血清中特异性IgG1、IgE抗体水平变化。结果 与哮喘组比较,改组变应原免疫治疗组和阳性治疗组肺部炎症显著减轻, BALF中的总细胞数及嗜酸性粒细胞数,血清中抗原特异性IgG1、IgE抗体均显著降低;免疫治疗组（包括阳性对照）的BALF和脾细胞培养上清液中的细胞因子IL-4、IL-17均明显降低,IFN-γ含量显著升高。结论 通过基因改组获得的尘螨Ⅱ类变应原改组疫苗免疫治疗小鼠哮喘,可有效降低尘螨引起的小鼠肺部炎症。     

抗FasL抗体在小鼠病毒性心肌炎治疗中的作用

目的：探讨抗FasL抗体对小鼠柯萨奇B3（CVB3）病毒性心肌炎心肌细胞凋亡及病毒滴度的调节作用。方法：随机将80只Balb／c小鼠分为空白对照组、病毒对照组、IgG对照组及抗FasL抗体治疗组,于感染后第10天每组处死8只并取其心脏,光镜检查的心肌病理变化,原位末端标记法（TUNEL）检测小鼠心肌组织的细胞凋亡,用空斑形成技术（PFU法）测定心肌病毒滴度。结果：抗FasL抗体治疗组小鼠死亡率、心肌病变积分、心肌细胞凋亡率、心肌病毒滴度均明显低于病毒对照组及IgG对照组（P均〈0．01）。结论：抗FasL抗体可降低小鼠CVB,病毒性心肌炎心肌内病毒滴度、减少心肌细胞凋亡和心肌损伤．     

人胚胎干细胞建系及其研究进展

人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hES)在再生医学、药物筛选和发育生物学等领域具有重要的研究和应用价值。hES细胞系通常生长在小鼠胚胎成纤维细胞上,动物源性病原生物的污染风险限制了这类hES的临床应用,因此寻找无血清、无饲养层细胞的成分明确的培养体系进行hES细胞建系及培养,生产细胞移植临床安全应用标准的hES是近年hES建系的努力方向。