兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶多克隆抗体的制备和应用

目的：采用已构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒纯化重组蛋白,制备兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP-oc）多克隆抗体并鉴定其性能。方法：将构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒转化至BL21（DE3）中,应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达。表达产物经过Q柱阴阳离子交换和Ni柱亲和层析获得纯化的PTP-oc重组蛋白,将纯化的重组蛋白作为抗原免疫家兔,获得PTP-oc多克隆抗体。采用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体的特异性。结果：成功纯化出PTP-oc重组蛋白。间接ELISA法检测,采用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得了兔抗PTP-oc多克隆抗体,多克隆抗体效价达1∶32000以上,Western blotting法检测,所得多克隆抗体有较高的特异性。结论：成功纯化了PTP-oc重组蛋白,制备出PTP-oc多克隆抗体。     

Em18.3重组蛋白的表达及其免疫诊断特性的研究

目的：在大肠杆菌中表达和纯化截短的泡球蚴rEm18.3抗原重组蛋白,对其免疫诊断特性进行鉴定.方法： IPTG诱导pET41a-Em18.3原核表达质粒,表达和纯化rEm18.3-GST重组蛋白,SDS-PAGE电泳及Western blot法对其进行初步鉴定,ELISA法确定其免疫诊断特性.结果： rEm18.3-GST重组蛋白得到成功表达,SDS-PAGE电泳显示相对分子量为45 kDa.Western blot结果表明,rEm18.3-GST重组蛋白能被AE病人阳性血清识别.对56例多房棘球蚴病（AE）、88例细粒棘球蚴病（CE）、24例其他寄生虫病、24例其他疾病和24例健康者共236份血清进行ELISA检测结果显示,对AE血清诊断的敏感性为10.7%,特异性为99.4%,阳性预测值85.7%,阴性预测值78.1%.结论： rEm18.3-GST免疫诊断价值较低,Em18抗原重要的表位可能位于1-40位氨基酸.     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白,测定重组蛋白的免疫活性。方法采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫(海南株)GDH基因,双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,并用琼脂双向扩散法检测效价,ELISA、Western blotting检测重组抗原的免疫活性。结果获到了重组表达的抗原蛋白,表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1∶16。结论恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

重组钩端螺旋体多抗原位点同源合成基因的表达及其抗原性鉴定

目的：构建重组钩端螺旋体(钩体)优势抗原表位原核表达系统,以期获得高纯度的钩体优势抗原表位重组融合蛋白,为进一步研究钩体快速检测方法奠定基础。方法：利用基因重组的方法构建表达质粒pET-rLP。经IPTG诱导后,获得高效表达带组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白,包涵体蛋白经尿素变性溶解,采用镍离子亲和纯化,利用SDS-PAGE、Western blotting和间接ELISA法鉴定。结果：在相对分子质量为20 000处有1条特异性蛋白条带,为重组钩体优势抗原表位融合蛋白;ELISA结果显示其可与钩体阳性血清特异性结合,而与其他血清无交叉反应。结论：成功构建重组钩体优势抗原表位原核表达系统,并获得高纯度的重组钩体优势抗原表位融合蛋白。     

家兔支气管败血波氏杆菌重组百日咳杆菌粘附素(PRN) 蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的 表达支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)PRN蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法.方法 参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌prn基因序列(AY376325)设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段.将PCR扩增产物连接至原核表达载体pGEX-4T-1中,以E.coli BL21( DE3)为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白PRN作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等,建立检测支气管败血波氏杆菌抗体的间接ELISA方法.结果 成功克隆了prn全基因序列,并在E.coli BL21( DE3)中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白PRN具有良好的抗原性.应用重组蛋白PRN为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法.试验确定重组蛋白PRN抗原的包被浓度为500ng/mL,最适血清稀释度为1:40.结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础.     

家兔支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNT1的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的表达支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)DNT蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法。方法参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌dnt基因序列(AB020025)针对其N-端设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-28a(+)载体中,以E.coli BL21(DE3)为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白DNT1作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数,建立检测支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNT1抗体的ELISA方法。结果成功克隆了dntN-端的基因序列,并在E.coli BL21(DE3)中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白DNT1具有良好的抗原性。应用重组蛋白DNT1为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白DNT1抗原的包被浓度为6.25μg/mL,最适血清稀释度为1∶100。结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了一种比较实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础。     

结核分枝杆菌特异性蛋白片段Rv3388和6种特异抗原在结核抗体检测中的应用价值

目的 对结核分枝杆菌( MTB) PE家族的所有成员的结构进行分析,预测其抗原表位,截取Rv3388蛋白的优势抗原片段,对重组Rv3388蛋白及其它6种MTB特异性抗原进行评估,探讨不同结核特异性抗原与血清抗体的反应模式,评价血清学检测在结核病诊断中的价值. 方法 利用基因合成技术重叠延伸PCR扩增Rv3388蛋白637~731位的编码基因片段, 原核表达并纯化重组蛋白pET32a/Rv3388637-731 ,将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA法对该抗血清进行免疫原性分析. 同时对这7种MTB特异性蛋白的特异性及敏感性进行评价. 结果 重组蛋白pET32a/Rv3388637-731在大肠杆菌中的表达量占全菌蛋白的80%,ELISA显示有较强的免疫原性. 7 种 MTB特异性抗原具有不同的反应模式,单个抗原检测敏感性较差. 结论 对MTB PE家族的蛋白结构分析,表达并纯化重组蛋白pET32a/ Rv3388637-731 ,7种蛋白在血清抗体检测中具有抗原互补性,不同抗原与机体反应存在不同反应模式,提高结核抗体检测敏感性应多种抗原联合检测.     

旋毛虫膜蛋白新基因Tmp10的免疫筛选及鉴定

目的免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库,寻找抗旋毛虫病的疫苗候选抗原或诊断抗原。方法应用旋毛虫感染的猪血清免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库,获得阳性克隆。将一阳性克隆与原核表达载体p ET-28a(+)构建重组质粒,异丙醇硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导后,利用亲和层析柱纯化目的蛋白,并通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和Western blotting鉴定其抗原特异性和免疫原性。结果免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库获得42个阳性克隆,选取一个新基因Tmp10,成功构建了重组质粒p ET-28a(+)/Tmp10,诱导表达后获得的重组蛋白(r Tmp10)的相对分子质量约为40 000。Western blotting检测结果显示,该重组蛋白可被旋毛虫感染小鼠和猪血清所识别,具有抗原特异性。r Tmp10免疫小鼠可诱导产生高滴度的抗体,显示其具有较好的免疫原性。结论免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库获得一个新基因Tmp10,生物信息学分析预测其为膜蛋白,其重组蛋白(r Tmp10)具有较好的抗原特异性和免疫原性。     

结核分枝杆菌Mtb81蛋白的克隆、表达及抗原性分析

目的对结核分枝杆菌Mtb81抗原基因进行克隆、表达及纯化,并评价其抗原性。方法应用聚合酶链反应技术扩增结核分枝杆菌H37Rv Mtb81 DNA序列;将目的基因构建大肠杆菌高效表达株;亲和层析柱纯化重组蛋白;经SDS-PAGE电泳鉴定;通用ELISA法进行重组蛋白的抗原性检测分析。结果获得了结核分枝杆菌抗原Mtb81基因,在大肠杆菌BL21中高效表达,Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分支杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。ELISA分析中,该纯化的重组抗原敏感性、特异性和准确性分别为:35.8%、98.3%和56.7%,具有良好的抗原性和较高的特异性。结论结核分枝杆菌Mtb81重组蛋白抗原具备良好的抗原性与特异性,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及抗原、抗体的大规模制备打下基础。     

重组日本血吸虫极低密度脂结合蛋白的抗原性及诊断价值的研究

目的探讨重组日本血吸虫特异性极低密度脂结合蛋白(SVLBP)的抗原性及其诊断价值。方法SVLBP基因亚克隆人pQE-30表达载体，克隆菌在IPTG诱导下表达重组蛋白；非变性条件下制备克隆菌裂解液，用亲和层析法纯化重组蛋白；用Westem blot鉴定其抗原性；纯化SVLBP重组蛋白免疫家兔获得抗血清；以SVLBP重组蛋白为抗原，ELISA法检测血吸虫感染者血清及健康人血清。结果克隆菌在IPTG诱导下高表达SVLBP重组蛋白；该重组蛋白诱导家兔产生单特异抗体，抗体滴度为1：6400；SVLBP重组蛋白与血吸虫病人血清有较强的反应；以该蛋白为抗原检测36人份血吸虫感染者血清，阳性率为8313％，50人份健康人血清，假阳性率为2％(I/50)，10人份肺吸虫病人血清，1例阳性，交叉反应率为10％0／10)。结论SVLBP重组蛋白有较好的抗原性。以该重组蛋白为抗原检测日本血吸虫病患者血清中特异性抗体，敏感性和特异性均较高，具有一定的诊断价值。     

人巨细胞病毒部分抗原基因的克隆及表达

目的克隆表达人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）特异性强的抗原决定簇基因,制备特异性抗原。方法从感染HCMV的细胞上清液中提取病毒基因组DNA,用PCR扩增HCMVpp150（ppUL32）、gp52（UL44）、pp65（ppUL83）、ppUL80a蛋白IgM抗原决定簇编码区DNA序列,将其克隆至pMD-18T载体并测序,然后克隆至表达载体pGEX-4T-1诱导表达,采用免疫印迹法（Western blotting）检测表达产物的抗原性。结果经序列测定各基因片段序列正确,并在pGEX-4T-1表达载体中得到了高效表达,表达的融合蛋白经Western blotting和ELISA分析,具有良好的抗原性,能够与HCMV IgM阳性血清发生特异性反应。结论通过基因工程技术可以有效地获取纯度较高、特异性强的HCMV抗原。为HCMV感染者的早期诊断提供检测用抗原。     

日本斑点热立克次体近缘株重组OmpB蛋白抗原性研究

目的 探讨关于斑点热立克次体的临床诊断及流行病学调查而进行的诊断方法学研究.方法 构建R.Japonica Anhui 120 strain OmpB原核表达质粒,表达、鉴定并纯化重组蛋白,用其作为抗原建立间接ELISA检测方法,检测120份临床样本中日本斑点热立克次体特异性IgG抗体,并评价方法的敏感性和特异性.结果 获得了高表达、高纯度的OmpB重组蛋白,建立的间接ELISA方法体系与美国食品和药物管理局认可的诊断试剂盒相比有良好的特异性和敏感性,两者的特异性为100％,敏感性为96.7％,符合率为99.2％,Kappa值为0.98.结论 OmpB重组蛋白具有很好的免疫反应性,能特异地检出斑点热立克次体IgG抗体,间接ELISA方法可作为临床诊断的技术储备及流行病调查和科学研究.     

三种免疫学方法诊断人体囊虫病的评价

应用猪囊尾蚴虫体冰冻切片抗原作间接荧光抗体试验(IFAT)和囊液抗原作间接血凝试验(IHAT)及酶联免疫吸附试验(ELISA),以检测囊虫病人和健康人的敏感性、特异性和交叉反应性。三种血清学方法的敏感性为:IFAT(94.7%)>ELISA(81.1%)>IHAT(74.0%);特异性为:ELISA(100.0%)>IHAT(96.78%)>IFAT(87.7%)。对包虫病人血清均产生交叉反应。作者认为对囊虫病惠者综合采取 IFAT 和 ELISA两种方法进行诊断较为合适,有助于提高检出率和诊断符合率。     

间日疟原虫MSP1 C重组蛋白的制备及其在血清学诊断中的应用

目的在大肠埃希菌（E，coli）中表达、纯化间日疟原虫裂殖子表面蛋1C端重组蛋白（rGST—PvMSP1C）作为诊断抗原，评价其在间日疟血清学诊断中的应用价值。方法将含有重组质粒pGEX-4T-2／PvMSP1C的工程菌E．coil BL21（DE3）以IPTG进行诱导表达，表达产物以SDS—PAGE与Western—blot免疫印迹进行鉴定；采用GST融合蛋白层析柱进行分离纯化；以纯化重组蛋白包被酶标板，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测间日疟患者血清中的特异性IgG抗体。结果含有重组质粒pGEX-4T-2／PvMSP1C工程菌经IPTG诱导表达的rGST—PvMSP1C重组蛋白大小约63ku，能够被间日疟患者的血清所识别。纯化的重组蛋白SDS—PAGE电泳显示一条预期大小的蛋白条带；以重组蛋白作诊断抗原，67份镜检阳性的间日患者血清标本ELISA均为阳性。55份健康人血清ELISA均为阴性．5份恶性疟患者血清及7份血吸虫患者血清检测结果亦为阴性。结论在大肠埃希菌中表达纯化的间日疟原虫rGST—PvMSP1C蛋白具有免疫反应性，以其作为诊断抗原建立的血清中特异性IgG抗体ELISA检测方法具有良好敏感性和特异性，在间日疟的免疫学诊断中具有一定的推广使用价值。     

新耐药基因HA117多克隆抗体的制备与鉴定

目的制备HA117多克隆抗体。方法以HA117表达质粒pAdTrack-HA117为模板,PCR扩增HA117基因,扩增产物转入BL21(DE3)感受态细胞,进行HA117蛋白诱导表达,采用SDS-PAGE检测表达产物。纯化HA117蛋白后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。通过间接ELISA检测其效价。将转染携带HA117重组腺病毒的HEK293细胞为实验组,未转染的HEK293细胞为对照组,用细胞免疫荧光和Western blot方法检测其过表达的HA117蛋白,验证制备的HA117多克隆抗体的特异性。结果成功获得HA117多克隆抗体,间接ELISA法检测显示抗HA117血清效价为1∶729 000。细胞免疫荧光和Western blot检测示制备的HA117多克隆抗体可以特异性识别HA117抗原蛋白。结论获得了效价和特异性较高的HA117多克隆抗体。     

GST-hZimp10融合蛋白的重组及抗体制备

目的:构建pGEX-4T-1/hZimp10重组质粒,并在大肠杆菌中表达,纯化出GST-hZimp10融合蛋白,用以制备抗hZimp10抗体。方法:采用PCR技术以pcCDNA3.1-Flag-hZimp10为模板,扩增出hZimp10蛋白N端128个氨基酸对应DNA片段,并将其与谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1进行重组,酶切鉴定后获得重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达,获得GST-hZimp10融合蛋白,纯化后将其作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体特异性。结果:经BamHⅠ和XhoⅠ 双酶切鉴定,确定PGEX-4T-1/ hZimp10重组质粒中包含384bp的片段,与测序结果一致,表明pGEX-4T-1/hZimp10重组质粒构建成功。SDS-PAGE电泳,融合蛋白成功表达,蛋白相对分子质量大小与预期相符。间接ELISA法检测抗hZimp10抗体效价可达1:100 000以上。Western blotting法,hZimp10在LNCaP细胞中具有很高的特异性。结论:成功获得GST-hZimp10融合蛋白,且制备了抗hZimp10抗体。     

肺炎链球菌丝氨酸-苏氨酸激酶基因的原核表达及免疫血清的制备

目的制备抗肺炎链球菌(S.pn)丝氨酸-苏氨酸激酶(STKP)基因的特定区域的免疫血清,为疫苗研究奠定基础。方法 PCR扩增S.pn STKP蛋白C末端314个氨基酸区域的基因,将其克隆入pMD19-T载体,将鉴定正确的STKP基因从pMD19-T载体亚克隆至PET-32a(+)原核表达载体进行诱导表达;获得的可溶性蛋白经Ni2+柱纯化及Western blot鉴定后,免疫家兔制备抗STKP血清,间接ELISA鉴定抗体效价,Western blot鉴定免疫血清特异性。结果成功将STKP基因特定序列克隆入PET-32a(+)原核表达载体并诱导表达,形式以可溶性表达为主,经Ni2+柱层析法纯化STKP,纯度达92%,免疫家兔制备出STKP免疫血清,间接ELISA检测抗体效价为1∶100 000,Western blot证实免疫血清能与目的蛋白特异结合。结论获得STKP重组蛋白及免疫血清,重组表达产物具有免疫原性,为S.pn多价联合蛋白疫苗研制奠定了基础。     

恙虫病东方体56kD表达抗原基因片段的、表达及纯化抗原在恙虫抗体检测中的应用

目的：构建恙虫病东方体56kD表面抗原基因（sta56)片段的重组表达质粒，在E.coli中表达Sta56重组抗原，重组抗原纯化后应用于间接法ELISA，金标快速免疫导析法检测恙虫病东方体特异性抗体，方法：从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出sta56基因的ORF及其中长1053bp的大片段，用TA克隆技术将此大片段克隆以该重组质粒为模板，扩增出不同长度的截短的sta56片段，定向插入pPROEX HTb及pET30a载体，化大肠杆菌DH5a或BL21（DE3），IPTG诱导表达，应用SDS－PAGE观察重组蛋白表达情况，应用Western blot分析重组抗原的活性；采用电洗脱，亲和层析等方法纯化重组蛋白。纯化的重组蛋白直接包被聚乙烯96孔板，用于间接法ELISA检测恙虫病东方体IgG，或以胶体金标记重组抗原，运用金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体IgM和IgG抗体，结果：（1）从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出含sta56基因的ORF，并成功构建含sta56 ORF大片段的重组质粒TOPO－sta56.(2)以截短的sta56基因片段构建重组表达质粒pHTbOt957,pHTbO498,pHtbOt342和pETOt957,pETOt498,pETOt342，各重组子均可在E.coli中以融合蛋白的形式有效表达，SDS－PAGE显示各表示重组子表达不同分子量的重组蛋白，Western blot证实各重组蛋白均能被恙虫病患者阳性血清所识别。（3）电洗脱、Ni-NTA并和层析均可用于重组蛋白的纯化，并获得高纯度的重组蛋白。（4）纯化的重组蛋白应用于间接法ELISA检测恙虫病东方体特异性IgG，与间接免疫荧光法IFAT比较，其敏感性和特异性分别91．7％和76．5％。（5）纯化的重组蛋白应用于金标免疫层析法，可直接快速检测恙虫病东方体特异性IgM和IgG。与间接免疫荧光法IFAT比较，其检测IgG的敏感性和特异性分别为94．2％和84．2％，结论：恙虫病东方体Karp株sta56基因可在大肠杆菌获得高效表达。重组蛋白具有免疫反应性，纯化后可用作免疫诊断抗原；以重组抗原建立的间接法ELISA检测IgG，适用于大规模的流行病学调查，以胶体金标记重组抗原建立的免疫层析法用于同时检测IgM和IgG抗体，具有简便，快速的特点，适于在缺乏实验条件的基层医院，农村对门诊病人进行诊断。     

弓形虫SAG1的高密度发酵表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的 探讨弓形虫SAG1在大肠杆菌中的高密度发酵表达及其批量制备流程.方法 利用高密度发酵大肠杆菌批量表达rSAG1,经Ni-NTA、Sephadex G-75及切胶等纯化工艺对重组蛋白进行纯化,用Western blotting鉴定其免疫反应性,ELISA验证rSAG1检测弓形虫抗体的敏感性与特异性.结果 高密度发酵诱导4 h后工程菌液的OD600达到20.21:平均每升发酵液可收获工程菌26.10 g;目标蛋白的表达量占菌体蛋白的25.82%;经Ni-NTA、Ni-NTA联合Sephadex G-75及Ni-NTA联合切胶纯化的rSAG1蛋白纯度分别为72.36%、98.54%和97.39%;Western blotting结果显示联合纯化的rSAG1与弓形虫免疫兔血清晕单一反应条带,与正常兔血清未出现反应带;Ni-NTA联合Sephadex-G75纯化的rSAG1对25例感染小鼠血清和38例抗体阳性患者血清的检出率分别为96%和94.7%.结论 利用高密度发酵技术高效表达、Ni-NTA联合Sephadex G-75纯化的rSAG1具有较高纯度和良好的免疫反应性,该工艺可以用于rsAG1抗原的批量生产.     

泡球蚴Em18多克隆抗血清的制备和鉴定

目的：制备和鉴定泡球蚴Em18抗原的多克隆抗血清.方法： 利用大肠杆菌BL21（DE3）表达重组质粒pET41a-Em18,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导、表达和纯化rEm18-GST蛋白,免疫BALB/c小鼠,制备鼠源抗Em18多克隆抗体,采用ELISA和Western blot法鉴定其特异性.结果： （1）SDS-PAGE检测表明,rEm18-GST蛋白得到成功表达,在相对分子量为50 kDa处有表达条带.（2）纯化后获得高纯度的rEm18-GST蛋白.（3）ELISA结果表明,抗Em18抗血清的抗体滴度为1∶25 600;Western blot结果表明抗Em18抗血清能与rEm18-GST蛋白发生特异性结合.结论： 获得了特异性识别rEm18-GST蛋白的多克隆抗体,为进一步筛选Em18模拟抗原表位奠定基础.