应用RD-PCR方法制备K562细胞表达谱芯片基因探针

目的收集K562细胞表达谱芯片的基因片段。方法培养K562细胞,抽提其mRNA,反转录为cDNA,应用限制性显示PCR技术(RD-PCR)分离K562细胞不同组别的产物片段,分别行PCR扩增。结果制备了可用于基因芯片制作的基因探针片段。结论RD-PCR方法适合于基因芯片探针的收集。     

裸鼠高致瘤性K562—n细胞系细胞骨架相关基因的表达变化研究

目的 探索K562和K562－n细胞在裸鼠体内致瘤性不同的分子生物学机制。方法 应用基因芯片技术，检测K562细胞和K562－n细胞的差异表达基因。结果 一系列与细胞骨架有关的基因在K562－n细胞中表达上调，包括编码calaizzarin、ADP糖基化蛋白2、巨噬细胞肌动蛋白基因、硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白基因。结论 K562－n细胞的裸鼠高致瘤特性与一些细胞骨架相关基因的表达上调有关。     

裸鼠高致瘤性人白血病细胞系肿瘤相关基因的表达

目的：探索K562和K562－n细胞在裸鼠体内致瘤性不同的分子生物学机制。方法：应用基因芯片技术，检测K562细胞和K562－n细胞的差异表达基因。结果：K562－n细胞中表达上调的与白血病及其他肿瘤发生、发展相关的基因包括加dek基因和DP1基因（结肠直肠多发性息肉病位点基因）。许多肿瘤抑制基因或包含潜在的肿瘤抑制基因的序列在K562－n细胞中表达下降，如染色体12p13序列（U47924）.锌指蛋白127－Xp基因和锌指蛋白198基因,prohibitin基因、DNF15s2基因、hMSH2基因（遗传性非息肉性结肠癌基因，为碱基错配修复基因）、环孢素受体基因。结论：K562－n细胞的裸鼠高致瘤特性与一系列癌基因的表达上调和抑癌基因的表达下调有关。     

用DNA-PCR方法于基因组水平检测K562细胞及慢性粒细胞白血病患者bcr/abl融合基因

目的：在慢性粒细胞白血病（慢粒）细胞系K562及慢粒患者中尝试基于DNA水平的bcr／abl融合基因检测方法。方法：以Waller的“L—T DNA PCR”方法为基础，并针对其引物位置设计的缺陷，改进设计了一套DNA—PCR引物，分别提取K562细胞及慢粒患者外周血单个核细胞DNA，进行bcr／abl融合基因扩增，并对扩增片段进行序列测定。结果：运用DNA—PCR方法成功地扩增出了K562细胞及2名CML患者外周血基因组的bcr／abl融合基因片段，随后进行的片段测序进一步明确了融合基因的断裂位点。结论：DNA—PCR提供了一种基于基因组DNA水平的新检测手段，结合测序能鉴定融合基因的断裂位点，若结合定量PCR的方法则能监测患者的治疗效果与预后，还能检测患者经化疗后的残留微小病灶。     

一个新的C2H2型锌指蛋白cDNA基因的克隆

目的：从K562细胞中克隆新的锌指蛋白cDNA基因片段。方法：提取K562细胞中总RNA,逆转录后,用CX2C和H－C Link引物进行加端PCR,扩增产物经限制性内切酶酶切后,重组至pGEMTZf( )载体,用末端终止法测定插入片段的序列。结果：测出五个插入片段的序列。与GenBank核酸数据库中的已知序列进行同源性比较分析,发现一个序列为新的cDNA基因片段。该基因编码产物至少含有五个C2H2型锌指结构。结论：从K562细胞中克隆出一个新的C2H2型锌指蛋白cDNA基因片段,为测定该基因的全序列和功能研究奠定了基础。     

As2O3处理前后K562细胞基因表达变化的基因芯片检测

目的 应用基因芯片研究三氧化二砷（As2O3)处理前后K562细胞基因表达的变化。方法 提取As2O3处理前后K562细胞的总RNA，纯化为mRNA后再反转录为cDNA。cDNA经限制性内切酶Sau3AI切割后，cDNA片段分别用Cy3和Cy5标记，与自制的包含348个基因片段的胎盘库芯片杂交。结果 杂交结果经扫描和软件分析。发现了11个差异表达的基因片段，其中有3个基因片段与细胞凋亡密切相关。结论 我们构建的胎盘库基因芯片可以成功地用于研究药物作用前后基因表达的变化。     

应用Southern印迹杂交法检测转移基因在宿主细胞中的整合

目的 应用Southern印迹杂交法（Southern blot)证实转移基因整合至宿主细胞基因组DNA。方法 酚氯偏法提取基因转导的PA317/AIM及K562/AIM细胞基因组DNA，以聚合酶链反应（PCR）扩增转移基因片段，随机引物法标记^32P-DNA探针，与经BamHI酶切、琼脂糖凝胶电泳、转移至尼龙膜的基因组DNA进行Southern杂交反应，检测转移基因的整合。结果 PCR反应和Southern blot分析证实转移基因存在于受体细胞基因组DNA中。结论 Southern印迹杂交法证实转移基因稳定整便至逆转录病毒生产细胞PA317/AIM及靶细胞K562/AIM中。     

用PCR制备检测丁型肝炎病毒基因芯片的探针

目的：制备诊断丁型肝炎病毒(HDV)cDNA基因芯片探针。方法：针对HDV病毒基因保守区域设计聚合酶链反应(PCR)引物，纯化PCR扩增产物克隆，并测序鉴定。结果：序列分析表明，所扩增的片段均属于HDV特异基因。结论：利用PCR扩增产物制备基因芯片探针是一种快速、简便、实用的方法。     

MDR1启动子调控的双自杀基因真核表达载体的构建及其在K562/A02细胞中的表达

目的：构建多药耐药基因（MDR1）启动子调控的CD-TK双自杀基因真核表达载体用于耐药白血病的靶向性基因治疗。方法：采用PCR方法从K562/A02细胞基因组DNA中扩增MDR1启动子，将其连接到双自杀基因CD TK的上游，构建pcDNA3 MDR1 Promoter CD-TK真核表达载体，用脂质体介导法将构建好的载体转染入K562、K562/A02细胞，PCR鉴定CD、TK基因的整合，RT-PCR鉴定CD、TK基因的表达。结果：PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确，通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK。转染入细胞后PCR结果显示，CD、TK基因均整合入K562、K562/A02细胞中，RT-PCR结果显示,562/A02/CD TK细胞CD、TK基因有特异性条带表达，而K562/CD TK细胞无特异性条带。结论： MDR1启动子调控的CD TK双自杀基因真核表达载体的成功构建及其在K562/A02细胞中的特异性表达为耐药白血病的靶向性基因治疗提供了实验基础。     

苦参碱诱导K562细胞分化的差异表达基因的研究

目的研究苦参碱诱导人红白血病K562细胞分化的分子机制。方法应用改良的mRNA差异显示逆转技术(DDRT—PCR)筛选苦参碱诱导K562细胞分化相关的差异表达基因；对差异cDNA片段纯化、克隆、测序及Blast分析，采用逆转录一聚合酶链式反应(RT—PCR)方法验证。进一步对其中的未知差异cDNA片段采用Northern杂交确定其转录本的大小及组织分布特性，进而充分利用多种生物信息学资源对差异片段进行结构和功能的预测。结果苦参碱诱导K562细胞前后存在明显的基因表达差异，筛选获得了17条差异条带。其中4个差异显著片段经RT—PCR验证后，在Genbank中分析，有3个为已知基因，1个可能为未知基因，暂命名为KH基因。Northern杂交证实KH基因转录本的大小为1．35kb，分布于正常人体脑组织中。结论苦参碱具有诱导K562细胞基因表达谱发生变化的作用，由苦参碱诱导的K562细胞分化是一个多基因参与的过程；KH基因可能是苦参碱作用K562细胞后表达量发生改变的未知基因，可能与细胞癌变有关。     

苦参碱对K562细胞骨架的作用观察

目的：从细胞骨架方面进一步探索苦参碱对人白血病K562细胞株的作用机制。方法：采用微管吮吸技术和基因芯片技术分析苦参碱处理前后K562细胞粘弹系数和细胞骨架蛋白基因表达的改变。结果：0.1mg/ml苦参碱作用K562细胞24h后粘弹系数下降，细胞骨架类基因prefoldin 与ezrin 的mRNA表达增强。结论：苦参碱能够导致K562细胞的细胞骨架发生变化。     

DNA芯片技术筛选K562肿瘤细胞特异性基因

目的 应用DNA芯片技术筛选人白血病K562细胞中的肿瘤特异性基因。方法 提取正常人白细胞和K562细胞基因组DNA，并用限制性内切酶Sau3AI酶切。其中K562细胞基因组酶切产物经DNA聚合酶Ⅰ补平加A后克隆到T-载体，挑选阳性克隆，用PCR扩增．以纯化的PCR产物做探针，制备K562细胞基因组DNA芯片。正常人白细胞基因组酶切产物加上人工通用接头，用限制性标记技术标记上荧光标记物Cy3，与制备的K562细胞基因组DNA芯片杂交。结果 芯片杂交结果经扫描分析，发现42个K562细胞肿瘤特异性基因，进一步用序列分析证实．其中有1个为BCR(breakpoint cluster gene)基因。结论 我们自制的K562细胞基因组DNA芯片可以成功地用于筛选肿瘤特异性基因．为更好地从基因组水平研究肿瘤发生的分子机制提供了新的技术途径。     

CRKL基因反义寡核苷酸对K562细胞增殖的影响

目的：通过研究CRKL基因反义寡核苷酸对K562细胞增残活性的影响,探讨CRKL基因在Ph^ 慢性粒细胞性白血病（CML）发病中的作用,方法： 脂质体为载体,CRKL基因反义寡核苷酸转染K562细胞,通过活细胸记数,H^3-TdR掺入,RT－PCR等方法观察K562细胞的增殖活性及基因表达的变化,结果,CRKL反义寡核苷酸对K562细胞的增殖有抑制作用,结论：CRKL基因在Ph^ CML的发病中可能有重要作用,可作为CML治疗的新靶点。     

HIV—1基因限制性显示片段的克隆与序列分析

目的：克隆并分析经限制性显示－聚合酶链反应（RD－PCR）扩增的HIV－1基因片段。方法：将所有HIV－1基因片段分成10组并进行RD－RCR扩增,纯化各组PCR产物后将之克隆至T载体上并快速鉴定。从阳性克隆中提取质粒,扩增靶片段并测序。结果：序列分析表明,所扩增的片段均属于HIV基因。结论：改良了一种多片段的克隆及鉴定方法并用于限制性显示扩增片段的克隆。     

精子细胞中基因表达谱的研究

目的 研究成熟精子细胞中的基因表达。方法 采用限制性显示PCR（RD－PCR）获得大量正常和异常精子细胞中基因表达序列标签（EST）并以表达谱图的方式显示出来。结果 通过RD－PCR技术得到大量正常精子细胞和异常精子细胞的EST及部分差异表达EST。结论 RD－PCDR技术既能针对已知基因又能针对未知基因，快速收集大量长度适宜、大小均一、适于芯片制备的EST，较通过cDNA文库等方法得到靶基因片段具有独特的优势。     

As2O3处理前后K562细胞基因表达变化的基因芯片检测

目的应用基因芯片研究三氧化二砷(As2O3)处理前后K562细胞基因表达的变化.方法提取As2O3处理前后K562细胞的总RNA,纯化为mRNA后再反转录为cDNA.cDNA经限制性内切酶Sau3AI切割后,cDNA片段分别用Cy3和Cy5标记,与自制的包含348个基因片段的胎盘库芯片杂交.结果杂交结果经扫描和软件分析,发现了11个差异表达的基因片段,其中有3个基因片段与细胞凋亡密切相关.结论我们构建的胎盘库基因芯片可以成功地用于研究药物作用前后基因表达的变化.     

原位逆转录PCR检测干细胞因子mRNA在白血病细胞的表达

目的：探索应用原位逆转录PCR（RT－PCR）检测低拷贝的干细胞因子mRNA在白血病细胞表达的可行性。方法：在普通的PE480型PCR仪进行原位RT－PCR，检测干细胞因子mRNA在K562、HL－60和慢性粒细胞性白血病细胞的表达。结果：直接法和间接法原位RT－PCR法可以检测到干细胞因子mRNA在K562、HL-60和慢性粒细胞性白血病细胞表达，而常规的原位杂交则为阴性。结论：（1）干细胞因子在K562、HL－60和慢性粒细胞性白血病细胞均有表达，但是表达量较低，应用原位RT－PCR可进行检测；（2）在普通的PE480型PCR仪上可以进行原位PCR。     

应用PCR快速制备乙型、丁型肝炎病毒诊断基因芯片探针

目的 应用PCR技术扩增乙型、丁型肝炎病毒保守区域基因片段，并进行克隆、测序分析，制备联合诊断乙型、丁型肝炎病毒基因芯片探针。方法 利用Olig06．4软件分别针对乙型、丁型肝炎病毒基因保守区域设计PCR引物，纯化PCR扩增产物，扩增后的产物克隆至pMDl8-T载体并进行快速鉴定，提取阳性克隆质粒进行测序分析及鉴定。结果 获得多个乙型、丁型肝炎特异性基因片段。序列分析表明，所扩增的片段均属于乙型、丁型肝炎病毒特异基因。结论 利用PCR扩增产物制备基因芯片探针是一种快速、简便的实用方法。     

高三尖杉酯碱诱导K562细胞凋亡中bcl—2家族基因的表达

目的 探讨在高三尖杉酯碱（HHT）诱导K562细胞凋亡时,bcl-2家族部分基因在mRNA水平表达的改变。方法 细胞形态（光镜和电镜）、DNA凝胶电泳、流式细胞仪等方法证实凋亡,进一步用RT－PCR方法研究凋亡过程中bcl-2家族中部分基因表达的改变。结果 超过一定“阈浓度”HHT可诱导K562细胞凋亡;RT－PCR方法发现bax基因和bfl-1基因在加药6h开始上调,家族其它基因bcl-2、bcl-xL的表达未见明显改变。结论 HHT可诱导K562细胞凋亡;其机制可能与HHT在mRNA水平上调bax基因有关;而bfl-1基因的上调可能是K562细胞抗HHT诱导其进一步凋亡的原因。     

DNA芯片技术筛选K562肿瘤细胞特异性基因

目的应用DNA芯片技术筛选人白血病K562细胞中的肿瘤特异性基因。方法提取正常人白细胞和K562细胞基因组DNA,并用限制性内切酶Sau3AI酶切。其中K562细胞基因组酶切产物经DNA聚合酶Ⅰ补平加A后克隆到T-载体,挑选阳性克隆,用PCR扩增,以纯化的PCR产物做探针,制备K562细胞基因组DNA芯片。正常人白细胞基因组酶切产物加上人工通用接头,用限制性标记技术标记上荧光标记物Cy3,与制备的K562细胞基因组DNA芯片杂交。结果芯片杂交结果经扫描分析,发现42个K562细胞肿瘤特异性基因,进一步用序列分析证实,其中有1个为BCR(breakpoint cluster gene)基因。结论我们自制的K562细胞基因组DNA芯片可以成功地用于筛选肿瘤特异性基因,为更好地从基因组水平研究肿瘤发生的分子机制提供了新的技术途径。