维甲酸抑制甲状腺鳞癌细胞株生长增殖作用机制的探讨

目的观察9-顺维甲酸（9-cis-RA）对甲状腺鳞癌SW579细胞株生长增殖及维甲酸受体B（RARβ）和p21表达的影响，进而探讨维甲酸的抗癌作用机制。方法将甲状腺鳞癌细胞株SW579分为对照组和实验组。实验组加入不同浓度的9-cis-RA，使其终浓度分别为1×10^-7mol／L、5×10^-7mol／L、1×10^-6mol／L、5×10^-6mol／L、1×10^-5mol／L，各组细胞均在培养24h后加药，继续培养48h。在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化；采用MTT比色法测定细胞增殖活性；流式细胞仪检测细胞周期；用RT-PCR方法检测SW579细胞RARβ及p21mRNA的表达。结果低浓度9-cis-RA组（1×10^-7mol／L、5×10^-7mol／L、1×10^-6mol／L）肿瘤细胞有向良性细胞形态转化的趋势；高浓度组（5×10^-6mol／L、1×10^-5mol／L）细胞生长密度较对照组明显降低，与低浓度组相比，向成熟分化的趋势不明显。MTT结果显示，实验组细胞均出现显著的生长抑制作用，且呈剂量依赖性。流式细胞仪分析，实验组随着9-cis-RA的升高，S期细胞在细胞周期中所占比例逐渐减少，G1期细胞则明显增加（P〈0．01），细胞滞留在G1期。RT-PCR检测结果表明，经不同浓度维甲酸处理的各组细胞RARβ和p21mRNA表达水平均显著上调。结论9-顺维甲酸在一定浓度范围内对甲状腺鳞癌细胞株SW579有剂量依赖性的增殖抑制作用，其机制可能与提高SW579细胞RARβ基因的表达，进而再上调p21的表达有关。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷通过上调法尼酯X受体启动子甲基化水平抑制HepG2细胞载脂蛋白A表达

目的 探索5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）的DNA去甲基化作用对HepG2细胞载脂蛋白A（ApoA）表达的影响,并探讨其作用机制。方法 选取ApoA高表达细胞株HepG2细胞为研究对象。噻唑蓝法测定HepG2经不同浓度（0、10、20、40、80 μmol/L）的5-Aza-CdR处理不同时间（12、24、48、72、96 h）后细胞相对存活率;Western blot检测5-Aza-CdR不同浓度组HepG2细胞ApoA、法尼酯X受体（FXR）的表达水平;逆转录聚合酶链反应检测ApoA、FXR的mRNA水平;亚硫酸氢盐测序PCR检测FXR基因启动子在5-Aza-CR不同浓度组的甲基化水平。结果 与对照组相比,5-Aza-CR 10、20、40 μmol/L组在12、24、48、72 h各组间细胞存活率无统计学差异（P>0.05）,而在20 μmol/L 96 h组、40 μmol/L 96 h组、80 μmol/L 24 h组、80 μmol/L 48 h组、80 μmol/L 72 h组以及80 μmol/L 96 h组HepG2细胞存活率存在统计学差异（P<0.05）,选取0～40 μmol/L为5-Aza-CdR的安全浓度范围,0～72 h为合适作用时间。与对照组相比,5-Aza-CdR呈剂量和时间依赖性上调FXR蛋白、下调ApoA蛋白表达,其中以40 μmol/L组最为明显（P<0.05）;与对照组相比,5-Aza-CdR呈剂量依赖性上调FXR mRNA、下调ApoA mRNA表达,其中以40 μmol/L组最为明显（P<0.05）。随着5-Aza-CdR浓度的递增,FXR基因启动子甲基化水平呈下降趋势,其中对照组FXR基因启动子甲基化率为58.3%,而40 μmol/L组FXR基因启动子甲基化率仅为8.3%。结论 5-Aza-CdR通过DNA去甲基化作用促进FXR表达,从而下调ApoA的表达。     

甲基化转移酶抑制剂和紫杉醇对低分化胃癌细胞株的作用

目的探讨甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2＇-脱氧胞苷（5-aza-2＇-deoxycytidine,5-Aza-CdR）联合紫杉醇（Paclitaxel）对低分化胃癌细胞株BGC-823细胞的作用及对抑癌基因PTEN和E-cadherin（E-cad）的作用。方法分别及联合应用两药后,用MTT、流式细胞仪、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测药物处理前后对细胞增殖抑制率、细胞周期、凋亡率及抑癌基因PTEN和E-cad mRNA的表达。结果5-Aza-CdR的IC50（48h）浓度为4．13×10^-4mol／L,紫杉醇的IC50（48h）浓度为4．67×10^-8mol／L,联用后有明显的协同效应。紫杉醇使细胞阻滞在G2／M期,5-Aza-CdR阻滞在S期,联用后,可阻滞在两个周期,凋亡率增加。紫杉醇对PTEN和E-cad的表达无影响,5-Aza-CdR可以使其重新表达,在两药联合作用后,表达量较5-Aza-CdR单独作用明显增多。结论5-Aza-CdR和紫杉醇联用后对人类低分化胃癌有强大的抗肿瘤效应,且强于药物单一作用;紫杉醇可促进5-Aza-CdR对抑癌基因PTEN和E-cad的再表达增强。     

5-杂氮-2′-脱氧胞苷对乳腺癌MCF-7细胞体外迁移能力的影响及机制探讨

目的观察5-杂氮-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对非浸润性人乳腺癌MCF-7细胞体外迁移能力的影响,并探讨其机制。方法将MCF-7细胞分两组,观察组用含5.0μM5-Aza-CdR的培养液处理4 d,对照组加入等体积的DMSO。采用细胞划痕实验观察细胞体外迁移能力,采用RT-PCR、甲基化特异性PCR（MSP）法检测CXC趋化因子受体-4（CXCR4）、乳腺癌转移抑制基因-1（BRMS1）mRNA及其启动子区甲基化状态。结果与对照组比较,观察组36、48 h细胞划痕愈合率明显升高,MCF-7细胞的CXCR4 mRNA表达量明显增加（P〈0.05）;5-Aza-CdR使CXCR4启动子区甲基化的CpG岛1完全去甲基化,BRMS1启动子区CpG岛B的非甲基化状态亦无明显改变。结论 5-Aza-CdR增强了MCF-7细胞的体外迁移能力,可能与其去甲基化机制上调了促转移基因CXCR4表达有关。     

5-氮杂-2＇-脱氧胞苷对胃癌AGS细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨

目的观察5-氮杂-2＇-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对胃癌AGS细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其机制。方法分别用低、中、高浓度5-Aza-CdR处理AGS,对照组不处理。CCK-8检测AGS细胞增殖状态,流式细胞仪检测AGS细胞周期及凋亡率,MSP检测AGS中DAPK基因启动子甲基化状态,RT-PCR和Western blot法分别检测AGS中的DAPKmRNA及其蛋白。结果低、中、高浓度组AGS细胞增殖速度显著低于对照组（P均〈0.05）,并呈浓度、时间依赖性（P均〈0.05）。5-Aza-CdR使AGS细胞停滞在G0/G1期（P均〈0.05）,细胞凋亡率增加（P均〈0.05）。对照组DAPK基因启动子表现甲基化状态,低、中、高浓度组DAPK基因启动子被逆转成未甲基化状态。低、中、高浓度组AGS细胞DAPK mRNA及蛋白表达量均显著高于对照组（P均〈0.05）,并呈浓度依赖性。结论 5-Aza-CdR可抑制AGS细胞增殖、促进其凋亡,可能与逆转DAPK基因启动子甲基化状态并使其重新表达有关。     

三氧化二砷对人胆管癌细胞侵袭力的影响及机制探讨

目的 观察三氧化二砷（As2O3）对人胆管癌细胞QBC-939黏附、侵袭力的影响，并探讨其机制。方法常规培养QBC-939，之后加入As2O3培养。MTT法检测细胞黏附力，Transwell趋化小室检测细胞侵袭力，RT—PCR检测细胞的尿激酶型纤溶酶原激活因子（u-PA）mRNA、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）mRNA。结果加入As2O3培养后，QBC-939细胞黏附力、穿膜细胞数较对照组明显下降（P均〈0．05），其u—PA、MMP-9mRNA表达减少（P均〈0．05），并呈时间、剂量依赖性。结论As2O3可抑制QBC-939的黏附和侵袭力，其机制与降低该细胞u-PA、MMP-9mRNA表达有关。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对肺癌SPC-A-1细胞p16、MGMT基因甲基化及其表达的影响

目的观察5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对体外培养的肺癌SPC-A-1细胞p16、MGMT基因启动子区DNA甲基化状态及其表达的影响,探讨肺癌细胞p16、MGMT基因失活的机制及去甲基化制剂对p16、MGMT基因表达的调控。方法 5-Aza-CdR处理体外培养的肺癌SPC-A-1细胞,甲基化特异性PCR（MSP）法检测用药前后细胞p16、MGMT基因的甲基化状态,RT-PCR法检测用药前后细胞p16、MGMT mRNA。结果加入5-Aza-CdR前,SPC-A-1细胞p16、MGMTmRNA表达缺失,其启动子区域表现为DNA甲基化。加入5-Aza-CdR后,SPC-A-1细胞中p16、MGMT基因呈现DNA去甲基化,而且表达缺失的p16、MGMT mRNA重新表达。结论启动子区高甲基化是肺癌细胞p16、MGMT基因失活的主要原因之一,去甲基化制剂5-Aza-CdR能逆转p16、MGMT基因甲基化状态,从而调控p16、MGMT基因表达。     

survivin与PTEN在星形细胞瘤患者脑中的表达及临床意义

目的探讨survivin、VFEN在人脑星形细胞瘤组织标本中的表达及其与病理分级和预后的关系。方法设实验组和正常对照组。实验组为人脑星形细胞瘤组织标本,Ⅰ级组20例、Ⅱ级组30例、Ⅲ-Ⅳ级组30例;对照组为正常人脑组织标本10例。采用免疫组化S-P法检测survivin、PTEN的表达并分析二者之间的相互关系。结果从Ⅰ级组到Ⅲ～Ⅳ级组,survivin阳性表达率呈明显递增趋势,PTEN的阳性表达率呈递减趋势,二者呈负相关（rs=-0.668,P〈0．05）。结论survivin基因和PTEN蛋白表达与人脑星形细胞瘤的临床病理级别和生物学行为特征有密切关系,联合检测survivin和PTEN对判断人脑星形细胞瘤的恶性程度及预后有一定参考价值。     

白细胞介素-4对巨噬细胞缺氧诱导促有丝分裂因子分泌的影响

目的：探讨白细胞介素-4（IL-4）对巨噬细胞缺氧诱导促有丝分裂因子（HIMF）分泌及HIMF对血管平滑肌细胞增殖的影响。方法：用不同剂量的重组IL-4刺激培养的巨噬细胞，以逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测巨噬细胞HIMFmRNA表达，荧光免疫组化激光共聚焦显微镜检测巨噬细胞HIMF蛋白表达；用终浓度分别为3×10^-4mmol／L，9×10^-4mmol／L，2．7×10^-5 mmol／L的重组HIMF刺激培养的平滑肌细胞，以^3 H-胸腺嘧啶核苷（^3 H—TdR）掺入法测定HIMF对平滑肌细胞增殖的影响。结果：Th2型细胞因子IL-4刺激巨噬细胞，HIMFmRNA及其蛋白明显表达（P〈0．01）；浓度为3×10^-6 mmol／L，9×10^-4～mmol／L，2．7×10^-5mmol／L的重组HIMF明显促进平滑肌细胞增殖（与对照组比较P〈0．01），且随着HIMF剂量的增加，促增殖作用增强。结论：Th2型细胞因子IL-4能刺激巨噬细胞表达HIMF mRNA及其蛋白，HIMF能促进体外培养的血管平滑肌细胞增殖。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对胃癌AGS细胞CHFR基因去甲基化作用及意义

目的观察5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对胃癌AGS细胞CHFR基因去甲基化的作用,并探讨其临床意义。方法分别采用BSP和RT-PCR技术检测5-Aza-CdR处理前后胃癌AGS细胞CHFR基因启动子甲基化状态及其mRNA。结果 AGS细胞CHFR基因启动子在5-Aza-CdR处理前呈现高甲基化状态（甲基化率≥60%）,其mRNA表达完全缺失;5-Aza-CdR处理后则表现为低或无甲基化状态（甲基化率≤20%）,其mRNA表达恢复正常。结论 CHFR基因启动子在AGS细胞中呈高甲基化状态,5-Aza-CdR能显著逆转其CHFR基因异常甲基化,诱导CHFR基因表达,为胃癌的治疗提供新思路。     

抑制Cks1表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭转移能力的影响及机制探讨

目的观察抑制Cks1表达对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭转移能力的影响，并探讨其机制。方法将MCF-7细胞分为两组，观察组细胞经脂质体转染Cks1siRNA，对照组细胞转染ScrambledsiRNA；分别采用MTS法、Transwell小室实验观察MCF-7细胞的增殖及侵袭转移能力，采用Western blot法检测MCF-7细胞中的MMP-2、MMP-9蛋白。结果观察组转染60、84、108、132h后，MCF-7细胞的OD值分别为0．15±0．01、0．3±0．02、0．7±0．01、1．3±0．02，对照组分别为0．2±0．01、0．5±0．01、1．3±0．03、1．8±0．02，两组转染84、108、132h细胞OD值比较，P均〈0．05。观察组转染48h，侵袭细胞数为（150±17）个、转移细胞数为（210±22）个，对照组分别为（550±90）、（660±96）个，两组比较，P均〈0．05。转染后12h，观察组MMP-2、MMP-9蛋白表达量为0．05±0．002、0．104-0．002，对照组分别为0．95±0．020、0．98±0．030，两组比较，P均〈0．05。结论抑制Cksl表达可显著抑制MCF-7细胞的增殖、侵袭转移能力，该作用可能与MMP-2、MMP-9蛋白表达降低有关。     

细胞因子对肺癌H460细胞MMP表达的影响及地塞米松的干预作用

目的 在肺癌H460细胞的三维立体培养过程中,直接观察细胞因子[肿瘤坏死因子α（TNF-α）和IL-1β]对肺癌H460细胞关于基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和MMP-9表达的诱导作用及地塞米松的干预作用.方法 在肺癌H460细胞三维立体培养过程中加入细胞因子TNF-α和IL-1β来诱导MMP的表达,同时加入地塞米松干预MMP-2和MMP-9的表达;用明胶酶谱法测定MMP-2、MMP-9,同时在培养5d后测定胶原含量大小.结果 TNF-α和IL-1β诱导培养在立体胶原内的肺癌H460细胞产生大量MMP-2和MMP-9,并促进其活化,引起大量胶原降解,地塞米松抑制了MMP-2及MMP-9的表达及活化,进而抑制了胶原的降解,对抗了细胞因子TNF-α和IL-1β对胶原的降解作用.结论 细胞因子TNF-α和IL-1β可诱导MMP的表达,MMP可直接降解肺内胶原,进而促进肺癌的侵袭或转移;地塞米松通过抑制MMP的表达与活化对抗MMP对肺组织的破坏作用,进而抑制了肺癌的侵袭与转移.     

胃癌组织中KISS-1和MMP-9的表达及其意义

目的探讨肿瘤转移抑制基因K ISS-1及基质金属蛋白酶9（MMP-9）与胃癌侵袭、转移的关系,为研究胃癌的转移机制及治疗提供理论基础。方法采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测36例胃癌组织及36例正常胃组织中K ISS-1 mRNA及MMP-9 mRNA的表达情况,分析其与胃癌患者各临床病理指标的关系及二者的相关性。结果 K ISS-1 mRNA在胃癌组织中的阳性表达率及表达水平均低于正常胃组织（P均〈0.01）,并且其低表达与淋巴结转移密切相关（P〈0.05）;MMP-9 mRNA在胃癌组织中的阳性表达率及表达水平均高于正常胃组织（P均〈0.05）,MMP-9 mRNA的高表达与癌的浸润深度和淋巴结转移密切相关（P均〈0.05）;K ISS-1与MMP-9表达呈负相关（P〈0.05）。结论 K ISS-1表达缺失和MMP-9过表达可能与胃癌的侵袭相关。     

5-杂氮-2’脱氧胞苷对肝癌细胞中TIMP-3基因的作用

目的观察多株肝癌细胞中TIMP-3CpG岛的甲基化状况,观察甲基化药物5-杂氮-2’脱氧胞苷对肝癌细胞株中TIMP-3基因表达及其CpG岛甲基化程度的影响。方法运用MSP定性检测8株肝癌细胞中TIMP-3CpG岛甲基化状况。使用去甲基化药物5-杂氮-2’脱氧胞苷对甲基化阳性的细胞株进行于预,观察干预组与对照组TIMP-3基因表达差异,并使用焦磷酸测序技术定量检测CpG岛甲基化差异。结果在8株肝癌细胞系中C3A、Hep-3B、HepG23株检测到TIMP-3CpG岛甲基化阳性。经去甲基化药物干预后,在这3株肝癌细胞中均发现TIMP-3mRNA的表达较对照组有明显上调（P〈0．05）,CpG岛的甲基化率下降（P〈0．05）。结论甲基转移酶抑制剂能显著降低肝癌细胞株TIMP-3CpG岛甲基化程度及上调TIMP-3mRNA的表达。     

18β-GA对人高转移卵巢癌HO-8910PM细胞增殖、黏附和侵袭能力的影响

目的观察18β-甘草次酸（18β-GA）对人高转移卵巢癌HO-8910PM细胞增殖、黏附和侵袭能力及黏附斑激酶（FAK）、基质金属蛋白酶（MMP）-9表达的影响。方法将18β-GA作用于HO-8910PM细胞,采用MTT法检测HO-8910PM细胞增殖抑制率;细胞黏附试验检测细胞黏附能力;Transwell chamber法检测细胞侵袭能力;Westernblot法检测细胞FAK、MMP-9蛋白表达水平。结果 18β-GA明显抑制高转移卵巢癌细胞HO-8910PM的生长增殖、黏附和侵袭能力;Western blot法检测表明药物能下调FAK、MMP-9蛋白的表达。结论 18β-GA可抑制HO-8910PM细胞黏附、侵袭,其机制可能是通过下调FAK、MMP-9蛋白表达而进行的。     

NF-κB基因对胰腺癌细胞侵袭作用的影响及机制

目的探讨NF-κB基因对胰腺癌细胞侵袭的影响及机制。方法应用NF-κB基因小于扰RNA（siRNA）转染处理人胰腺癌PANC-1细胞,采用Westernblot方法检测NF-KB蛋白水平,采用Boyden小室模型试验检测癌细胞侵袭能力。收集转染48h的癌细胞,采用包含有96个转移相关基因的芯片检测基因表达情况;根据基因芯片结果,随机抽取3个表达明湿变化的基因采用荧光实时定量PCR（RT—PCR）验证基因芯片结果。结果转染组癌细胞NF-κB蛋白水平下调（P〈0．05）,且与时间和浓度相关。与对照组比较,转染组细胞的穿膜细胞数减少（P〈0．05）,且呈浓度依赖关系。基因芯片检测发现,96个基因中有11个基因表达出现明显变化,其中9个基因明显下调,包括基质金属蛋白酶2（MMP-2）、MMP-7和血管内皮生长因子（VEGF）,有2个基因出现明显上调。采用荧光RT—PCR方法检测MMP-2、MMP-7、VEGF基因表达,结果也发现这3个基因表达下调,且下调幅度与基因芯片结果一致。结论NF-κB基因siRNA转染可明昆抑制胰腺癌细胞的锚着不依赖性增殖和恶性侵袭,其机制可能与下调MMP-2、MMP-7和VEGF有关。     

辛二酰苯胺异羟肟酸对鼻咽癌细胞回复引导半胱氨酸丰富蛋白含kazal基元以及基质金属蛋白酶9表达与活性的影响

目的探讨辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)对鼻咽癌细胞回复引导半胱氨酸丰富蛋白含kazal基元(reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs,RECK)以及基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)表达与活性的影响。方法体外培养鼻咽癌细胞系CNE-1,用0、0.1、1、5μmol/L SAHA处理后,采用蛋白质印迹法(Western blot)和Real-Time PCR(RT-PCR)分别检测RECK,MMP-9蛋白和mRNA表达;MTT法检测CNE-1细胞的增殖。同时采用明胶酶谱实验观察SAHA处理后MMP-9酶活性变化。结果随着SAHA浓度的增加,RECK蛋白和mRNA的表达显著增高(P0.05);随着SAHA浓度的增加,MMP-9蛋白和mRNA的表达显著降低(P0.05);CNE-1细胞随着SAHA浓度的增加,存活率逐渐降低(P0.05)。明胶酶谱实验显示,随着SAHA浓度的增加,MMP-9酶活性逐渐降低。结论 SAHA可能通过上调RECK基因的表达,抑制MMP-9的表达与活性而发挥对CNE-1细胞生长抑制作用。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对结肠腺癌细胞株Caco-2细胞生物学行为的影响

[目的]研究去甲基化5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人结肠腺癌细胞株Caco-2细胞生长周期及凋亡的影响,探讨其临床治疗的可能性。[方法]分别使用0.4、1.6、6.4、25.6、102.4μmol/L浓度的5-Aza-CdR处理Caco-2细胞;通过MTT检测5-Aza-CdR对Caco-2细胞存活率的影响;应用流式细胞检测5-Aza-CdR对Caco-2细胞生长周期及凋亡的影响;RT-PCR检测处理前后抑癌基因RASSF1A mRNA表达的改变。[结果]1.6μmol/L浓度的5-Aza-CdR可以明显的抑制Caco-2细胞的增殖,细胞周期中处于G0/G1期的细胞明显的增多,阻滞于G1期,凋亡率增高;5-Aza-CdR的作用与其浓度、时间在一定范围内呈正相关。5-Aza-CdR处理后,无RASSF1A表达的Caco-2细胞可检测出基因RASSF1A的重新表达。[结论]5-Aza-CdR可消除某些抑癌基因启动子甲基化状态,使其重新表达而抑制Caco-2细胞的生长,并促进其凋亡。