HL—60细胞内一种新的全反式维甲酸应答基因的克隆

利用差示ＰＣＲ技术从ＨＬ－６０细胞内克隆出一个新的,差异表达的ｃＤＮＡ片段,并并其命名为Ｗ－１基因,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交证实,用全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）诱导ＨＬ－６０细胞分化时,Ｗ－１基因的转录水平在诱导早期增加而在诱导２４ｈ后关闭,推测Ｗ－１基因可能在ＨＬ－６０细胞早期分化中有一定作用。     

一种简单有效的平端PCR产物克隆方法

介绍一种使用ｐＵＣ质粒做为载体进行平端ＰＣＲ产物连接的方法。首先将特异的ＰＣＲ扩增产物纯化，不经任何处理，与用ＳｍａⅠ内切酶消化的载体ｐＵＣ质粒进行连接，并在连接体系中加入ＳｍａⅠ内切酶，２３℃连接１８～２０小时。转化宿主菌后，挑选白色菌落进行重组鉴定。在ＰＣＲ产物＜５００ｂｐ的ＤＮＡ片段重组阳性率占转化菌白色菌落的７０％，而＞１０００ｂｐ的ＤＮＡ片段重组阳性率占转化白色菌落的１０～２０％。     

维甲酸诱导HL-60细胞凋亡的研究

目的：观察维甲酸（ＲＡ）在体外诱导ＨＬ６０细胞（人早幼粒细胞白血病细胞株）凋亡的作用,探讨维甲酸治疗早幼粒细胞白血病的作用机制。方法：用ＤＮＡ电泳、ＤＮＡ片段定量测定技术、流式细胞术分析及光镜和电镜观察凋亡细胞。结果：在体外培养中加维甲酸５０ｍｇ／Ｌ孵育４ｈ,ＤＮＡ片段率达５５７％±１２１％,而对照为１２５％±４９％（Ｐ＜０００１,ｎ＝９）;流式细胞术检测发现,在５０ｍｇ／Ｌ维甲酸作用下,细胞凋亡达５０％,对照为９％。电镜观察维甲酸组ＨＬ６０细胞出现典型的凋亡细胞形态改变。维甲酸诱导ＨＬ６０细胞凋亡具有剂量及时间依赖性,维甲酸作用６ｈ,出现凋亡高峰;随维甲酸浓度升高,诱导凋亡作用明显增强。在环孢素Ａ（ＣｓＡ）存在时,低浓度的维甲酸也有明显诱导ＨＬ６０细胞凋亡作用。结论：维甲酸在体外能诱导ＨＬ６０细胞凋亡,ＣｓＡ能增强维甲酸诱导ＨＬ６０细胞凋亡活性。研究提示诱导白血病细胞凋亡是维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病的重要机制之一。     

全反式维甲酸诱导HL60细胞凋亡及相关信号途径的改变

目的 研究全反式维甲酸(ATRA)诱导早幼粒细胞白血病细胞株(HL60细胞)凋亡及其分子机制。方法 HL60细胞经ATRA诱导不同时间，用活细胞记数法检测细胞增殖情况；用流式细胞术(FCS)检测HL60细胞凋亡及细胞周期的改变；用核酸提取及电泳技术检测细胞DNA分子的变化；用透射电镜技术观察了凋亡细胞的结构改变；用Western blot技术检测了ATRA诱导HL60细胞与凋亡有关的分子改变。结果 ATRA诱导HL60细胞第3天出现细胞增殖抑制且FCS发现细胞出现S期阻滞，开始出现凋亡，第5天出现明显的细胞增殖抑制及更高的凋亡比例，核酸电泳发现DNA“梯带”现象；对照组细胞在透射电镜下核大而圆，折光性低，染色质均匀；而ATRA处理5d的细胞出现核固缩、染色质浓缩边集及出现凋亡小体。同时细胞内ATRA核受体在诱导第3天开始表达增加，相应地与细胞凋亡相关的酶——半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)也表达增加，而磷酸化的Erk／STAT水平明显下调。结论 ATRA可以诱导HL60细胞发生凋亡，其机制可能为：ATRA诱导细胞后，RAR信号途径被激活，导致与凋亡相关的信号途径被激活(Caspase3表达上调)，而与细胞增殖相关的信号途径被阻断(p-Erk／p-STAT水平下降)，引起细胞增殖阻滞，发生凋亡。     

全反式维甲酸对急淋白血病骨髓基质细胞粘附能力的影响

[目的]探讨全反式维甲酸(ATRA)对急性淋巴细胞自血病(ALL)骨髓基质细胞(BMSC)粘附能力的影响.[方法]将ATRA加进骨髓基质细胞培养体系,培养18 h后用流式细胞仪检测6例ALL骨髓基质细胞表达粘附分子ICAM-1和VCAM-1阳性率,用MTT方法检测ALL骨髓基质细胞对正常骨髓造血细胞或淋巴瘤Raji细胞的粘附率.[结果]药理浓度的ATRA(1.0 μmol/L)使ALL骨髓基质细胞ICAM-1表达明显增高(P<0.05),使ALL骨髓基质细胞对正常骨髓造血细胞或肿瘤细胞的粘附率均明显增高(P<0.05).[结论]药理浓度的ATRA可增强ALL骨髓基质细胞对正常造血细胞和肿瘤细胞的粘附能力.     

全反式维甲酸与紫杉醇、阿霉素联合诱导HL-60细胞凋亡的研究

目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)分别与紫杉醇(Taxol)、阿霉素(ADR)单独或联合孵育HL-60细胞株能否增强凋亡诱导作用,并进一步研究bcl-2基因及家族bax、bcl-x基因在此过程中的作用。方法:1用台盼兰拒染法观察细胞生长活力;2在光镜和电镜下观察细胞形态变化;3用流式细胞仪(FCM)检测药物孵育前后细胞凋亡率(AP)的变化;4用RT-PCR法检测药物孵育前后bcl-2基因及其家族bax、bcl-x基因的表达水平。结果:1ATRA能增强Taxol和ADR对HL-60细胞的生长抑制作用;2ATRA能增强HL-60细胞对Taxol和ADR诱导的细胞凋亡;3在ATRA与Taxol、ADR联合诱导的HL-60细胞凋亡中,bcl-2、bcl-xl基因表达下降,bax、bcl-xs基因表达增加。结论:ATRA能增加Taxol和ADR对HL-60细胞的生长抑制作用及凋亡诱导作用,bcl-2基因及家族bax、bcl-x基因参与了ATRA与Taxol、ADR联合诱导细胞凋亡的调控。     

全反式维甲酸联合亚砷酸对NPM1阳性老年非早幼粒细胞急性髓细胞白血病患者的疗效分析

【摘要】 目的 研究全反式维甲酸（ATRA)联合亚砷酸(ATO)对NPM1阳性老年非早幼粒细胞急性髓细胞白血病（ non APL AML）患者的疗效。方法 选取2012年2月～2017年2月我院收治的NPM1老年非早幼粒细胞AML患者76例为研究对象。将其按照随机数字表法均分成观察组和对照组,每组各38例。对照组予以小剂量阿糖胞苷（LDAC）化疗,观察组则在LDAC基础上联合ATO及ATRA化疗。分别比较两组早期死亡率、完全缓解率、复发率情况,不良反应发生情况以及1年生存率情况。结果 观察组完全缓解率高于对照组,而复发率低于对照组,差异有统计学意义（均P＜005）。两组肝功能损害、胃肠道反应以及头痛发生率比较差异无统计学意义（均P＞005）。观察组1年生存率高于对照组,差异有统计学意义（P＜005）。结论 应用ATRA联合ATO及LDAC使老年NPM1阳性 non APL AML患者完全缓解率,降低复发率,延长1年生存率,具有较高的安全性,值得临床进一步研究。     

全反式维甲酸诱导HL60细胞分化的细胞周期时相性研究

目的　探讨全反式维甲酸诱导分化的HL6 0细胞周期变化 ,进一步揭示细胞分化在细胞周期中的时相特异性。方法　以分化诱导剂全反式维甲酸 (终浓度为 10 μmol/L)影响下不同时间点的HL6 0细胞为检测对象 ,应用流式细胞术分析细胞的大小及细胞表面的分化标志 ;碘化丙啶 (PI)染色后用激光共聚焦显微镜观察细胞形态从而对已分化细胞进行确认 ;应用流式细胞术分析药物诱导的细胞周期变化 ,检测G1期的Ki6 7表达水平 ;再应用流式分选术结合激光共聚焦显微镜观察各期细胞形态。结果　①随着药物诱导时间的延长 ,细胞的体积逐渐增大 ,被诱导的细胞出现髓系细胞表面的分化标志物CD11b。②全反式维甲酸导致HL6 0细胞周期的G0 /G1峰升高 ,S期水平下降。③随着药物诱导时间的延长 ,G1期的Ki6 7的表达水平逐渐下降。④只在G1期细胞中可见到已分化细胞。结论　全反式维甲酸可以诱导HL6 0细胞周期的G1早期→G1晚期阻滞 ,并诱导HL6 0沿着粒系方向分化 ,细胞分化完成于细胞周期中的G1早期。     

维甲酸诱导分化小鼠淋巴瘤SACIIB_2克隆细胞的作用和机理

研究了ＲＡ对ＳＡＣＩＩＢ２克隆细胞的促分化作用。结果表明，受ＲＡ处理后，ＳＡＣ－ＩＩＢ２克隆细胞形态的改变及生长抑制不因培养液中去除ＲＡ而立即消失，瘤细胞酸性非特异性酯酶（ＡＮＡＥ）染色阳性率明显升高，细胞内嘌呤核苷磷酸化酶（ＰＮＰ）活性明显升高，而腺苷脱氨酶（ＡＤＡ）活性明显降低，末端脱氧核苷酰转移酶（ＴｄＴ）的表达有所减弱，而ＲＡ处理前后瘤细胞乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）同工酶谱型无明显改变，提示ＲＡ对ＳＡＣＩＩＢ２克隆细胞有一定程度的诱导分化作用。对ＲＡ处理前后ＳＡＣＩＩＢ２，细胞３－ｆｏｓ基因表达情况也作了初步观察和分析。     

全反式维A酸诱导HL-60细胞分化的判定

目的: 建立一种可靠的肿瘤细胞分化模型,确立一套简便、准确判定肿瘤细胞是否分化的方法。方法: 以分化诱导剂全反式A酸(ATRA)影响下不同时间点的HL-60细胞为检测对象,流式细胞术分析细胞大小及细胞表面的分化标志物;经碘化丙锭染色后,用激光共聚焦显微镜观察对已分化细胞进行形态学确认。结果: 随着药物诱导时间的延长,被诱导的HL-60细胞体积逐渐增大;72 h后,被ATRA诱导细胞开始表达分化标志物CD11b并出现细胞核型的变化。结论: ATRA能诱导HL-60细胞分化;流式细胞术分析细胞大小及细胞表面的分化标志物,再用激光共聚焦显微镜观察已分化细胞核的形态变化,是判定肿瘤细胞分化简便、准确的方法。     

全反式维甲酸对HL-60细胞NF-kB、 Cyclin D1表达的影响

目的探讨全反式雏甲酸（ATRA）对HL-60细胞周期、NF-kB和Cyclin D1表达的影响。方法采用不同浓度的ATRA作用于HL-60细胞，于48h后收集细胞，用流式细胞术分析HL-60细胞周期、NF-kB和Cyclin D1表达的变化。结果维甲酸纽HL-60细胞G1期细胞比值升高，S期细胞比例下降，NF-kB、Cyclin D1表达均下降，其中10^-7M、10^-6M浓度组与对照纽相比差异均有显著性（P〈0．05），而10^-8M浓度组却差异均无显著性（P〉0．05）；维甲酸10^-6M浓度组NF-kB、CyclinDI的表达呈显著正相关（r=0．55．P〈0．0l，n=12）。结论全反式维甲酸（ATRA）通过下调NF-KB抑制CyclinDl活性表达，可能是其阻滞细胞周期诱导HL-60细胞分化的机制。     

Expression of cyclin-dependent kinases in HL-60 cells during differentiation induced by retinoic acid

DanticadvanceshavebeenmadeintheunderstandingofthemechanismregUlatingcellcycle.TheprogreSsionofcellcycleinmammaliancellsisdependentontheformation,activationandinactivationofthedtherentcyclin/cyclin-dependentkinasecomplexatappropriateti..[1'.AnumberofstUdiesdemonsrmtedthattheprogressionofcellcyclethroughG,-Stransitionwascontrolledbytheactivitiesofeec"and/""ofthecyclindependentkinase(CDK)fdrily.MoreoverP""andacornareundertheregUlationofcyclinEandcyclinDrespectively""3.Retinoicacid(RA)andoth…     

Notch1在全反式维甲酸诱导的神经干细胞分化中的作用

目的 探究Notch1在全反式维甲酸诱导的神经干细胞分化中的作用,揭示其对神经管发育的影响。 方法 免疫荧光检测神经干细胞标记物——巢蛋白(Nestin)、神经元标记物——神经丝蛋白(NF)、星型胶质细胞标记物——神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及少突胶质细胞标记物——半乳糖脑苷脂(GALC)及Notch1在上述细胞中的分布。Western blotting检测神经干细胞中Notch1、NF、GFAP、GALC分别在普通分化培养基和全反式维甲酸培养基(ATRA)中1、3、5、7 d的含量。神经干细胞分为4组:将普通分化培养基设为A组,普通分化培养基+DMSO组设为B组,普通分化培养基+DMSO+25 μmol/L γ-内分泌酶抑制剂(γSI)组设为C组,普通分化培养基+DMSO+50 μmol/L γSI设为D组,Western blotting检测各组细胞中Notch1含量。 结果 免疫荧光鉴定Nestin、NF、GFAP、GALC呈阳性,且在上述细胞胞膜上及胞质中有Notch1存在。普通分化培养基中Notch1在第5天较第1天明显增加,NF在第5天较第3天明显降低,GFAP与GALC含量在第5天较第1天明显下降。加入ATRA的普通分化培养基中,Notch1在第7天较第1天明显减少,而NF、GFAP、GALC在第7天较第1天明显增加。加入γSI后,Notch1胞内段NICD含量明显降低。 结论 Notch1信号通路抑制神经干细胞分化,ATRA通过抑制Notch1促进神经干细胞的分化。     

全反式维甲酸诱导分化的HL-60细胞表面凝集素受体的变化

目的：了解人类早幼粒细胞性白血病细胞株（HL-60）细胞经全反式维甲酸诱导分化后各时相细胞表面5种凝集素受体的变化.方法：以刀豆凝集素（ConA）、麦胚凝集素（WGA）、花生凝集素（PNA）、蓖麻凝集素（RCA）、荆豆凝集素（UEA-1）共5种Na^125I-凝集素,标记经全反式维甲酸诱导分化的HL-60细胞,检测各时相细胞表面凝集素受体的变化.结果：HL-60细胞从幼稚分化发育至成熟各阶段中,细胞表面与UEA-1、WGA、ConA结合的凝集素受体有增多的趋势,诱导分化前后各凝集素放射活性比较有显著性差异（P＜0.05）,其中WGA放射活性在分化前后明显增加,而与PNA结合的凝集素受体在HL-60细胞分化过程中呈减少的趋势,在诱导分化后期减少最为明显,诱导分化前后放射活性比较有显著性差异（P＜0.05）.结论：D-半乳糖-N-乙酰氨基半乳糖结构主要表达于HL-60细胞早幼粒阶段,随着细胞的分化成熟而显著减少,其可能是肿瘤特异性抗原.HL-60细胞在经全反式维甲酸诱导分化过程中,细胞膜上含L-岩藻糖糖链结构增多,N-乙酰氨基葡萄糖结构增多和/或唾液酸化作用增强,并出现D-葡萄糖和/或D-甘露糖糖链结构.     

全反式维甲酸和苯乙酸钠联合对人肝癌细胞的诱导分化作用

目的　探讨全反式维甲酸 (ATRA)和苯乙酸钠 (Na-PA)两者对人肝癌细胞联合作用 .方法　应用台盼蓝染色、MTT法、流式细胞仪、甲胎蛋白测定等方法检测 ATRA和Na PA两者联合对人肝癌细胞的诱导分化作用 .结果　 10μmol· L- 1 ATRA,2 .5 mmol· L- 1 Na PA及两者联合作用 ,可抑制人肝癌细胞株 SMMC- 772 1细胞的生长 ,使细胞恶性表型向正常转化 ,其联合作用组 7d抑制率达 6 6 .5 % ,并能明显降低甲胎蛋白的分泌量 4 9.2 % ,使细胞周期 G0 / G1 期延长5 8.7% ,S期下降 35 .8% (P<0 .0 5 ) ,影响 DNA合成 ,最终产生抑制增殖诱导细胞分化的作用 .结论　 ATRA,Na PA及两者联合应用均可抑制 SMMC- 772 1细胞生长 ,诱导细胞分化 ,ATRA和 Na PA联合对人肝癌细胞的诱导分化有协同作用 .     

Influence of all-trans retinoic acid(ATRA) on the expression of NANOG in Glioma cell lines

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全反式维甲酸对卵巢癌细胞系作用的研究

目的：探讨全反式维甲酸（ATRA）对人卵巢细胞生长的抑制作用及可能机制。方法：应用MTT比色法、LDH检测及流式细胞仪周期分析对药物作用后的人卵巢癌腹水细胞系（COC1、COC2）、卵巢癌上皮细胞系（CA-OV3）3种卵巢癌细胞系进行检测。结果：ATRA能抑制卵巢癌细胞生长，当浓度达10μmol/L时，G0、G1期细胞比例增加，G2M、S期细胞比例下降，细胞增殖速度较对照组减缓。MTT及LDH检测提示在ATRA30μmol/L时，癌细胞抑制率最佳。结论：ATRA应用可有效抑制卵巢癌细胞增殖，促进细胞分化，从而达到抑瘤作用，并在ATRA10-30μmol/L时，作用最佳。     

视黄酸和α-干扰素对带有视黄酸反应元件的LUC报告基因表达的调控作用

目的：探讨视黄酸（Retinoic acid,RA）通过视黄酸反应元件（RARE）调控外源基因表达的可行性。方法：构建带有视黄酸受体β（RARβ）基因增强子区域RARE的荧光素酶（Luciferase,LUC）报告基因表达载体，应用脂质体包裹RARE－TK－LUC和RARE3－TK－LUC质粒，并转染HL－60细胞，48h后，用RA和／或α-干扰素（IFNα)处理不同时间，用LUC报告基因检测试剂盒分析LUC报告基因活性。结果：经RA处理不同时间后，RARE－TK－LUC和RARE3－TK－LUC质粒转染细胞的LUC相对活性分别较未经处理的转染细胞增加12－38和20－85倍；单用IFNα处理转染细胞，对LUC的表达无明显的诱导作用；IFNα和RA联合处理48、72h，LUC相对活性比单用RA处理增加60％－70％。结论：RA可调控带有RARE的LUC报告基因的表达，说明应用RARE构建RA可调控的目的基因表达载体是可行的。