柴胡皂苷A通过Wnt/β-catenin通路改变A549/DDP细胞耐药性

目的 探讨柴胡皂苷A（SSA）逆转人肺癌顺铂（DDP）耐药株A549/DDP的作用及机制。方法 细胞增殖与活性检测（CCK-8）法检测A549和A549/DDP对DDP的耐药性及SSA对A549和A549/DDP细胞活力的影响；流式细胞术检测A549/DDP凋亡率和细胞中活性氧（ROS）的变化；实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测C-myc，B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3） mRNA的表达情况；TopFish双荧光素酶报告基因检测β-连环蛋白（β-catenin）的转录活性；蛋白免疫印迹法（Western blot）法检测A549/DDP细胞中β-catenin蛋白的变化。结果 CCK-8检测结果显示，A549/DDP的耐药性是A549的12.82倍，差异具有统计学意义（P<0.05），SSA能够抑制A549的细胞活力，其半数抑制浓度（IC₅₀）为34.9 μmol·L^-1。SSA抑制 A549/DDP细胞的活力并具有浓度依赖性，在20 μmol·L^-1浓度时，对A549/DDP的抑制率<10%，选择20 μmol·L^-1作为逆转浓度；流式结果显示，与空白组比较，DDP组A549/DDP的凋亡比例明显升高，细胞内活性氧的累积明显增加（P<0.05），与DDP组比较，SSA+DDP组A549/DDP的凋亡比例明显升高，细胞内活性氧的累积明显增加；与空白组比较，DDP组A549/DDP细胞中C-myc，Bcl-2 mRNA表达明显降低，Caspase-3 mRNA表达明显升高（P<0.05），与DDP组比较，SSA+DDP组C-myc，Bcl-2 mRNA表达明显降低，Caspase-3 mRNA表达明显升高（P<0.05）；与空白组比较，DDP组β-catenin的转录活性明显降低（P<0.05），与DDP组比较，SSA+DDP组β-catenin的转录活性明显降低（P<0.05）；与空白组和DDP组比较，SSA+DDP组β-catenin蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 柴胡皂苷A可以提高A549/DDP细胞对DDP的敏感性，其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路激活有关。     

黄连解毒汤对Aβ1-42诱导AD大鼠学习记忆能力及胆碱能系统的影响

目的 探讨黄连解毒汤对β-淀粉样蛋白（Aβ）_1-42诱导阿尔茨海默病（AD）模型大鼠学习记忆能力和胆碱能系统的影响。方法 选用60只雄性SD大鼠，分为正常组，模型组，石杉碱甲组（2.1×10^-5 g·kg^-1），黄连解毒汤高、中、低剂量组（6，3，1.5 g·kg^-1）。运用Aβ_1-42海马注射复制AD大鼠模型，术后连续灌胃治疗4周，进行Morris水迷宫实验。苏木素-伊红（HE）染色观察大鼠海马病理改变，腹主动脉取血，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测大鼠血清、海马中乙酰胆碱（ACh），乙酰胆碱酯酶（AchE），胆碱乙酰转移酶（ChAT）含量；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测海马α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAChR）蛋白表达；实时荧光定量聚合酶链式反应法（Real-time PCR）检测海马α7nAChR mRNA表达。结果 与正常组比较，模型组动物脑组织皮质区神经元坏死、海马区锥体细胞或颗粒细胞坏死、排列紊乱和炎性细胞浸润等病理改变明显，大鼠逃避潜伏期延长、逃逸平台次数降低、有效区域停留时间、有效区域游泳路径均减少（P<0.05，P<0.01），血清中ACh，ChAT浓度降低（P<0.01），海马中ACh，AchE，ChAT含量，α7nAChR蛋白，α7nAChR mRNA表达降低（P<0.01）；与模型组比较，黄连解毒汤中剂量组逃避潜伏期变短（P<0.05），逃逸平台次数、有效区域游泳路径、有效区域停留时间增加（P<0.05，P<0.01），血清ACh，ChAT含量和海马AchE，ChAT，α7nAChR mRNA表达上升（P<0.05），海马α7nAChR蛋白表达升高明显（P<0.01）；高剂量组有效区域有效区域停留时间延长（P<0.01）；逃逸平台次数增加，血清ACh，ChAT含量和海马ACh，AchE，α7nAChR蛋白，α7nAChR mRNA表达上升（P<0.05）。结论 黄连解毒汤可显著改善Aβ_1-42诱导AD大鼠学习记忆能力，其作用机制可能与改善Aβ_1-42所导致的胆碱能系统损伤，增强胆碱能系统功能有关。     

苓桂术甘汤促进星形胶质细胞内化降解β淀粉样蛋白机制

目的 通过观察苓桂术甘汤（LGZGT）含药血清对β淀粉样蛋白1-42（Aβ_1-42）诱导大鼠原代星形胶质细胞（AS）阿尔茨海默病（AD）病理模型的影响,探讨LGZGT对Aβ的吞噬及降解作用。方法 以Aβ_1-42诱导AS建立AD模型,实验分为正常组、模型组、LGZGT低、中、高剂量（LGZGT-L、LGZGT-M、LGZGT-H）含药血清组（1.2、2.4、4.8 g·kg^-1）、盐酸多奈哌齐含药血清组（0.5 mg·kg^-1）,模型组加入Aβ_1-42,终浓度为10 μmol?L^-1,LGZGT-L、LGZGT-M、LGZGT-H含药血清组在模型组的基础上均加入10%的含药血清。通过细胞增殖活力检测（CCK-8）试剂盒检测各组细胞活力;乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒检测各组细胞LDH活力;用倒置显微镜观察各组细胞形态;采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测Aβ相关降解酶胰岛素降解酶（IDE）、组织蛋白酶D（CTSD）的表达;采用免疫荧光法测定组织蛋白酶B（CTSB）的荧光强度;采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测各组细胞Aβ_1-42含量。结果 与空白组比较,各组AS活力下降,且不同浓度的Aβ_1-42对AS的增殖具有抑制作用;给药后,与正常组比较,模型组的细胞存活率明显降低（P<0.05）;与模型组比较,LGZGT-H、盐酸多奈哌齐含药血清组细胞存活率明显增加（P<0.05,P<0.01）;与正常组比较,模型组的细胞的LDH活力明显升高（P<0.05）,且细胞胞体肥大肿胀,突起增多且延长,细胞相互聚集成团,提示细胞损伤较为明显;与模型组比较,盐酸多奈哌齐、LGZGT-L、LGZGT-M、LGZGT-H含药血清组细胞LDH活力显著降低（P<0.01）;给药后,LGZGT-M组、LGZGT-H、盐酸多奈哌齐含药血清组细胞胞体肿胀有所改善,细胞突起短,细胞聚集结团减少;与正常组比较,模型组IDE、CTSD的表达明显降低（P<0.05）;与模型组比较,LGZGT-M、LGZGT-H含药血清组能够明显上调IDE的表达（P<0.05）;与模型组比较,LGZGT-L、LGZGT-M、LGZGT-H、盐酸多奈哌齐含药血清组均能明显上调CTSD的表达（P<0.01）;与正常组比较,模型组的CTSB的平均荧光强度明显降低（P<0.05）,与模型组比较,LGZGT-L、LGZGT-M、LGZGT-H、盐酸多奈哌齐含药血清组CTSB平均荧光强度增强（P<0.05,P<0.01）;与正常组比较,模型组的细胞胞内Aβ_1-42含量升高（P<0.05）;给药后,与模型组比较,LGZGT-L、LGZGT-M、LGZGT-H、盐酸多奈哌齐含药血清组细胞胞内Aβ_1-42含量显著降低（P<0.01）,LGZGT含药血清以剂量依赖性的形式降低Aβ_1-42。结论 LGZGT对Aβ_1-42诱导的AS具有保护作用,还可促进Aβ的降解,其机制可能与减轻Aβ毒性,增强细胞活力,促进IDE、CTSD、CTSB的表达及恢复溶酶体的功能相关。     

当归芍药散通过调控NLRP3/Caspase-1信号通路抑制AD大鼠神经炎症的作用

目的 研究当归芍药散对β淀粉样蛋白_1-42（Aβ_1-42）诱导的阿尔茨海默病（AD）大鼠模型的神经保护作用及对NOD样受体3（NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1）信号通路的调控作用。方法 大鼠脑内注射Aβ_1-42构建AD动物模型,给予不同浓度的当归芍药散治疗。实验分为假手术组,模型组,当归芍药散高、中、低剂量干预组。Morris水迷宫实验检测动物学习记忆能力;苏木素-伊红（HE）染色和高尔基染色检测神经元形态功能;免疫荧光共定位检测NLRP3炎症小体活化情况;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测炎症因子白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-18 mRNA表达情况;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测NLRP3,Caspase-1,IL-1β蛋白的表达水平。结果 与假手术组比较,模型组大鼠学习记忆能力显著降低（P<0.01）;神经元形态功能受损;炎症因子IL-1β和IL-18 mRNA表达升高,NLRP3炎症小体活化增加,NLRP3,Caspase-1,IL-1β蛋白表达显著升高（P<0.01）;与模型组比较,给予当归芍药散中、高剂量干预后,AD大鼠学习记忆能力明显增加（P<0.05,P<0.01）;神经元形态功能明显恢复;炎症因子IL-1β和IL-18 mRNA表达显著降低,NLRP3炎症小体活化减少,NLRP3,Caspase-1,IL-1β蛋白表达显著降低（P<0.01）。结论 当归芍药散可能通过调控NLRP3/Caspase-1信号通路抑制炎症小体活化,抑制神经炎症反应,从而发挥神经保护作用。     

五味子根、茎、叶、果多糖对D-半乳糖致衰老小鼠运动耐力的影响

目的 观察五味子根、茎、叶、果多糖对D-半乳糖所致衰老小鼠运动耐力的影响。方法 将雄性ICR小鼠随机分为空白组、模型组、五味子根多糖组、茎多糖组、叶多糖组及果多糖组，分别给予蒸馏水及总糖含量为35 mg·kg^-1的根、茎、叶及果粗多糖灌胃，30 min后，除空白组皮下注射生理盐水外，其他组均皮下注射300 mg·kg^-1D-半乳糖，每日1次，持续6周。通过转棒实验、前肢握力实验和负重游泳实验评价抗疲劳能力；通过化学比色法检测小鼠血清中尿素氮（BUN）、乳酸（LD）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和活性氧（ROS）等疲劳和氧化相关指标；用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测小鼠骨骼肌细胞中促凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）相关X蛋白（Bax）、抗凋亡蛋白Bcl-2及活化型胱天蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）的表达情况。结果 在疲劳转棒实验中，与空白组比较，模型组小鼠转棒停留时间显著缩短（P<0.01）；与模型组比较，五味子根、茎及果多糖组小鼠转棒时间均显著增加（P<0.01）；前肢握力实验，与空白组比较，模型组小鼠前肢握力显著缩短（P<0.01），与模型组比较，五味子根、茎、叶及果多糖组小鼠前肢握力显著增加（P<0.01）；负重游泳实验，与空白组比较，模型组小鼠负重游泳时间显著缩短（P<0.01），与模型组比较，五味子根、茎、叶及果多糖组小鼠负重游泳时间显著延长（P<0.01）；生化试剂盒检测显示，与空白组比较，模型组小鼠BUN、LD含量及LDH、CK活性显著升高（P<0.01）；与模型组比较，五味子根、茎及果多糖组小鼠BUN含量及LDH活性明显下降（P<0.05，P<0.01），五味子根、茎、叶及果多糖组小鼠LD含量及CK活性明显下降（P<0.05，P<0.01）；与空白组比较，模型组小鼠SOD、GSH-Px活性显著下降（P<0.01），MDA、ROS含量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，根、茎及果多糖组小鼠SOD活性明显升高（P<0.05，P<0.01），ROS含量显著下降（P<0.01）；根、茎多糖组小鼠MDA含量显著降低（P<0.01），GSH-Px活性明显升高（P<0.05，P<0.01）；与空白组比较，模型组小鼠骨骼肌细胞中Bax和cleaved Caspase-3蛋白表达水平均增加（P<0.01），Bcl-2蛋白表达水平降低（P<0.01）；与模型组比较，五味子根、茎多糖组小鼠骨骼肌细胞中cleaved Caspase-3蛋白表达水平均明显降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表达水平增加（P<0.01）。结论 五味子根、茎、叶及果多糖对D-半乳糖所致衰老小鼠具有抗疲劳作用。上述作用可能与其提高机体抗氧化能力，抑制骨骼肌细胞凋亡有关。     

缺氧微环境下仙连解毒方抑制结直肠癌细胞增殖的作用及机制

目的 观察缺氧微环境下仙连解毒方对含溴结构域蛋白4（Brd4）诱导的核转录因子-κB（NF-κB）信号通路激活的影响,探讨其抑制结直肠癌细胞HT-29增殖的作用机制。方法 于缺氧培养箱或常氧培养箱中培养人结直肠癌细胞HT-29,给予仙连解毒方（0.8、1、1.2、1.6、3.2、6.4、12.8 g·L^-1）干预细胞48 h,采用噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞活力;采用线粒体膜电位荧光探针（JC-1）检测仙连解毒方（1.25、2.5、5 g·L^-1）对细胞线粒体膜电位的影响,采用流式细胞术检测结直肠癌细胞HT-29凋亡情况;细胞克隆形成实验及5-乙炔基-2''-脱氧尿苷（EDU）法检测结直肠癌细胞HT-29细胞增殖能力;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测Brd4及其下游蛋白如c-核蛋白类基因（c-Myc）、六亚甲基双乙酰胺诱导蛋白1（HEXIM1）的表达水平,同时检测仙连解毒方对NF-κB信号通路相关蛋白的影响。结果 与空白组比较,仙连解毒方（0.8、1、1.2、1.6、3.2、6.4、12.8 g·L^-1）组均能抑制结直肠癌细胞HT-29细胞活力（P<0.05,P<0.01）,且缺氧培养下细胞半数抑制浓度（IC₅₀）>常氧培养组。与空白组比较,仙连解毒方（1.25、2.5、5 g·L^-1）组细胞线粒体膜电位明显下降、细胞凋亡增多（P<0.05,P<0.01）。与空白组比较,仙连解毒方（1.25、2.5、5 g·L^-1）组细胞克隆数减少,EDU阳性细胞数减少（P<0.05,P<0.01）。Western blot结果示,与空白组比较,仙连解毒方（1.25、2.5、5 g·L^-1）组细胞内Brd4、c-Myc蛋白表达量均有不同程度的下降,HEXIM1表达升高（P<0.05,P<0.01）;磷酸化（p）-NF-κB p65、磷酸化NF-κB抑制蛋白α（p-IκBα）蛋白表达下调（P<0.05,P<0.01）。结论 缺氧微环境下仙连解毒方可抑制Brd4调控的结直肠癌细胞HT-29增殖,抑制NF-κB信号通路的激活可能是其机制之一。     

二苯乙烯苷对APP/PS1/Tau三转基因小鼠痴呆模型GSK3β，PKA，PP2A的影响

目的 观察二苯乙烯苷（TSG）对淀粉样前体蛋白/早老蛋白-1/Tau（APP/PS1/Tau）三转基因小鼠阿尔茨海默病（AD）模型脑组织中糖原合成酶激酶3β（GSK3β）,环磷酸腺苷依赖的蛋白激酶（PKA）,磷酸丝氨酰/磷酸苏氨酰蛋白磷酸酶2A（PP2A）的表达影响。方法 8月龄APP/PS1/Tau三转基因小鼠45只,随机分为模型组、石杉碱甲组（石杉碱甲,0.15 mg·kg^-1）,TSG低、中、高剂量组（TSG,0.033,0.1,0.3 g·kg^-1）,每组9只。另取同龄C5B7L/6J小鼠9只为正常组。各组灌胃60 d相应药物后,采用苏木素-伊红（HE）染色观察小鼠海马神经元的一般结构;免疫组化（IHC）检测各组小鼠脑组织PKA蛋白的表达;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测GSK3β,PKA,PP2A mRNA表达情况;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测GSK3β,PP2A蛋白表达情况。结果 与正常组比较,模型组小鼠神经元细胞的凋亡水平显著升高,GSK3β,PKA蛋白及mRNA表达水平显著升高（P<0.01）,PP2A蛋白及mRNA表达水平显著下调（P<0.01）;与模型组比较,各给药组小鼠神经元细胞凋亡水平显著下调,GSK3β,PKA蛋白及mRNA表达水平明显下调（P<0.05,P<0.01）,PP2A蛋白及mRNA表达水平明显升高（P<0.05,P<0.01）。结论 TSG治疗AD的机制可能与降低GSK3β和PKA mRNA表达水平与蛋白表达水平,提高PP2A的mRNA表达水平与蛋白表达水平等机制有关。     

三七皂苷通过抑制自噬减轻TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞损伤

目的 探讨三七皂苷（Panax notoginseng saponins,PNS）抗转化生长因子-β₁（TGF-β₁）诱导的肾小管上皮细胞损伤的作用及机制。方法 培养NRK-52E肾小管上皮细胞,分为空白组、TGF-β₁组、TGF-β₁+12.5 mg·L^-1 PNS组、TGF-β₁+25 mg·L^-1 PNS组、TGF-β₁+50 mg·L^-1 PNS组,PNS干预48 h,收集细胞及上清,采用倒置显微镜观察细胞形态;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测上皮间质转化（EMT）相关蛋白、自噬相关蛋白表达;流式液相多重蛋白定量技术检测炎症因子含量;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 与空白组比较,TGF-β₁诱导后细胞呈梭形改变且呈明显的EMT表现,即E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达明显下调（P<0.05）,α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达明显上调（P<0.05）,PNS处理后,大部分细胞形态趋向正常并逆转EMT的发生。同时,与空白组比较,TGF-β₁组肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平明显升高,IL-10水平下降,凋亡率增加（P<0.05）,PNS作用后,TNF-α水平下降,IL-10水平升高,细胞凋亡率明显下降（P<0.05）。并且TGF-β₁能明显上调肾小管上皮细胞自噬相关蛋白Beclin1和自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ（LC3Ⅱ/Ⅰ）的表达（P<0.05,P<0.01）,而PNS抑制其表达。结论 PNS对TGF-β₁诱导的肾小管上皮细胞具有保护作用,其机制可能是通过抑制自噬来减轻炎症和凋亡,进而抵抗TGF-β₁诱导的损伤。     

当归芍药散含药血清调控UPP途径对Aβ1-40损伤PC12细胞的保护作用及机制

目的 探讨当归芍药散（DSS）含药血清对β淀粉样蛋白（Aβ）_1-40损伤大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）细胞的保护作用及对泛素-蛋白酶体途径（UPP）的调控作用机制。方法 采用Aβ_1-40干预PC12细胞制备损伤模型。实验分为空白组、模型组、DSS含药血清高、中、低剂量组（10%、5%、2.5%）。细胞增殖与活性检测（CCK-8）法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测细胞Aβ和磷酸化（p）-Tau蛋白含量,免疫荧光细胞化学（ICC）标记UPP重要靶点泛素（Ub）、泛素连接酶E3（E3）、26S蛋白酶体、泛素羧基端水解酶1（UCHL1）和UCHL3蛋白的表达,实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测Ub、E3、26S、UCHL1、UCHL3 mRNA和蛋白的表达。结果 根据CCK-8实验结果,筛选5 μmol·L^-1、48 h为PC12细胞损伤最佳造模条件。与空白组比较,模型组细胞存活率降低（P<0.05）、凋亡率升高（P<0.05）,Aβ及p-Tau表达升高（P<0.05）,Ub蛋白及mRNA表达升高,26S、E3、UCHL1+3蛋白及mRNA表达降低（P<0.05）。与模型组比较,DSS中剂量组细胞存活率升高（P<0.05）;DSS各剂量组细胞凋亡率下降（P<0.05）;DSS各剂量组Aβ含量降低（P<0.05）,DSS高、中剂量组p-Tau 含量降低（P<0.05）;DSS各剂量组Ub mRNA表达降低（P<0.05）,DSS各剂量组26S mRNA表达升高（P<0.05）,DSS中剂量组UCHL1 mRNA表达升高（P<0.05）,DSS高、中剂量组E3和UCHL 3mRNA表达升高（P<0.05）;DSS各剂量组Ub蛋白表达降低,DSS高、中剂量组26S、E3、UCHL1+3蛋白表达升高,以DSS中剂量效果最佳。结论 DSS含药血清可提高细胞存活率、降低细胞凋亡率、清除Aβ和p-Tau蛋白沉积,对Aβ_1-40损伤PC12细胞有保护作用,其作用可能是通过调控UPP降低Ub表达及升高26S、E3、UCHL1及UCHL3表达来发挥。     

六味地黄丸含药血清对Aβ诱导SH-SY5Y细胞的自噬影响及机制研究＊

目的 研究六味地黄丸含药血清对Aβ诱导SH-SY5Y细胞的自噬影响及其机制，探讨阿尔茨海默病的病理机制及补肾填精法的作用机制。方法 30只大鼠随机分成对照组和六味地黄丸组两组，分别予以等量的双蒸水和含六味地黄丸粉末水溶液进行灌胃，末次灌胃结束后取血并分离血清备用。将SH-SY5Y细胞分为对照组、模型组和药物组，对照组和模型组给予含空白血清的完全培养液，药物组给予含含药血清的完全培养液，模型组和药物组加入Aβ1-42寡聚体，培养48 h。应用CCK-8法对各组进行细胞增殖率分析；免疫荧光法分析各组细胞内Aβ沉积情况；Western Blot法检测各组细胞BACE1、p62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达情况。结果 CCK-8结果显示，与对照组相比，模型组细胞增殖率显著降低（P<0.01）；与模型组相比，药物组细胞增殖率显著增高（P<0.01）。与对照组相比，模型组细胞内Aβ的沉积显著增加（P<0.01）；与模型组相比，药物组细胞内的Aβ沉积显著减少（P<0.01）。Western Blot结果显示，与对照组相比，模型组细胞的BACE1、Beclin1的蛋白表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值显著升高（P<0.01），p62的蛋白表达量显著降低（P<0.01）；与模型组相比，药物组细胞的Beclin1的蛋白表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值显著升高（P<0.01），BACE1和p62的蛋白表达量显著降低（P<0.01）。结论 六味地黄丸含药血清可以增加Aβ诱导的SH-SY5Y细胞自噬相关基因的表达，上调自噬水平，减轻细胞损伤，对细胞具有明显的保护作用。