反义RNA应用于抗HBV、HCV肝炎病毒的研究进展

HBV、HCV是引起慢性肝炎以及肝硬化、肝细胞肝癌等相关疾病的重要病原体，而有效防治此类肝病的关键在于抗病毒，反义核酸技术自发现以来不断发展，其在分子水平抑制肝炎病毒有着巨大潜力，本文就近年来反义RNA在抗HBV、HCV方面的研究应用作一综述。     

丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶及抑制剂研究进展

丙型肝炎病毒(heptitis cvirus，HCV)丝氨酸蛋白酶(serine protease)是催化病毒前体蛋白中非结构蛋白部分裂解的关键蛋白酶。对病毒复制和宿主细胞都有重要作用，是当前抗病毒研究的一个重要靶点。本文从丝氨酸蛋白酶结构、功能和抑制剂等三方面，介绍丝氨酸蛋白酶的研究进展，这对该酶抑制研究和丙型肝炎的治疗研究会有积极意义。     

含有丙型肝炎病毒核心基因表达质粒的构建及其基因免疫

目的：研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫诱生特异性免疫应答的可行性。方法：将ＨＣＶ Ｃ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游,构建真核表达载体ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,分别转染小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０和人肝癌细胞７７２１进行瞬时表达,用免疫荧光法和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物,将重组质粒注射,ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２＾ｄ）小鼠股四头肌,ＥＬＩＳＡ法检测血清中抗体产生水     

丙型肝炎病毒的体外培养

本文综述了丙型肝炎病毒（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ，ＨＣＶ）体外细胞培养研究的最新进展情况，分析了体外细胞培养ＨＣＶ时需要注意的一些重要因素及目前存在的主要问题。     

丙型肝炎病毒体外细胞培养系统和动物模型的研究现状

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）体外细胞培养系统和动物模型的研究涉及到ＨＣＶ复制、致病机理、临床诊断和疫苗研制等多方面，是ＨＣＶ研究的基础和前题。本文简要介绍了ＨＣＶ体外细胞２和动物模型的研究现状，展望了其发展趋势。     

反义寡核苷酸抗丁型肝炎病毒基因组RNA中核酶的研究

以质粒ｐＳＶＬＤ３为模板，通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增得到１条１３９ｂｐ的片段，它含有丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）基因组ＲＮＡ中核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ）区的ｃＤＮＡ，该核酶具有自身裂解功能，将此片段插入到ｐＧＥＭ－３Ｚ中，经筛选，鉴定得到重组质粒ｐＨＤＶ１０８，经测序发现有２个碱基变异。以该质粒为模板，通过Ｔ７ＲＮＡ聚合酶，转录出核酶的前体，并观察到其自身裂解产物，自裂率达７１％，针对核酶唯一的自裂位     

反义RNA应用于抗HBV、HCV肝炎病毒的研究进展

HBV、HCV是引起慢性肝炎以及肝硬化、肝细胞肝癌等相关疾病的重要病原体,而有效防治此类肝病的关键在于抗病毒,反义核酸技术自发现以来不断发展,其在分子水平抑制肝炎病毒有着巨大潜力,本文就近年来反义RNA在抗HBV、HCV方面的研究应用作一综述.     

丙型肝炎病毒基因编码的蛋白及其功能

丙型肝炎病毒(HCV)基因组是一单股正链RNA，全长9600个碱基对(bp)，含有一个大的开放读码框架(ORF)，编码约3010个氨基酸的病毒前体蛋白，HCV基因组5′端(5′UTR)和3′端(3′UTR)为非翻译区，或称非编码区(UCR)，前者位于ORF上游；后者位于下游，含有poly A或ply U尾巴。     

输血后丙型肝炎病毒血症,抗体及转氨酶动态研究

对１０例输血后丙型肝炎进行了病毒血症、抗体及丙氨酸转氨酶（ＡＬＴ）动态研究。用套式ＰＣＲ法检测丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ，首次检出时间为输血后１５～８７天，平均４０．３±２０．１天，持续或间歇阳性超过１年者７例。抗ＨＣＶＣ１００．Ｎ１４、Ｐ２２和ＳｃＮＳ３／４和５抗体首次阳转时间分别为输血后３３～４３７（１１９．７±１１９．５）天、５２～１６６（７７．９±３５．６）天、３３～１０３（５５．０±２３．８）天和３３～６６（４０．１±１３．５）天，该４种抗体阳转后都持续１年以上。ＡＬＴ首次异常时间为输血后１５～６０天，平均３７．９±１３．９天，异常超过１年者６例。     

四环素基因表达调控系统介导的HBV X基因体外表达细胞株的建立

目的：建立稳定，高效的HBxAg体外表达的细胞株，以便进一步研究HBV X基因和HBxAg的致癌作用及机理，方法：构建带有完整四环素基因关闭（Tet-off)系统的HBV X基因重组表达质粒pBPSTR1-FlagX，用该重组质粒转染NIH 3T3细胞，筛选嘌呤霉素抗性细胞克隆，用抗－FlagM2单抗和兔抗－HBx作蛋白质免疫印迹分析，检测细胞内Flag-HBxAg表达和四环素调控其表达的情况。结果：重组质粒pBPSTR1-FlagX转染NIH 3T3细胞后获得30个生长良好的嘌呤霉素抗性细胞克隆。其中12个细胞克隆有Flag-HBxAg的稳定表达，且有5个克隆的Flag-HBxAg表达受四环素调控，当四环素浓度逐渐增高时，细胞内Flag-HBxAg的表达逐渐减弱。四环素浓度达1μg/ml时，Flag-HBxAg表达被完全抑制。结论：本研究成功构建了四环素调控系统介导的HBV X基因体外表达细胞株，该细胞株不仅能稳定高水平地表达HBxAg，而且具有定时“开”“关”和定量调节HBxAg表达水平的特性，是HBVX基因功能研究的一个有用工具。     

反义阻断CROC-1基因表达导致细胞生长变慢

目的:建立CROC- 1 基因表达被阻断的FL-CROC- 1 ^-细胞系,研究CROC- 1 基因在细胞生长中的作用。方法: 运用反义技术将新近发现的人泛素缀合酶样蛋白基因CROC- 1 的适当长度cDNA片断克隆到本室改建的真核细胞表达载体pMAMneo-amp^-中,经限制性内切酶图谱分析筛选出反向插入的表达CROC- 1 反义RNA的重组质粒。将此反义表达重组质粒(pMAM-antiCROC- 1 )用改良的磷酸钙法转染人羊膜FL细胞并用含G418的培养基筛选,测定G418抗性的FL-CROC- 1 ^- 细胞系的生长速度。 结果:建立的FL-CROC- 1 ^- 细胞系在地塞米松诱导下CROC- 1 基因表达被反义抑制后,其生长速度较对照FL细胞及转染了载体pMAMneo-amp^- 的FL细胞(FL-MAMneo)的明显要慢(P＜0.05)。结论: 本研究成功地建立了CROC- 1 基因表达被阻断的FL-CROC- 1 ^- 细胞系,并提示CROC- 1 基因编码的泛素缀合酶样蛋白在细胞生长中起正调控作用。     

个体性反义RNA对乳腺癌细胞突变p53基因表达的特异性封闭作用

目的研究针对p53基因突变的个体性反义RNA对乳腺癌突变p53基因的特异性封闭作用。方法通过免疫细胞化学LSAB法染色、聚合酶链反应-单链构象多态性分析及测序确定人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中p53突变位点,构建针对该突变点的反义表达载体并制备其反义RNA。原位杂交技术检测反义RNA与细胞内突变p53基因的特异性结合;在阳离子脂质体介导下将反义RNA转染细胞;以免疫细胞化学LSAB法染色及细胞生长抑制率观测反义RNA作用时效;Western blot检测p53蛋白的表达;四甲基偶氮唑盐法检测转染细胞的生长活性;流式细胞术检测转染细胞的细胞周期分布;原位缺口末端标记法检测转染细胞的凋亡情况。结果人乳腺癌细胞系MDA—MB-231的p53第8外显子（exon8）有突变,据此位点构建反义表达载体[pGEM3zf（＋／-）p53exon8]。原位杂交结果显示反义RNA（ASp53exon8＇RNA）在细胞质内有阳性杂交信号;于转染后48h反义RNA封闭效果最显著,突变p53蛋白（mt-p53）的表达受抑制,细胞增殖能力下降,G2／M期阻滞。结论针对p53基因突变位点制备的个体性反义RNA可特异性封闭乳腺癌细胞突变p53基因的表达。     

SiRNA对丙型肝炎病毒5''非翻译区的干扰作用实验研究

目的研究多种siRNA对丙型肝炎病毒（HCV）5’非翻译区（5＇-UTR）的干扰作用。方法以绿色荧光蛋白基因（GFP）为报告基因，构建HCV5’UTR与GFP核酸序列连接的表达载体：pcDNA—HCV-5’UTR—GFP。设计针对HCV5’UTR区3段小干扰RNA（siRNA），siRNA与表达质pcDNA—HCV-5’UTR—GFP共转染HepG2细胞中，采用荧光显微镜观测细胞内荧光强度改变，并且用流式细胞术量化分析细胞荧光强度变化，评价多种siRNA对HCV基因表达的作用。结果成功构建含HCV5’UTR区的绿色荧光蛋白基因，siRNA能特异性地抑制绿色荧光蛋白基因的表达，siRNAA、siRNAB和siRNAC的抑制率分别为68．4％、72．6％、75．6％；siRNA＋siRNAB、siRNB＋siRNAC和siRNA＋siRNAc的抑制率分别为91．8％、87．2％、92．4％；siRNA＋siRNAB＋siRNAC的抑制率最高，为95．7％。结论多种siRNA对HCV5’UTR区具有干扰作用，组合使用效果更好。     

反义核酸抑制miR-20、miR-106表达对293T细胞增殖的影响

目的:通过反义核酸技术抑制miR-20、miR-106的表达,检测对293T细胞增殖的影响。方法:应用特异性针对miR-20、miR-106的反义核酸转染293T细胞,用形态学、流式细胞技术研究反义核酸对细胞增殖的抑制作用,用定量PCR和ELISA研究miRNA和相关靶基因的表达。结果:研究发现反义核酸可有效抑制miR-20和miR-106的表达,并明显抑制293T细胞的增殖;研究还表明反义miR-106可明显上调抑癌基因Rb的表达。结论:反义核酸通过抑制miRNA表达,上调抑癌基因Rb的表达,能明显抑制293T细胞增殖。     

反义核酸抑制B16黑色素瘤细胞tyr基因的表达

目的：用反义核酸技术抑制小鼠B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶基因（tyr）的表达。 方法： 构建tyr反义重组体pcDNA3.1(-)-tyr，用脂质体法导入B16细胞，用酪氨酸酶活性及黑色素含量测定，多巴染色及透射电镜等检测由反义重组体pcDNA3.1(-)-tyr转录产生的tyr反义核酸对B16细胞tyr表达的抑制情况。 结果： 成功构建了反义重组体pcDNA3.1(-)-tyr，转染了反义重组体的B16细胞其酪氨酸酶活性为0.0498±0.0036，显著低于对未转染组B16细胞的0.0916±0.0132(P<0.01);转染空质粒pcDNA3.1(-)及真核表达重组体pcDNA3.1(+)-tyr组B16细胞的氨酸酶活性分别为0.1015±0.0166和0.0948±0.0096,两者同对照组相比均无显著差异(P>0.05)。多巴染色及电镜观察结果表明转染了反义重组体的B16细胞其黑色素颗粒的含量明显低于对照组。 结论： 反义核酸可以显著抑制B16黑色素瘤细胞tyr的表达。     

丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶基因的克隆和表达

目的 从感染ＨＣＶ的中国患者血清中扩增编码ＨＣＶ丝氨酸蛋白酶的ｃＤＮＡ,在大肠杆菌中进行表达。方法 从血清中提取ＨＣＶ ＲＮＡ,应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增ＨＣＶ丝氨酸蛋白酶ｃＤＮＡ,Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终引法测定其序列,与ｐＢＶ２２０载体构建重组粒,在大肠杆菌中表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ分析重组蛋白。结果 用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增得到了ＨＣＶ丝氨酸蛋白酶基因,序列分析表明其读码框架     

反义封闭PKARⅠβ基因表达对双龙接骨丸含药血清体外促成骨细胞增殖作用的影响

目的:进一步明确cAMP依赖的磷酸激酶Ⅰ型调节亚基β(PKARⅠβ)在双龙接骨丸含药血清促进体外培养成骨细胞增殖过程中的作用。方法:构建表达 PKARⅠβ基因反义序列的重组子pcDNA-antiPKARⅠβ,脂质体法转导成骨细胞HFOB1.19,MTT法检测其增殖状况。结果:高剂量含药血清处理的反义基因封闭组中,HFOB1.19的增殖能力与空白血清对照组无显著差异(P>0.05)。结论:双龙接骨丸含药血清的体外促成骨细胞增殖作用与PKARⅠβ基因的表达密切相关。     

Inhibition of native hepatitis C virus replicase by nucleotide and non-nucleoside inhibitors

A number of nucleotide and non-nucleoside inhibitors of HCV polymerase are currently under investigation as potential antiviral agents to treat HCV-infected patients. HCV polymerase is part of a replicase complex including the polymerase subunit NS5B together with other viral and host proteins and viral RNA. The RNA synthesis activity of the native replicase complex was inhibited by 3'-deoxy-CTP, a chain-terminating nucleotide analog, but not inhibited by non-nucleoside NS5B polymerase inhibitors of three different structural classes. The HCV replicase was also resistant to heparin, a broad-spectrum, RNA-competitive polymerase inhibitor. Prebinding of the recombinant NS5B protein with a RNA template rendered the polymerase largely resistant to the inhibition by heparin and the non-nucleoside inhibitors, but did not affect the inhibitory potency of 3'-deoxy-CTP. Therefore, the HCV replicase showed a similar pattern of inhibitor sensitivity as compared to RNA-bound NS5B. These results suggest that the native HCV replicase complex represents a stable and productive polymerase-RNA complex. The allosteric non-nucleoside NS5B polymerase inhibitors are inactive against established HCV replicase but may function antagonistically with the formation of a productive enzyme-template complex.