grp78真核表达载体构建及其稳定转染HeLa细胞系建立

目的 构建人grp78基因真核表达载体,并建立稳定高表达grp78的人宫颈癌HeLa细胞系.方法 用RT-PCR方法从人宫颈癌HeLa细胞中扩增grp78基因编码区,将PCR产物克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)/grp78并测序鉴定.用构建成功的pcDNA3.1(+)/grp...     

外源基因在哺乳动物细胞中的高效表达

生长激素、干扰素及组织纤溶酶原激活剂等蛋白质药物的获得,使医学发生了深刻变化,而这些药物的大量获得往往依赖克隆基因的表达水平。基因表达特别是基因在真核细胞中的表达是一个极为复杂的问题,受多重因素的调控。本文从转录前水平,转录水平及翻译和翻译后加工等方面综述了近年来对影响基因表达因素的一些新认识、新见解,介绍了增加外源基因在哺乳细胞中表达水平的一些途径,提出了基因定向导入以提高基因表达的潜在途径。     

AAV载体质粒介导的荧光素酶shRNA抑制其在哺乳动物细胞中的表达

目的 构建荧光素酶短发夹环产生质粒在BHK—21细胞中抑制荧光素酶的表达。方法 从人基因组DNA中用PCR方法调出人U6 snRNA启动子，接以被9bp序列间隔的21bP荧光素酶靶序列的反向重复序列，置于AAV载体质粒PSNAV中，构建成荧光素酶短发夹环RNA(shRNA)产生质粒PSNAV／U6/Luc。与PMAMneoLuc质粒共转染BHK—21细胞，检测其对荧光素酶表达的影响。并且单独转染荧光素酶细胞株，检测其抑制荧光素酶表达的效果。结果 PSNAV／U6／Luc对共转染的PMAMneoLuc中荧光素酶的表达抑制50％，而对荧光素酶细胞株中荧光素酶的表达抑制70％。结论 实验表明荧光素酶shRNA产生质粒能够有效抑制荧光素酶在BHK—21细胞中的表达。     

利用哺乳动物细胞表达外源蛋白的研究进展

利用哺乳动物细胞表达外源蛋白已广泛应用于生物产品的制备。哺乳动物细胞是表达具有天然活性蛋白的最佳宿主 ,且具有易被转染 ,遗传稳定 ,产物可分泌表达 ,并易于纯化和大规模生产等方面的优势。本文对选择载体类型、载体元件 (包括启动子、增强子、选择标记等 )以及在哺乳动物细胞大规模培养过程中培养环境、细胞凋亡的抑制和控制细胞增殖和基因表达的Tet switch系统等方面的进展作一综述 ,以探讨提高该系统表达产量的有效方法 ,更好地应用于生物制品的生产。     

大鼠神经肽Y前体cDNA克隆,测序及哺乳动物细胞表达载体的构建

利用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从大鼠脑组织中钩得神经肽Ｙ前体ｃＤＮＡ编码区序列，将该ｃＤＮＡ定向亚克隆入哺乳动物细胞表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ中，构建了重组质粒ｐＲｃ／ＣＭＶ－ＮＰＹ。经双脱氧核苷酸终止法对插入片段作序列分析，证明ＮＰＹｃＤＮＡ序列的准确性及插入方向正确。     

以新型杆状病毒载体在昆虫、哺乳动物细胞中表达克里米亚-刚果出血热病毒核蛋白基因

目的 构建可以在哺乳动物细胞中高效表达的新型杆状病毒载体，并利用其将克里米亚—刚果出血热病毒(CCHFY)中国分离株(新疆出血热病毒，xHFY)BA88166的核蛋白(NP)基因在昆虫和哺乳动物细胞中进行表达。方法 将人巨细胞病毒(CMv)立即早期(IE)启动子连接至杆状病毒载体PFastBacl多角体启动子下游形成新载体PCB1，然后将xHFY NP基因克隆至该载体，通过重组质粒转染和病毒感染，检测其在哺乳动物细胞(COS—7和vero)及昆虫细胞中的表达。结果 连接至PCB1的xHFV NP基因均能在相应的细胞中获得良好表达；以重组杆状病毒感染的vero细胞可以作为抗原检测xHF血清，与ELISA的检测结果完全一致，并与临床诊断有很好的平行性。结论 新型杆状病毒载体能够驱动外源基因在昆虫和哺乳动物细胞中高效表达，不仅能方便快速地制备诊断抗原，还具有发展重组病毒疫苗和基因治疗的潜力。     

影响外源DNA导入哺乳动物细胞有关因素的研究

本文采用磷酸钙-DNA共沉淀转化法将多种重组质粒导入Hela细胞，并对影响其转化效率的有关因素进行了观察，建立了适合本实验室的标准化转染方法。结果表明：1)待转化的细胞应为单层约稀疏的对效生长期细胞；2)重组质粒DNA的浓度为8～10μg/100ml培养瓶；3)磷酸钙-DNA共沉物与持转化的细胞共孵育时间为10h；4)G418是在转染后24h加入，浓度为200μg/ml，为最佳转化条件。本研究采用该方法将质粒pcDNA3，pcDNA3-MSP119，pcDNA3-SjESG，pcDNA3-CSP，pcDNA3-MSP1，pcDNA3-MSP2和pcDNA3-Pfs48/45导入哺乳动物细胞HaLa细胞均获得满意结果。每微壳DNA的平均克隆数高达9．6。重组质粒DNA导入哺乳动物细胞方法的标准化为外源基因在哺乳动物细胞中的高效表达创造有利条件。     

NK4基因的克隆及其在Raji细胞中的表达

目的： 克隆NK4基因,构建其重组真核表达载体,并观察其在Raji细胞中的表达。方法：从人肝组织中提取总RNA,行RT-PCR获得NK4基因cDNA,与载体pVITRO2-mcs构建重组真核表达载体,转染Raji细胞。潮霉素B筛选后,采用实时荧光定量PCR、ELISA、细胞免疫组化和半固体培养等方法检测NK4基因在Raji细胞的表达,筛选稳定表达的细胞株。结果：NK4基因获成功克隆并构建了重组真核表达载体pVITRO2-mcs-NK4;转染NK4基因后的Raji细胞经RT-PCR发现存在特异性DNA片段。NK4基因在Raji细胞可稳定表达NK4 mRNA和蛋白,且可抑制Raji细胞的增殖、迁徙和侵袭。结论：NK4基因成功克隆并构建了重组真核表达载体,转染Raji细胞后表达稳定。     

P75在周围神经损伤后的表达

目的：确定Ｐ７５（神经生长因子低亲合力受体）在坐骨神经操作后周围神经系统的表达分布,方法：切断大鼠右侧坐骨神经再吻合,术后不同的时段上,切取与之相连的Ｌ４￣Ｌ６脊髓节段和两侧不了、左侧坐骨神经、吻合的右侧坐骨神经段作冰冻切片,再生ＬＳＡＢ免疫组化染色光镜下观察、拍照、结果：Ｐ７５在右侧脊髓前角运动神经元胞体、脊神经节感觉神经元胞体和右侧坐骨神经呈免疫组化阳性反应,而左侧均有阴反应。结论：Ｐ７５在坐     

巨噬细胞移动抑制因子基因的克隆和原核表达

目的：扩增、克隆人巨噬细胞移动抑制因子（MIF）基因，并在大肠杆菌中表达出具有生物活性的重组MIF蛋白。方法：根据人MIF基因序列，设计、合成PCR引物，利用RT-PCR技术从人T淋巴细胞mRNA中扩增MIF基因。将MIF定向插入原核表达载体pGEX-4T-1，并将构建正确的重组表达载体pGEX-4T-MIF转化工程菌BL21(DE3)，用异丙基硫代-β-D-半乳糖（IPTG）诱导表达重组MIF蛋白。用GSTrap亲合柱纯化表达产物GST-MIF，行柱上凝血酶消化，洗脱获得MIF蛋白。用巨噬细胞移动抑制试验（MMI）鉴定MIF蛋白的生物活性。结果：限制性内切酶分析和DNA测序结果表明，成功构建了重组质粒pGEX-4T-MIF，人MIF cDNA长348 bp，编码115个氨基酸。经IPTG诱导，高效表达出可溶的GST-MIF蛋白。SDS-PAGE 和 Western blotting分析显示，GST-MIF经凝血酶消化，获得13 kU的MIF蛋白。MIF蛋白对巨噬细胞移动的抑制率达30%，具有生物活性。结论：克隆、测定了人MIF基因，在大肠杆菌表达出具有生物活性的MIF蛋白。     

神经肽Y基因在哺乳动物细胞CHO中的稳定表达

以ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ介导将ｐＲｃ／ＣＭＶＮＰＹ质粒转染入ＣＨＯ细胞，经Ｇ４１８筛选及Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ、ＥＬＩＳＡ和ＨＰＬＣ检测，得到稳定表达神经肽Ｙ（ＮｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹ，ＮＰＹ）的细胞株，表达量为２～１０ｎｇ／（ｍｌ·１０７细胞）；表达时相分析结果显示转染细胞在转染后第４天表达量最高。     

人白细胞介素12在哺乳动物细胞中的稳定表达及其生物活性的研究

目的采用遗传基因工程方法获得具有生物活性的人白细胞介素12,探索其治疗肿瘤和慢性肝炎的可行性。方法采用已克隆的国人IL-12基因序列,利用内部核糖体切入位点(IRES)完成IL-12P35、P40双亚基共表达载体的构建,通过转染CHODHFR缺陷细胞,双抗夹心ELISA法筛选阳性克隆,MTX加压扩增,PCR检测其基因整合,T淋巴细胞增殖和诱生γ干扰素实验检测其生物活性。结果获得了稳定高效表达人IL-12的工程细胞系,表达产物为70×103左右的糖蛋白。结论本研究得到的基因重组人IL-12具有良好的生物活性,有强的诱导产生γ干扰素的能力和诱导活化T淋巴细胞增殖能力。     

人细胞间粘附分子1基因功能区Ⅰ,Ⅱ的克隆及高效表达

用ＰＣＲ聚合酶链反应技术从人细胞间粘附分子１（ＩＣＡＭ－１）ｃＤＮＡ中获取了其编码细胞外氨基端功能区Ⅰ、Ⅱ１８５个氨基酸的ＤＮＡ序列，构建了重组质粒ｐＥＴ／ｒｓＩＣＡＭ－１。经转化宿主菌，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，薄层扫描和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ，证明目的基因在大肠杆菌中获得了高效表达。     

p75真核表达载体的构建及其在PC-3细胞中的表达

目的：构建人神经生长因子低亲和力受体p75真核表达质粒,并在前列腺癌细胞PC-3中表达。方法：运用RT-PCR技术从人脑胶质细胞瘤组织中分离扩增编码人p75完整基因,与pcDNA载体重组,并通过酶切和测序鉴定;用脂质体介导法将重组质粒转染到PC-3细胞中,经G418筛选后,用RT-PCR、间接免疫荧光化学和细胞免疫组织化学法在转录和翻译两个水平上检测表达产物。结果：酶切和测序证实所获得的重组质粒包含p75完整基因;在转染pcDNA3．1( )-p75的PG3细胞中检测到转录和翻译产物。结论：成功地构建了p75真核表达质粒并在PC-3细胞中表达,为深入研究p75在前列腺癌中的生物学功能奠定了基础。     

抗人CD16单克隆抗体可变区基因的克隆和表达

目的：克隆抗人CD16单克隆抗体重，轻链可变区（VH，VL）基因并合成单链抗体（ScFv)基因。方法：从分泌抗人CD16单克隆抗体的杂交瘤细胞B88－9中提取总RNA，应用RT－PCR技术获得抗CD16单克隆抗体的VH，VL基因，用连接肽（Linker)肽VH和VL连接成具有VH－Linker-VL结构的ScFv基因，将其克隆到表达载体pcDNA3.1( )，并转杂COS－7细胞。结果：VH基因长度为354bp，属于鼠抗体可变区重链基因家族I（B）亚群，VL基因长度为333bp，属于鼠抗体可变区kappa轻链基因家族Ⅲ亚群，采用夹心ELISA方法检测到ScFv的表达。结论：抗人CD16单克隆抗体VH与VL基因的克隆和ScFv基因的构建为基于CD16的导向免疫治疗奠定了基础。     

小鼠IL-23基因的克隆和在逆转录病毒中的表达

从肿瘤组织 (含有活化的淋巴细胞 )提取总RNA ,经逆转录多聚酶链反应 (RT PCR )获得小鼠IL 2 3cDNA。经DNA测序分析 ,证实该片段与GeneBank记载的IL 2 3cDNA序列一致。将该目的基因插入LXSN逆转录病毒载体 ,并转染大肠杆菌DH5α中扩增 ,再感染 ψ2 (ecotropic )和PA317(amphotropic )两种包装细胞 ,经G4 18筛选后获得表达IL 2 3分子的PA317阳性细胞克隆。通过用PCR、RT PCR及Northernblot技术检测目的基因表达 ,结果表明 ,成功地将鼠IL 2 3cDNA插入逆转录病毒载体 ,经转染两种包装细胞产生了高表达IL 2 3的PA317细胞克隆。该克隆细胞产生的逆转录病毒可进一步用于转染肿瘤细胞 ,为制备肿瘤疫苗奠定了基础     

PTEN基因的克隆及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人抑癌基因PTEN全长cDNA,构建其真核表达载体并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法采用RT-PCR法从人正常肝组织中扩增PTEN全长cDNA,将之与pMD18-T Simple Vector连接、测序,获得PTEN基因。将该基因与pcDNA3·1( )载体连接,构建pcDNA3.1-PTEN真核表达载体。用该载体转染HepG2细胞,RT-PCR检测PTEN的表达。结果酶切和测序证实PTEN基因克隆和真核表达载体构建成功。HepG2-PTEN细胞中PTEN mRNA的表达显著高于未转染的HepG2细胞。结论人抑癌基因PTEN在人肝癌细胞系HepG2细胞中能够高效、稳定地表达,为其在肝癌基因治疗研究中的应用奠定了基础。     

缺糖损伤的PC12细胞中grp75基因的表达

目的探讨PC12细胞缺糖损伤时应激基因葡萄糖调节蛋白(grp75)的表达变化.方法无葡萄糖培养基培养PC12细胞建立细胞缺糖损伤细胞模型,用RT-PCR、Western blot 和细胞免疫化学法分析缺糖损伤时grp75的表达情况.结果 RT-PCR结果显示细胞缺糖损伤3h起grp75基因转录水平已显著增高,并在缺糖后3～24h间持续上升;蛋白印迹法和细胞免疫化学法证实grp75在细胞缺糖过程中蛋白水平的表达明显高于对照组,且随着缺糖时间推延而进一步升高.结论缺糖损伤时,细胞中的应激基因grp75特异性上调表达.     

S100A2基因cDNA克隆及其在肝癌细胞中的表达

目的：克隆S100A2 cDNA、构建S100A2重组表达载体并在肝癌细胞QGY7701中进行表达。方法：应用RT-PCR和DNA重组技术构建绿色荧光蛋白（EGFP）-S100A2融合蛋白表达载体，经脂质体导入QGY7701细胞中进行表达。应用荧光显微镜直接观察EGFP-S100A2融合蛋白的表达情况，G418筛选阳性细胞克隆。结果：构建了带有EGFP的S100A2重组表达载体命名为EGFP-C2-A2，并在肝癌细胞QGY7701中获得了表达。荧光显微镜下可见EGFP-S100A2融合蛋白定位于胞浆及胞核，而pEGFP载体对照之EGFP只定位在胞浆中。结论：EGFP-S100A2融合蛋白能够在肝癌细胞QGY7701中获得表达，各自在细胞中的定位互不受影响，推断此融合蛋白具有各自的生物学活性。     

幽门螺杆菌Catalase基因的克隆、表达及其抗原性鉴定

目的：构建含人幽门螺杆菌（Hpylori，Hp）过氧化氢酶（catalase，KatA）编码基因的重组质粒，测定、分析其核酸序列，并在E.coli中表达，研究其抗原性。方法：应用PCR技术从HpDNA染色体中扩增KatA编码基因片段，将其T-A克隆和测序，并与GenBank公布的其他Hp菌株的基因序列比较，再将目的基因插入至融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达，用GST亲和层析对其进行纯化。纯化产物用于对29株小鼠抗Hp-全菌单克隆抗体（mAb）的鉴定及与Hp啊感染患者血清进行Western blot。结果：KatA基因全长为1 515 bp，并在GenBank上登录（No．DQ333889），与GenBank公布的其他Hp菌株的核酸的同源性为96％～97％，表达的KatA融合蛋白的相对分子质量（Mr）为85 000，29株小鼠抗Hp全菌mAb中有4株mAb是针对KatA的，表达产物可被Hp感染患者的血清特异性识别。结论：重组KatA具有较好的抗原性，为坳检测试剂和疫苗的研究奠定了基础。