人血小板生成素cDNA转染COS-7细胞及表达产物对小鼠骨髓巨核细胞的作用

将克隆全长１．１ｋｂ血小板生成素（ＴＰＯ）ｃＤＮＡ构建重组ＰＣＩｎｅｏＴＰＯ表达载体，利用ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ介导转染ＣＯＳ－７细胞中，对阳性克隆ＣＯＳ－７细胞的ＤＮＡ、ｍＲＮＡ和培养上清分别进行ＰＣＲ扩增Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ、斑点杂交和ＴＰＯ夹心ＥＬＩＳＡ检测，观察表达产物对小鼠骨髓巨核细胞的作用。结果表明：全长１．１ｋｂＴＰＯｃＤＮＡ转染ＣＯＳ－７细胞获得表达，最高表达量可达４８．２８Ｕ／ｍｌ，其产物使骨髓巨核细胞集落形成单位（ＣＦＵ－ＭＫ）集落数增加４倍，巨核细胞增大至４２．１０±６．７０μｍ（Ｐ＜０．０１）；动态观察骨髓ＣＦＵ－ＭＫ集落数于实验第８天达最高峰，约持续２ｄ，第１０天后开始下降。提示ＴＰＯｃＤＮＡ转染ＣＯＳ－７细胞表达产物对骨髓巨核细胞生成有刺激活性     

B7—1（CD80）基因的克隆及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人Ｂ淋巴瘤细胞系Ｒａｊｉ中克隆到Ｂ７－１（ＣＤ８０）ｃＤＮＡ，并经测序证实，将其插入至真核表达载体ｐＬＸＳＮ中，用脂质体转染小鼠黑色素瘤细胞Ｂ１６，Ｇ４１８筛选，并经流式细胞仪检测，得到了细胞表面表达Ｂ７－１的重组克隆。ＰＣＲ从其基因组ＤＮＡ中扩增到Ｂ７－１基因，提示Ｂ７－１ ｃＤＮＡ已整合至宿主细胞的基因组ＤＮＡ中，本文为研究Ｂ７－１在肿瘤免疫中所起的作用奠定了基础。     

慢性髓系白血病bcr—abl融合基因的克隆及其在COS …

目的 克隆慢性髓系白血病（ＣＭＬ）融合基因ｂｃｒ－ａｂｌ的ｃＤＮＡ序列,并在真核细胞中表达。方法 以设计的两条引物扩增ｂｃｒ－ａｂｌ融合位点两侧的ｃＤＮＡ,测序后克隆至真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１,转染ＣＯＳ－７细胞。取常规培养的细胞进行ＲＴ－ＰＣＲ鉴定。结果 ①ＰＣＲ扩增出４９０ｂｐ大小的ｃＤＮＡ,其序列测定除第４５２位的碱基Ｃ突变为Ｔ外,其余序列均正确。②ＲＴ－ＰＣＲ法检测到转染细胞系中,有ｂ     

编码与大鼠ERα—甘露糖苷酶同源的人6A8cDNA在真 …

观察６Ａ８ｃＤＮＡ（１３５８ｂｐ）在真核细胞的表达。方法Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ，构建６Ａ８ｃＤＮＡ表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ－６Ａ８ｃＤＮＡ，转染ＣＯＳ－７细胞，及基因免疫小鼠。     

人补体膜辅助调节蛋白MCP的基因克隆及共真核表达的研究

目的 克隆获得编码人补体膜辅助调节蛋白（ＭＣＰ）的ｃＤＮＡ，并对其在真核细胞的表达及功能进行研究。方法 应用ＲＴ－ＰＣＲ 方法，从Ｕ９３７细胞总ＲＮＡ中扩增编码人ＭＣＰ分子的ｃＤＮＡ片段，快速克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体，测定共序列。将该片段重组于ｐＬＸＳＮ载体，电穿孔转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，经ＦＡＣＳ检测筛选表达ＭＣＰ的阳性细胞克隆，用补体容破试验鉴定其抑制人补体溶破的功能。结果 ＲＴ－ＰＣＲ     

内部核糖体进入位点控制hytk基因和绿色荧光蛋白的表达

构建一种带有绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐ）和ｈｙｔｋｃＤＮＡ（潮霉素磷酸转移酶和ＨＳＶ－ｔｋ的融合基因）的新型真核表达载体，用于简便、快速地了解自杀基因在恶性肿瘤听转染效率。利用脑炎心肌炎病毒的内部核糖体进入位点，将ｇｆｐ的ＣＤＮＡ与ｈｙｔｋ真核表达载体重组，构建获得含ｇｆｐ和ｈｙｔｋ基因的重组质粒；Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导下分别转染ＣＯＳ－７细胞及人膀胱癌细胞株ＥＪ，并检测表达情况。结果示该载体在     

三种阳离子脂质体转染效率的测定

目的 测定研制的３种阳离子脂质体（Ａ,Ｂ,Ｃ）的转染效率,并且与ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ的转染效率进行比较。方法 采用分子克隆的方法。将ｌｕｅ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３载体。以质粒ｐｃＤＮＡ３－ｌｕｃ与一定量的阳离子脂质体及ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染食管癌Ｅａ１０９细胞,一定时间后测定荧光强度以确定ｌｕｃ的表达量。结果 成功地构字质粒ｐｃＤＮＡ３－ｌｕｅ,转染后,。发现阳离子脂质体Ａ的转染效率较高,接近ｌ     

携带hIL-2cDNA的逆转录病毒载体的构建及其在人肝癌细胞中的特异表达研究

将人白细胞介素２（ｈＩＬ-２）ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ＭＮＳＭ的ＰＬ位点　，分别构建了转录受ＳＶ４０早期启动子和人甲胎蛋白增强子调控的重组逆转录病毒载体ＭＮＳＩ和ＭＮＳＩＡ。用脂质体转染法将ＭＮＳＩ和ＭＮＳＩＡ分别转导ＰＡ３１７包装细胞，测质粒转染率为（５～２０）×１０~(－３)克隆／μｇＤＮＡ·１０~６细胞，病毒感染率为（５．４～４５０）×１０~４ＣＦＵ／ｍｌ。重组病毒在４μｇ／ｍｌ ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ存在条件下感染人肝癌细胞、肾癌细胞和黑色素瘤细胞，Ｎｅｏ~Ｒ克隆经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析证明ｈＩＬ－２ｃＤＮＡ转入人肿瘤细胞并整合，　Ｒ　ＮＡ斑点杂交及ＩＬ－２活性表达分析证明，人甲胎蛋白增强子可促进异源启动子启动ｈＩＬ－２ｃＤ－ＮＡ在合成甲胎蛋白的人肝癌细胞中高效特异转录和表达。该研究对肝癌特异性免疫增强基因治疗有重要意义。     

E－选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ－选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了重组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定。将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入到天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位点，构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ－１４３细胞，用ＢｕｄＲ和ＬａｃＺ双筛选，获得带有人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和ＡＰＡＭ检测，重组痘苗病毒能有效地表达人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ。     

反义周期蛋白B1基因抑制HT29细胞的增殖

用ＤＮＡ重组技术将人类ｃｙｃｌｉｎＢ１基因的全长ｃＤＮＡ，反向插入到真核表达载体ｐＸＪ４１－ｎｅｏ的ＢａｍＨ１位点，得到ｃｙｃｌｉｎＢ１基因的反义ＲＮＡ表达载体ｐＡＳ－Ｂ１。利用ＤＮＡ磷酸钙共沉淀方法，将ｐＡＳ－Ｂ１转染进ＨＴ２９细胞。在含有Ｇ４１８的培养基中，挑选出独立的细胞克隆。利用ｃｙｃｌｉｎＢ１ｃＤＮＡ作探针，Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交鉴定出一株内源性ｃｙｃｌｉｎＢ１ｍＲＮＡ受到抑制的细胞株ＨＴＢ１。比较ＨＴＢ１与对照细胞ＨＴ２９发现，ｃｙｃｌｉｎＢ１的反义ＲＮＡ明显抑制ＨＴ２９细胞的增殖，细胞内３Ｈ－ＴｄＲ参入量减少。流式细胞光度术分析，处于Ｇ１期细胞比率的升高与Ｓ期、Ｇ２＋Ｍ期细胞数量的下降都十分显著。     

人类bcl-2 cDNA在哺乳类细胞中的表达及反义bcl-2对U937细胞生物学行为的影响(摘要)

人类ｂｃｌ┐２ｃＤＮＡ在哺乳类细胞中的表达及反义ｂｃｌ┐２对Ｕ９３７细胞生物学行为的影响（摘要）何凤田１朱锡华１本文借助逆转录病毒载体将人类ｂｃｌ－２ｃＤＮＡ转染于三种哺乳类细胞，建立了组成性稳定表达ｂｃｌ－２的细胞模型，观察了模型细胞生长特性及对某...     

CTLA4—lg融合蛋白基因的表达及其生物学功能的初步研究

获得ＣＴＬＡ４全长基因并在真核表达系统中表达。方法通过ＲＴ－ＰＣＲ方法，从ＭＴ２细胞系克隆ＣＴ－ＬＡ４全长基因；经直物重叠和半巢式ＰＣＲ改造，获得含抑瘤素Ｍ信号肽的ＣＴＬＡ４胞外段ＤＮＡ，然后克隆至真核表达载体ｐＩｇ，转染ＣＯＳ和ＣＨＯ－Ｋ细胞表达。结论真核表达体系表达了有生物学活性的ＣＴＬＡ４－Ｉｇ。     

人补体膜辅助调节蛋白MCP的基因克隆及其真核表达的研究

目的　克隆获得编码人补体膜辅助调节蛋白（ ＭＣＰ） 的ｃＤＮＡ,并对其在真核细胞的表达及功能进行研究。方法　应用ＲＴＰＣＲ 方法,从Ｕ９３７ 细胞总ＲＮＡ 中扩增编码人ＭＣＰ 分子的ｃＤＮＡ片段, 快速克隆于ｐＧＥＭＴＥａｓｙ 载体,测定其序列。将该片段重组于ｐＬＸＳＮ 载体,电穿孔转染ＮＩＨ３Ｔ３ 细胞,经ＦＡＣＳ 检测筛选表达ＭＣＰ 的阳性细胞克隆,用补体溶破试验鉴定其抑制人补体溶破的功能。结果　ＲＴＰＣＲ 扩增得到１ １４４ｂｐ 的编码人ＭＣＰ 分子的ｃＤＮＡ 片段,序列分析表明该ｃＤＮＡ编码的蛋白为ＳＴＣ＋ ＣＹＴ２ 亚型。细胞转染筛选获得多个表达ＭＣＰ 的ＮＩＨ３Ｔ３ 阳性细胞克隆,补体溶破试验证实其具有抑制人补体经典途径和旁路途径溶破的功能。结论　本研究为进一步探讨不同亚型结构的ＭＣＰ 分子与功能的关系及其应用奠定了基础。     

人IL-12的克隆、表达及生物活性的鉴定

目的：克隆中国人ＩＬ－２ｐ４０基因,构建ＩＬ－１２的真核基因表达载体。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ从北京地区人脐血树突状细胞（ＤＣ）中克隆ＩＬ－１２ｐ４０ｃＤＮＡ基因,并进行序列分析。利用ｐｃＤＮＡ３．１和ｐＬＸＰＸＳＮ构建ＩＬ－１２表达载体,转染人肝癌细胞后对其进行生物学和免疫学分析。结果：北京地区人ＤＣ中ＩＬ－１２ｐ４０ｃＤＮＡ基因２１０位密码子有独特的结构,为ＧＣＣ（Ａｌａ）。并且２３９和２９１位     

野生型p53基因脂质体转染细胞疫苗的制备

目的：制备具有治疗活性的野生型Ｐ５３基因真核表达载体的细胞疫苗。方法：利用ＲＴ－ＰＣＲ从人外周血淋总ｍＲＮＡ中扩增出全长的野生型Ｐ５３基因,将其克隆入ＴＡ克隆载体的经扩增后,将ｐ５３ｃＤＮＡ连入ＰＣＭＶ真核表达载体中,利用ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ将其转染ＤＵ１４５细胞并通过免疫组化的方法检测其表达情况。结果：Ｐ５３基因可在ＤＵ１４５细胞中稳定表达。结论：制备了可稳定表达可ＤＵ１４５细胞中的野生型     

U937细胞表达成纤维细胞生长因子受体

以逆转录－ＤＮＡ聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）自Ｕ９３７细胞钓出了两条ｃＤＮＡ片段。将其克隆入ＴＡ克隆载体后进行ＤＮＡ测序。结果证明ｃＤＮＡ片段分别是人成纤维细胞生长因子受体１（ＦＧＦＲ１）的细胞外段和细胞内段ｃＤＮＡ。这一结果表明，Ｕ９３７细胞可以表达ＦＧＦＲ１ｍＲＮＡ。     

复制缺陷型人IL-2重组腺病毒的制备与鉴定

目的将人ＩＬ－２的重组腺病毒载体与Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ末端肽复合物同源重组，高效制备人ＩＬ－２的复制缺陷型重组腺病毒，并进行体外表达和活性检测。方法将含全部编码序列的人ＩＬ－２ｃＤＮＡ置于真核表达载体ｐＣＩｃｃ的ＣＭＶ启动子下游，切出含ＣＭＶ启动子、人ＩＬ－２ｃＤＮＡ和ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ信号肽序列的ＣｌａＩ片段，插入Ｅ１区替代的腺病毒载体ｐＡｘｌｏｗ，选择左向转录的人ＩＬ－２重组腺病毒载体ｐＡｘｌｃｗ．ＣＩｈＩＬ－２与经ＥｃｏＴ２２Ⅰ酶切的Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ－末端肽复合物共转染２９３细胞；通过同源重组获得人ＩＬ－２的复制缺陷型重组腺病毒；体外转染人宫颈癌ＨｅＬａ细胞、人Ｔ细胞淋巴瘤Ｈｕｔ７８细胞和原代人皮肤成纤维细胞。结果扩增到的病毒滴度达２．１×１０９ＰＦＵ／ｍｌ；体外转染的人肿瘤细胞均检测到ＩＬ－２的表达（４００～２６００Ｕ／１０６细胞／２４小时）。结论所制备的复制缺陷型重组腺病毒能有效介导人ＩＬ－２的基因转移，可望用于肿瘤基因治疗的临床研究。     

E—选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定，将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入一以天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ＾－１４３细胞，用     

人胰岛素样生长因子1的真核细胞表达及其鉴定

目的 构建人胰岛素样生长因子１（ＩＧＦ－１）的真核细胞表达质粒。方法 用ＰＣＲ方法从人的肝细胞ｃＤＮＡ文库中克隆出ＩＧＦ－１ｃＤＮＡ,然后定向插入真核细胞表达载体ｐｃＤＮＡ３中,并用脂质体方法转染ＣＯＳ７细胞。用ＥＬＩＳＡ法和人胚肺纤维母细胞以及ＮＩＨ３Ｔ３纤维细胞增殖法分别测定转染细胞上清液中ＩＧＦ－１的含量和生物活性。结果 重组的真核细胞表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＩＧＦ－１所含的ＩＧＦ－１ｃＤＮＡ序列和插入方向均正确,其转染的ＣＯＳ７细胞分泌较高浓度的ＩＧＦ－１,并且具有明显促进纤维细胞增殖的能力。结论 本实验所构建的重组真核细胞表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＩＧＦ－１能够高效表达有活性的ＩＧＦ－１,对进一步研究ＩＧＦ－１体内表达的生理和病理作用有一定意义。     

三种反义c—myc逆转录病毒表达载体的纯化,病毒包装,滴度测定 …

为了增强逆转录病毒构建体对靶细胞的转染能力,本实验使用Ｗｉｚａｒｄ＾ＴＭ ＤＮＡ纯化系统对构建成功的三种反义ｃ－ｍｙｃ逆转录病毒表达载体进行了纯化,并经脂质体介导包装ＰＡ３１７细胞,使用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定了ＰＡ３１７抗性细胞克隆的病毒滴度,用ｎｅｏ基因ＰＣＲ扩增检测外源基因的整合情况,结果显示纯化后的ＤＮＡ达到了真核细胞转染的要求,但其包装滴度的高低还受靶细胞生长状态,ＰＡ３１７抽样量的高度影响