新生大鼠卵巢体外培养体系的研究

目的:探讨最适宜于大鼠原始卵泡体外生长发育的培养体系。方法:取出生2d的SD大鼠卵巢,分别在Waymouth和DMEM中培养8d,石蜡制片,HE染色,统计分析各级正常卵泡数;于培养d4、d8观察各级卵泡形态;并用免疫组化方法检测在这两种培养体系的卵巢中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达定位情况。结果:①在Waymouth中,由原始卵泡启动生长成为初级卵泡和次级卵泡的百分率分别是25.51%和6.93%,高于DMEM中的17.06%和3.56%(P<0.01)。②在Waymouth中培养的卵泡形态都较正常,而在DMEM中培养的异常卵泡较多。③PCNA作为原始卵泡生长的指标,也说明卵巢在Waymouth中能良好生长。结论:Waymouth培养体系是研究原始卵泡生长的一个理想的培养体系。     

骨形态发生蛋白4/Smad信号通路在小鼠原始卵泡发育中的作用及作用机制

目的:探讨骨形态发生蛋白4(BMP4)/Smad信号通路在小鼠原始卵泡发育中的作用及作用机制。方法:取3日龄昆明雌性小鼠卵巢体外培养,添加重组BMP4,并以不添加BMP4为对照,采用HE染色和TUNEL法,检测BMP4在原始卵泡存活和发育中的作用;采用免疫组织化学、Westernblotting与RT-PCR检测BMP4对原始卵泡中p-Smad1/5/8、sohlh2及c-kit表达的影响。结果:①BMP4组卵巢直径明显变大(1.17±0.24 mm vs 0.65±0.13 mm,P<0.05),原始卵泡数(45.3±4.2枚)明显低于对照组(55.0±5.0枚)(P<0.05),而初级卵泡的数(25.3±2.5枚)明显多于对照组(19.0±1.0枚)(P<0.05)。②TUNEL结果显示BMP4组凋亡卵母细胞比例明显低于对照组(P<0.05)。③免疫组织化学、Western blotting与RT-PCR结果显示,与对照组相比,BMP4组原始卵泡卵母细胞中p-Smad 1/5/8、Sohlh2及C-kit的表达均显著升高(P<0.01)。结论:BMP4/Smad信号通路可促进小鼠原始卵泡向初级卵泡转变,并抑制卵母细胞的凋亡;其可能通过上调Sohlh2及C-kit基因的表达而发挥作用。     

干细胞因子和白血病抑制因子对冻融后人原始卵泡体外生长发育的研究

目的:探讨干细胞因子(stem cell factor,SCF,又称KIT配体)和白血病抑制因子(leukaemiainhibitory factor,LIF)对冻融后人原始卵泡体外培养生长发育的影响。方法:收集18例卵巢良性肿瘤手术患者的正常卵巢皮质,采用直接覆盖玻璃化冷冻法保存卵巢组织,冻融后分离卵泡,随机分成5组:对照组(A组)、10 ng/ml SCF组(B组)、10 ng/ml LIF组(C组)、10 ng/ml SCF+10 ng/ml LIF组(D组)和100 ng/ml SCF+10 ng/ml LIF组(E组),行体外培养,比较SCF和/或LIF对人原始卵泡生长发育的影响。结果:①随培养天数的增加,对照组卵泡直径增长缓慢,明显小于各实验组(P<0.05);D、E组中卵泡直径增长迅速,较B、C组差异有统计学意义(P<0.05)。②随着培养天数的增加,各组卵泡均能分泌激素。4 d后对照组卵泡激素水平增长缓慢,明显低于各实验组(P<0.05),而D、E组中卵泡激素分泌增长迅速,较B、C组差异有统计学意义(P<0.05),D、E组中卵泡激素增长速度相差不大,但在第4日差异有统计学意义(P<0.05)。结论:在体外培养液中添加SCF或LIF以及两者联合添加有利于促进卵泡的生长发育,提高E2分泌功能,且SCF和LIF联合其作用更加明显。     

瘦素(leptin)对卵泡生长的启动作用及机制研究

目的:探讨瘦素(leptin)在原始卵泡启动生长中的作用及其机制。方法:利用2日龄大鼠离体卵巢体外培养模型,在Waymouth培养体系中分别添加瘦素、瘦素抑制剂(leptin antagonist)以及ERK1/2信号通路特异性抑制剂(PD98059),通过形态学观察原始卵泡启动生长的变化,Westernblotting检测卵泡ERK1/2、磷酸化-ERK1/2(P-ERK1/2)蛋白表达量的变化。结果:瘦素能够促进原始卵泡的启动生长(P<0.05),还可激活卵泡ERK1/2信号通路中的ERK1/2蛋白磷酸化(P<0.05);用瘦素抑制剂和PD98059可显著抑制瘦素促原始卵泡生长效应(P<0.05),亦可显著抑制瘦素对卵泡ERK1/2蛋白磷酸化(P<0.05)。结论:瘦素能够促进原始卵泡的启动生长,其作用机制可能与ERK1/2信号通路有关。     

荷人卵巢上皮癌裸鼠冻融卵巢组织移植的效果评价

目的:获取人卵巢上皮癌裸鼠原位移植瘤癌旁正常卵巢组织,经安全筛查并冻融后移植至去势裸鼠体内,探讨移植后效果,为临床应用提供依据。方法:将人卵巢上皮癌OVCAR3细胞种植于裸鼠皮下以获取瘤源,并进行卵巢原位移植,建立卵巢癌原位移植瘤模型,解剖裸鼠获取癌旁正常卵巢组织。癌旁组:取筛选后的癌旁卵巢组织进行玻璃化冷冻,复苏后分别进行皮下及原位移植,各20例;对照组:同龄正常裸鼠卵巢组织,皮下移植及原位移植各20例;去势裸鼠组:20只同龄去势裸鼠;正常卵巢组:20只同龄正常裸鼠。移植12周后,分析各组裸鼠卵巢组织内卵泡形态及激素分泌功能。结果:40只人卵巢上皮癌裸鼠原位移植瘤模型中共获取35份活检正常的癌旁卵巢组织,获取率87.5%(35/40)。玻璃化冷冻前后卵巢组织中卵泡形态及各级卵泡比例均无显著差异(P>0.05),癌旁冷冻组织和癌旁新鲜组织的异常卵泡比例差异无统计学意义(P>0.05),冷冻组织以初级卵泡及次级卵泡等窦前卵泡为主。癌旁组皮下移植组织存活率80%(16/20),对照组皮下移植组织存活率90%(18/20),癌旁组原位移植组织存活率90%(18/20),对照组原位移植组织存活率95%(19/20)。移植后组织内卵泡以次级卵泡及窦状卵泡为主,各级卵泡的形态及构成比和未移植的同龄正常裸鼠卵巢相似(P>0.05);癌旁组卵泡数明显低于对照组(P<0.05)及正常卵巢组(P<0.01);皮下移植和原位移植组织内的各级卵泡数差异无统计学意义(P>0.05)。癌旁组卵泡刺激素水平明显低于去势裸鼠组,而雌二醇水平明显高于去势裸鼠组(P<0.01);癌旁组卵泡刺激素水平明显高于对照组(P<0.05)及正常卵巢组(P<0.01),而雌二醇水平明显低于对照组(P<0.05)及正常卵巢组(P<0.01);皮下移植和原位移植的卵泡刺激素水平和雌二醇水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:癌旁卵巢组织冻融移植后有正常卵泡发育及激素分泌功能;皮下移植和原位移植均可取得较好的效果;癌旁卵巢组织冻融移植有望作为卵巢上皮癌患者治疗后恢复卵巢内分泌功能的有效手段。     

促性腺激素释放激素激动剂预防紫杉醇所致小鼠卵巢功能损害的研究

目的:探讨促性腺激素释放激素激动剂(GnRHa)对紫杉醇(PTX)导致小鼠卵巢功能损害的保护作用。方法:将雌性KM小鼠40只随机分为PTX+Leuprorelin组、PTX组、Leuprorelin组、NS组。用药期间每天观察小鼠的一般状态、动情周期,用药结束后监测小鼠性激素(FSH、E_2、AMH)水平、卵巢湿重、形态结构和各级卵泡数变化。结果:PTX组与NS组比较,小鼠体重明显减轻(P0.05),卵巢湿重明显下降(P0.05);PTX组各级卵泡数及卵泡总数显著减少,Leuprorelin组次级卵泡、窦状卵泡数减少,原始、初级卵泡数及总卵泡数增加,PTX+Leuprorelin组原始卵泡比例明显增加,未见明显纤维化及停止发育现象。结论:提前应用GnRHa能减少化疗过程中初级卵泡的丢失,有效预防紫杉醇对小鼠卵巢储备功能的损害,保护卵巢储备功能。     

不同浓度血管活性肠肽(VIP)对新生大鼠原始卵泡体外发育影响的实验研究

目的:观察不同浓度血管活性肠肽(VIP)对新生4 d大鼠卵巢体外培养过程中原始卵泡存活和生长发育的影响。方法:取新生4 d大鼠的卵巢72个,随机分为6组:新鲜组、基础培养组和不同浓度VIP组(10-9~10-6 mol/L)。新鲜组不经培养、其余各组体外培养14 d行组织形态学检查、增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学和TUNEL凋亡分析。结果:①各培养组的1级(早期初级)卵泡百分比明显高于新鲜组(P<0.05),且VIP 10-7 mol/L组最高。②各培养组PCNA阳性率与新鲜组比较均有统计学差异(P<0.001);不同浓度VIP组与基础培养组比较有统计学差异(P<0.05);VIP 10-7 mol/L组卵泡PCNA阳性率最高,与其他VIP浓度组比有显著差异(P<0.05),③各培养组卵泡凋亡率均显著高于新鲜组(P<0.001),培养组中以VIP 10-7 mol/L组较低,与VIP 10-8 mol/L组和VIP 10-9 mol/L组间有统计学差异(P<0.05)。结论:在卵巢体外培养过程中,VIP可以促进新生4 d大鼠的原始卵泡向初级卵泡转化;不同浓度的VIP均可降低卵巢组织卵泡细胞的凋亡,提高卵泡体外存活能力,VIP10-7 mol/L较其他浓度更明显地促进卵泡细胞的增殖,降低卵泡细胞的凋亡。     

促性腺激素释放激素类似物预防化疗对大鼠卵巢损伤作用的研究

目的:探讨促性腺激素释放激素(GnRHa)在减轻化疗所致的大鼠卵巢功能损害的作用。方法:选用2-3月龄Wister雌性大鼠40只,随机分为正常对照组、环磷酰胺(CTX)组、GnRHa组、CTX+GnRHa组。用药后比较4组大鼠卵巢、子宫湿重和形态学变化,并采用放射免疫方法测定4组大鼠FSH、E2。结果:光镜下可见GnRHa能明显改善CTX对卵巢、子宫的损害;CTX组与正常对照组比较FSH升高、E2水平明显降低(P<0.01),子宫和卵巢重量减轻(P<0.01)。CTX使各期卵泡总数显著减少,GnRHa使生长卵泡数、成熟卵泡数减少,而初级卵泡数增加,且总卵泡数增加。CTX+GnRHa组保存了大部分初级卵泡,总卵泡数增加。结论:GnRHa的先期应用对预防化疗所致的大鼠卵巢损伤有一定的保护作用。     

PRL对体外培养的猪颗粒细胞中FSH受体亲和力及孕酮生成的作用

卵泡刺激索(FSH)对其受体(FSH-R)的作用是卵泡发育过程的中心环节。泌乳素(PRL)是促进细胞分化与增殖的生长调节因子,但PRL亦可通过抑制促性腺激素分泌而抑制卵巢功能。该研究目的为进一步确定PRL对颗粒细胞中FSH-R亲和力及孕酮(P)合成分泌的影响。从幼猪(p)卵巢非闭锁卵泡中提取未成熟颗粒细胞分成5组进行体外培养,即:空白对照组、生理浓度的羊(o)PRL组(1205ng/ml)、3个高浓度oPRL组(25,50,75ng/ml)。5组细胞培养4天,培养基中均加入纯化的pFSH(10ng/ml)。每2天更换培养基1次,保存于-20℃行孕酮放射     

表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子(IGF-Ⅱ)对小鼠1-细胞胚胎体外发育的影响

目的:研究表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)在小鼠早期胚胎体外发育中的作用,以及EGF联合胰岛素样生长因子-Ⅱ(insulin-likegrowthfactor-II,IGF-Ⅱ)对小鼠早期胚胎体外发育是否有协同促进作用。方法:①在mKSOM培养液中添加0ng/ml(对照组)、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml的EGF、10ng/mlIGF-Ⅱ、1ng/mlEGF+1ng/mlIGF-Ⅱ、1ng/mlEGF+10ng/mlIGF-Ⅱ、10ng/mlEGF+1ng/mlIGF-Ⅱ、10ng/mlEGF+10ng/mlIGF-Ⅱ培养小鼠1-细胞胚胎,每组胚胎在培养箱中连续培养120h,每24h观察胚胎发育情况,分别计算2-细胞率、4-细胞率、桑椹胚率、囊胚率和孵化率,并进行囊胚细胞计数。结果:添加1ng/ml、10ng/mlEGF组的囊胚率及孵化率显著增加;EGF+IGF-Ⅱ组较单一添加组、对照组囊胚率及孵化率显著增加(P<0.05),且EGF+IGF-Ⅱ组囊胚细胞计数显著高于其他组(P<0.05),其中10ng/mlEGF+10ng/mlIGF-Ⅱ组的孵化率及囊胚细胞数最高(P<0.05)。结论:EGF浓度在1￣10ng/ml范围内可以提高体外培养鼠胚的囊胚率及孵化率;EGF及IGF-Ⅱ对体外培养鼠胚的发育有协同促进作用;本实验范围内10ng/mlEGF+10ng/mlIGF-Ⅱ为最优组合。     

解冻周期移植日血清孕酮水平与妊娠结局的关系研究

目的:探讨解冻周期移植日血清孕酮(P)水平与妊娠结局的关系。方法:选取在我院生殖内分泌科自然周期准备内膜的932个解冻周期,其中宫内活胎组348个、未妊娠组(包括生化妊娠)484个、妊娠结局不良组(3个月内流产者)100个。分析患者的移植日血清P水平对妊娠率和早期流产率的影响。结果:宫内活胎组和妊娠结局不良组的移植日血清P水平显著高于未妊娠组[(35.4±21.4)ng/ml、(25.6±19.5)ng/ml vs(18.2±17.4)ng/ml,P0.05)]。移植日血清P5ng/ml组和5ng/ml≤P15ng/ml组的临床妊娠率显著低于P≥15ng/ml组(25%、27%vs 42%,P0.05)。P5ng/ml组和5ng/ml≤P15ng/ml组的流产率显著高于P≥15ng/ml组(100%、46%vs 21%,P0.05);P5ng/ml组显著高于5ng/ml≤P15ng/ml组(P0.05)。结论:解冻周期移植日检测血清P水平对妊娠结局有一定的预测价值。     

壬基酚孕期经口染毒对F1代昆明小鼠卵巢发育的影响

目的:观察壬基酚孕期暴露对F1代昆明小鼠卵巢发育的影响。方法:交配后7d起,对孕鼠分别每日灌胃壬基酚(NP)(分别为1.2mg/kg、12mg/kg、120mg/kg),对照组灌胃花生油,直至交配后17d,每组7只。子代小鼠出生14d时取卵巢组织病理学检查,计数各级卵泡。观察子代雌鼠观察阴道开口时间和规律动情周期出现时间。子代雌鼠成年3月龄后,于动情前期处死,放免法测定血清E2、FSH浓度,酶联免疫吸附法测定血清抑制素B浓度,取卵巢组织行病理学检查,计数各级卵泡。结果:NP低剂量组阴道开口出现时间提前(P<0.05);低、中剂量组规律动情周期出现时间提前并可见动情周期延长(P<0.05);高剂量组性成熟期始基卵泡数减少(P<0.05),血清抑制素B水平降低(P<0.05);各用药组动情前期血清E2水平降低(P<0.05),FSH水平无明显变化。用药组体质量较对照组明显升高(P<0.05)。结论:壬基酚胎仔宫内暴露,在较低剂量时可影响小鼠的动情起始及动情周期,在较高剂量时可降低卵巢储备,并可影响成年后小鼠雌激素水平。     

紫杉醇与多烯紫杉醇对小鼠卵巢储备能力的影响

目的:探索多次重复小剂量紫杉醇与多烯紫杉醇对小鼠卵巢储备功能的影响。方法:30只昆明雌性小鼠随机分组,即对照组(生理盐水0.2 ml/d×20 d)、紫杉醇组[紫杉醇注射液6.0 mg/(kg·d)×20 d]、多烯紫杉醇组[多西他赛注射液1.5 mg/(kg·d)×13 d],每组10只,用药期间每日观察小鼠的一般情况、动情周期,用药结束后观察小鼠血清FSH、E2水平、卵巢质量、形态结构和各级卵泡数的变化。结果:用药结束后紫杉醇组FSH水平(54.59±12.73 pg/ml)高于对照组(31.85±9.82 pg/ml),E2水平(27.39±9.36 pg/ml)低于对照组(55.26±13.41 pg/ml),差异有统计学意义(P0.05);而多烯紫杉醇组FSH(33.27±5.91 pg/ml)、E2(49.56±3.57 pg/ml)变化较对照组不明显,差异无统计学意义(P0.05);紫杉醇组FSH、E2水平变化较多烯紫杉醇组差异有统计学意义(P0.05)。紫杉醇组小鼠的总卵泡数(598±159个)和卵巢质量(7±2 mg)与对照组小鼠(1 243±137个,27±6 mg)比较,差异均有统计学意义(P0.05);多烯紫杉醇组小鼠的总卵泡数(1 143±130个)和卵巢质量(22±5 mg)与对照组小鼠比较,差异均无统计学意义(P0.05);小鼠的总卵泡数和卵巢质量组间差异均有统计学意义(P0.05)。结论:多次重复小剂量紫杉醇与多烯紫杉醇对卵巢储备功能均有不同程度的影响,其中紫杉醇影响更为严重。     

Dynamic medium produces caprine embryo from preantral follicles grown in vitro

The aim of this study was to develop a dynamic culture medium containing FSH, LH and EGF to promote the in vitro development of oocytes obtained from goat preantral follicles to complete maturation and to improve the capacity of these oocytes for in vitro fertilization (IVF) and embryo production. For experiment I, preantral follicles were cultured for 18 days in medium supplemented with increasing concentrations of FSH (T1 - control) or in control medium added LH alone or in association with EGF: T2 (LH 50 ng/ml), T3 (LH 50 ng/ml + EGF 50 ng/ml), T4 (LH 50 ng/ml + EGF 100 ng/ml), T5 (LH 100 ng/ml), T6 (LH 100 ng/ml + EGF 50 ng/ml) and T7 (LH 100 ng/ml + EGF 100 ng/ml). For experiment II, preantral follicles were cultured only in the culture medium used in T7, and after 18 days, their oocytes underwent in vitro maturation (IVM) followed by IVF. At the end of the culture period, T3, T4 and T7 had a positive influence on the daily follicular growth rate. Oocytes grown in T4 and T7 had a meiosis resumption percentage significantly superior to the other treatments. Two embryos were obtained, in which preantral follicles in medium supplemented with 100 ng/ml LH and 100 ng/ml EGF (T7). In conclusion, our sequential culture system was able to promote the in vitro growth of preantral follicles, promoting their oocyte maturation and caprine embryo production from preantral follicles.     

子痫前期滋养细胞sFlt-1和HIF-1α表达及细胞功能在低氧条件下的变化

目的探讨低氧对子痫前期滋养细胞中可溶性血管内皮生长因子受体-1（sFlt-1）和缺氧抑制因子-1α（HIF-1α）的表达及滋养细胞凋亡和侵袭能力的影响。方法取正常妊娠及子痫前期孕妇终止妊娠后的胎盘绒毛组织,分离培养滋养细胞。分为：对照组（正常孕妇）：21%O2浓度培养;子痫前期组：分别行21%O2浓度（21%O2组）和1%O2浓度（1%O2组）培养。采用细胞免疫荧光检测滋养细胞密度,实时定量-多聚酶链反应（real tima-PCR）和蛋白印记（Western Blot）法检测滋养细胞中sFlt-1和HIF-1αmRNA及蛋白的表达,TUNNEL法检测滋养细胞调亡,Transwell测定滋养细胞的侵袭能力。结果子痫前期21%O2组、1%O2组与对照组sFlt-1mRNA的表达分别为（2.87±1.94）ng/ml、（3.51±1.25）ng/ml和（1.93±0.77）ng/ml,HIF-1αmRNA的表达分别为（2.79±0.64）ng/ml、（1.77±0.23）ng/ml和（3.63±0.38）,三组比较,差异均有统计学意义（P均〈0.01）。21%O2组、1%O2组与对照组sFlt-1蛋白分别为（4.99±1.77）μg/ml、（7.02±1.23）μg/ml和（3.83±0.63）μg/ml,HIF-1α蛋白分别为（3.83±0.63）μg/ml、（3.06±0.25）μg/ml和（7.73±1.02）μg/ml,三组比较,差异均有统计学意义（P均〈0.01）。21%O2组、1%O2组与对照组72h滋养细胞凋亡分别为（15.81±3.93）个、（20.18±3.47）个和（6.64±1.37）个,侵袭数目分别为（10.05±1.92）个、（18.65±4.17）个和（2.22±0.43）个,三组比较,差异均有统计学意义（P均〈0.01）。结论子痫前期和正常妊娠孕妇滋养细胞均对低氧敏感,低氧对滋养细胞sFlt-1和HIF-1α的表达有影响,且低氧条件下促使滋养细胞凋亡及侵袭能力强化。     

X线辐射对大鼠卵巢形态与功能的影响

目的：探讨X线电离辐射对大鼠卵巢形态与功能的影响。方法：实验分0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 Gy剂量组,每组各10只大鼠。采用HE染色观察各级卵泡数目,免疫组化法观察P53、Bcl-2蛋白表达,TUNEL法测定颗粒细胞中凋亡小体的表达。结果：随大鼠机体接受X线照射剂量增加,始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡数目随之减少（P＜0.05或P＜0.01）,以始基卵泡减少为著;不同剂量X线照射后窦状卵泡数目与假照射组差异无统计学意义（P＞0.05）。当吸收剂量为0.2 Gy,卵巢颗粒细胞中P53蛋白及凋亡小体表达较假照射组减少,Bcl-2蛋白有所增多（P＜0.05或P＜0.01）,而吸收剂量在0.4～1.0 Gy时,P53蛋白及凋亡小体的表达水平随吸收剂量的增加而上升（P＜0.05或P＜0.01）,Bcl-2蛋白表达水平减少（P＜0.01）。结论：X线可使大鼠卵巢组织中始基卵泡的数目有所减少,促进细胞发生凋亡,进一步影响颗粒细胞的内分泌功能。     

3种玻璃化液对新生鼠卵巢的渗透反应及冻存效果的比较

目的:探索适宜新生鼠卵巢保存的玻璃化液和冷冻方案。方法:观察新生SD大鼠卵巢在预平衡液及3种玻璃化液中不同时间段的表面积变化,冻融后进行组织学观察和成年SD大鼠肾被膜下异体移植后在体活力分析。结果:新生鼠卵巢在预平衡液中出现渗透性脱水变化,移入EFS40(A组)、EG5.5(B组)、EG5.5/30(C组)3种玻璃化液中,再次剧烈皱缩。3min后,卵巢表面积分别为等渗液对照组表面积的63.2%、82.4%、70.8%。此脱水状态的卵巢玻璃化冻融后形态完整的卵泡百分率均与新鲜移植组(D组)无显著性差异(P>0.05);异体移植后,动情周期出现率和动情周期出现时间均与D组无显著性差异(P>0.05)。各冷冻移植组存活移植物均可见不同发育阶段的各级卵泡,但卵泡数目少于D组,移植20d时A组与D组间有显著性差异(P<0.05);移植60d时B组卵泡数少于D组,组间有差异(P<0.05);C组在各时间点上取材的卵泡数与D组均无差异(P>0.05)。结论:在预平衡液中15min、改良的EG5.5/30液中3min的二步渗透平衡法适宜新生鼠卵巢的玻璃化冷冻。