小鼠体外发育卵母细胞生长分化因子-9基因表达

目的体外培养小鼠窦前卵泡得到MⅡ期卵母细胞,比较发育过程中体外与体内卵母细胞生长分化因子-9(GDF-9)的基因表达量,初步探讨GDF-9的表达对卵母细胞体外发育成熟的影响。方法出生D10雌性昆明小鼠50只,机械方法分离窦前卵泡,体外培养12d。分别于体外培养D2、D4、D6、D8、D10、D12分离卵母细胞作为体外发育组;同窝雌性小鼠出生后D12、D14、D16、D18、D20、D22卵母细胞作为体内发育组;使用半定量逆转录多聚酶链反应技术分别检测两组单个卵母细胞GDF-9基因表达量。应用计算机全自动图像分析仪测量PCR产物电泳条带的几何平均光密度,基因表达量用相对光密度表示:检测基因光密度/管家基因(β-actin)光密度。结果培养第12天观察306个卵泡,274个卵泡成活(89.5%),143个窦腔形成(51.8%);第13天观察,155个卵母细胞成熟(56.6%)。体外发育D2、D4、D6、D8、D10、D12卵母细胞GDF-9基因表达相对光密度分别是0.83±0.08、0.52±0.09、0.45±0.13、0.49±0.09、0.49±0.09、0.68±0.08;体内发育D12、D14、D16、D18、D20、D22卵母细胞GDF-9基因表达相对光密度分别是0.64±0.35、0.48±0.10、0.52±0.10、0.66±0.08、0.72±0.09、0.91±0.11;体外发育D8￣12卵母细胞GDF-9表达量明显低于同期体内发育卵母细胞(P<0.05)。结论小鼠窦前卵泡体外培养后可以生长发育,部分得到成熟的卵母细胞。小鼠卵母细胞GDF-9基因表达量随发育时间的改变发生变化;体外发育D8￣12卵母细胞GDF-9基因表达量低于同期体内发育的卵母细胞可能是其发育潜能较低的原因之一。     

高尔基体对小鼠卵母细胞体外发育进程的影响

目的初步探讨高尔基体在小鼠卵母细胞体外发育进程中的作用。方法布雷菲德菌素A（Brefeldin A，BFA）处理小鼠未成熟，成熟卵母细胞，利用特异性标记物阻COP标记高尔基体。激光扫描共聚焦显微镜观察BFA处理对高尔基体产生的影响；同时。观察并比较不同处理组小鼠未成熟／成熟卵母细胞的体外成熟率、孤雌激活率、体外受精率及2-细胞率。结果GV期卵母细胞经BFA处理后，高尔基体的形态和分布发生明显改变。其体外成熟率（2．5％）与对照组（70．4％）比较统计学差异显著（P〈0．001）；洗掉BFA后，其体外成熟率（67．2％）与对照组无统计学差异（P〉0．05）。另外，成熟卵母细胞经BFA处理后。其体外受精率及2．细胞率均与对照组差异无统计学意义（P〉0．05）。结论小鼠卵母细胞体外成熟的正常进行需要高尔基体主导的膜运输。而体外受精和受精卵卵裂过程中不需要功能性的高尔基体。     

氯化锌对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的探讨氧化锌对小鼠卵母细胞体外成熟的影响。方法采用细胞体外培养的方法,观察卵母细胞在分别含有低、中、高浓度(0μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)氯化锌的M199培养液中体外成熟率和减数分裂的变化情况。结果1μg/mlZnCl2组GVBD发生率在4、8h明显高于对照组(P<0.01),16、24h高于对照组(P<0.05);而10μg/mlZnCl2组GVBD发生率在各时间点均明显低于对照组(P<0.01)。8h后,1μg/mlZnCl2组PB1排出率明显高于对照组(P<0.05),而10μg/mlZnCl2组PB1排出率明显低于对照组(P<0.05)。结论锌对体外小鼠卵母细胞成熟和减数分裂有重要的影响。     

不同剂量促排卵激素对昆明小鼠卵子及胚胎发育潜能的影响

目的比较不同剂量激素促排卵之间的效果优劣,选择最优化的促排卵方案,为辅助生殖助孕中选择最佳促排卵药物剂量方案提供参考。方法选择性成熟小鼠先确定其处于发情前期,随机分组,按发情阶段,将不同剂量的激素组合孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)+人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,HCG)由低到高依次分成(0+0)、(5+5)、(7.5+7.5)、(10+10)、(12.5+12.5)、(15+15)IU/只,分别促小鼠排卵。建立促排卵激素妊娠小鼠模型后获取孕12 h受精卵,观察获取卵母细胞的数目、原核数、受精率、卵裂率以及囊胚形成率。结果在获取卵母细胞的数目上,当剂量达到(12.5+12.5)IU/只时最高,达到51.83个;在卵裂率上各组无差别,在受精率上当剂量达到(7.5+7.5)IU/只时最高,达到82.32%,在囊胚形成率上,当剂量为(0+0)IU/只时,显著高于其他超促排卵组,达到79.78%。结论随着促排卵剂量的增加,虽然鼠胚的卵裂率未受到影响,但受精率、囊胚形成率与剂量呈负相关,激素剂量的加大影响了胚胎的发育潜能。     

雄激素对卵母细胞生长分化因子

通过观察雄激素对小鼠卵母细胞生长分化因子 9（growth differentiation factor 9,GDF 9）表达的影响，研究GDF 9参与卵泡生长发育及其表达调控机制，探讨GDF 9与多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)的关系。方法：以性成熟昆明小鼠为研究模型，体内实验分为实验组（注射丙酸睾丸酮）和对照组（注射等体积的生理盐水），每组各20只小鼠，采用原位杂交法检测卵巢组织GDF 9 mRNA的表达水平。体外实验：胶原酶消化加机械法分离性成熟昆明小鼠卵泡进行体外培养，实验组培养液中加睾丸酮,对照组不加睾丸酮,72?h后收集卵泡，免疫组化检测卵母细胞GDF 9的表达水平。结果：体内实验：实验组较对照组卵巢组织GDF 9 mRNA表达水平降低, 差异有统计学意义（P＜0.05）；体外实验：实验组卵母细胞GDF 9蛋白表达较对照组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：雄激素减弱卵母细胞GDF 9 mRNA和蛋白的表达强度；表达强度降低的GDF 9可能与PCOS卵泡发育停滞有关     

硝酸铅,氯化镍对体外培养小鼠卵母细胞成熟的影响

采用卵母细胞体外的方法研究了硝酸铅、氯化镍对小鼠卵母细胞成熟的影响。结果表明,硝酸铅、氯化镍都能抑制小鼠卵母细胞第一极体的释放,降低卵母细胞的质量和体外存活率,但是对卵母细胞生发泡破裂没有影响,提示,硝酸铅、氯化镍有明显的生殖毒性。     

小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的研究

目的　对小鼠卵母细胞玻璃化的方法和冷冻液进行研究。方法　用两种玻璃化冷冻液EFS4 0 (高钠 )、DEFS4 0 (低钠 )对ICR、C57BL 6J小鼠卵母细胞进行冷冻 ,0 5mol L蔗糖液解冻 ,体外授精前对部分解冻后的C57BL 6J小鼠卵母细胞进行透明带切割。结果　DEFS4 0冷冻液冷冻效果明显高于EFS4 0冷冻液 ,ICR小鼠卵母细胞解冻后成活率达 75 2 %、体外授精率 (2 4 6 % )与对照组相比差异无显著性 ,C57BL 6J小鼠卵母细胞解冻后成活率为 87 1%、卵母细胞切割后体外受精率 (36 0 % )与对照组相比差异也无显著性。结论　冷冻液中钠离子浓度影响小鼠卵母细胞冷冻效果 ,用DEFS4 0 (低钠 )冷冻液进行玻璃化冷冻可以取得理想的冷冻效果。     

细胞松弛素B预处理对小鼠卵母细胞玻璃化冻融后发育潜能的影响

目的:观察细胞松弛素B (Cytochalasin B,CB)预处理对小鼠卵母细胞玻璃化冻融后发育潜能的影响.方法:用浓度为0(对照)、5、10、20、40 μg/ml的CB分别预处理小鼠成熟卵母细胞后玻璃化冷冻,解冻后进行体外受精,观察卵母细胞的复苏率、受精率、6～8 cell胚胎形成率.结果:CB 20、40μg/...     

磷酸二酯酶5选择性抑制剂zaprinast对小鼠卵母细胞成熟的影响

目的研究磷酸二酯酶5(PDE5)选择性抑制剂扎普司托(zaprinast)对小鼠卵母细胞体外成熟的影响。方法采用小鼠卵母细胞自发成熟、促卵泡刺激素(FSH)诱导次黄嘌呤(HX)阻滞成熟以及卵泡卵母细胞成熟三种体外培养模型。结果10μmol/L的zaprinast不仅能显著抑制小鼠卵丘卵母细胞复合体(COCs)和裸卵(DOs)的自发成熟(P<0.01),而且还能显著抑制FSH对HX阻滞的COCs的以及卵泡卵母细胞成熟的促进效应(P<0.01)。结论PDE5能促进小鼠卵母细胞的体外成熟。     

不同浓度雷帕霉素对小鼠卵母细胞体外成熟及发育潜能的影响

目的 探究不同浓度雷帕霉素对小鼠卵母细胞体外成熟(in vitro maturation, IVM)结局的影响及其在最佳浓度下对卵母细胞质量产生的具体效应。方法 收集雌性ICR小鼠的未成熟卵母细胞(GV期)进行IVM,在培养液中添加不同浓度的雷帕霉素(1 nmol/L～10μmol/L),通过比较成熟率和激活率,筛选最佳作用浓度。随后,在处理组的培养液中加入最佳浓度的雷帕霉素,对处理组与对照组中IVM卵母细胞的激活后发育情况、纺锤体组装、染色体排列情况进行比较。结果 10 nmol/L雷帕霉素培养组的卵母细胞在IVM后呈现出较高的成熟率[(84.5±1.6)%]和激活率[(62.4±1.5)%],故选择10 nmol/L作为添加雷帕霉素的最佳浓度。在随后的培养中,10 nmol/L雷帕霉素组激活胚胎的卵裂率和囊胚形成率也较对照组显著升高[卵裂率：(54.9±2.6)%vs.(41.9±2.1)%,P=0.0178;囊胚形成率：(12.5±1.6)%vs.(6.4±1.4)%,P=0.0441]。此外,与对照组相比,10 nmol/L雷帕霉素组的成熟卵母细胞染色体排列异常率降低[染色体异...     

Effect of Mouse Oocyte Vitrification on Mitochondrial Membrane Potential and Distribution简

The effects of mouse oocyte vitrification on mitochondrial membrane potential and distribution were explored in this study. The collected mouse oocytes were randomly divided into vitrification and control groups. Ethylene glycol（EG） and dimethylsulphoxide（DMSO） were used as cryoprotectants in the vitrification group. The mitochondrial function and distribution in the oocytes were examined by using the fluorescent probes, JC-1 and Mito Tracker green. The results showed that the ratio of red to green fluorescence in mouse oocytes was significantly decreased after thawing in the vitrification group as compared with the control group（1.28 vs. 1.70, P0.05）. The percentage of polarized distribution of the mitochondria in oocytes was conspicuously reduced in the vitrification group when compared with the control group（31% vs. 63%, P0.05）. It was suggested that vitrification significantly affects the mitochondrial function and distribution in oocytes and reduces the potential of oocyte fertilization and embryo development.     

玻璃化冷冻技术在保存人类不同发育阶段卵细胞和胚胎中的应用

玻璃化冷冻技术已逐渐成为辅助生育技术中重要的应用技术之一,在保存未成熟卵细胞、成熟卵细胞、原核期胚胎、卵裂早期胚胎及囊胚方面均取得成功,并相继有临床妊娠分娩的报道。本文总结了玻璃化冷冻技术在保存人类不同发育阶段卵细胞和胚胎方面的应用。     

成纤维细胞生长因子-2对年轻和年老小鼠骨祖细胞增殖和分化的影响

目的：比较在不同浓度和培养时间下,成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-2,FGF-2）对年轻和年老小鼠颅盖骨来源的骨祖细胞增殖的影响差异,并观察FGF-2对不同表型细胞的作用.方法：利用定时和连续的酶消化年轻（3个月龄）和年老（19～22个月龄）小鼠颅盖骨获取骨祖细胞,并进行原代培养.利用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性鉴定细胞的成骨活性.选取原代培养的骨祖细胞给予不同浓度的FGF-2,在不同的培养时间采用MTS法观察细胞增殖情况.采用两种成骨细胞谱系的分化标志物活化白细胞黏附分子（activated leukocyte cell adhesion molecule,ALCAM）和平滑肌肌动蛋白（smooth muscleactin,SMA）进行免疫荧光检测,观察FGF-2对不同表型细胞的作用.结果：质量浓度为1.6 ng/mL 和0.16 ng/mL的FGF-2,在培养4 h和24 h时对年轻小鼠骨祖细胞的增殖有促进作用,而对于年老小鼠的增殖促进作用出现在培养至48 h和72 h.年轻和年老小鼠的骨祖细胞中,均可表达ALCAM和SMA两种蛋白,FGF-2对SMA的阳性细胞比例没有明显影响,但可增加ALCAM阳性细胞的比例,并且这种促进作用对于年轻小鼠出现的更早.结论：适宜质量浓度的FGF-2可以促进小鼠骨祖细胞的增殖,与年轻小鼠相比,年老小鼠的骨祖细胞对FGF-2的反应性下降.FGF-2可能对促进老年骨增量中具有潜在治疗价值.     

Relationship between ATP Content and the Developmental Potential of Human Oocytes

Metabolic activity and energy production are es-sential to oocyte cytoplasmic maturation,meiotic re-sumption,normal fertilization,embryo cleavage,hatching and implantation[1] .The ATP in ooplasmwas utilized for nucleic acid and protein synthesis.The ATPcontentofoocyteshasbeen suggested as anindicator for the developmental potentialof mouse[2 ] ,cow[3] and cat[4 ] oocytes.Additionally,the result ofVan Blerkom' sresearch[5] also showed a positive cor-relation between human oocytes competence …     

Cloning of Integral Mature Peptide Gene of Human GDF-5

The integral mature peptide gene of human growth differentiation factor-5 (GDF-5) was出人物cloned to provide the essential foundation for study on the biological characteristics of GDF-5 at gene and protein levels. Two primers were chemosynthesized according to the hGDF-5 sequence reported in Genbank. The hGDF-5 gene was gained by RT-PCR methods from the total RNA extracted from human fetus cartilage tissue, and was cloned into vector pMD18-T. The sequence of recombinant plasmid pMD18-T-hGDF-5 was analyzed by sequence analysis. DNA agarose gel electrophoresis showed that the product of RT-PCR was about 380bp, and double enzyme digestion of the recombinant plasmid corresponded with it. The result of sequence assay was in agreement with the reported hGDF-5 sequence in Genbank. Our results showed that the integral mature peptide gene of human GDF-5 was cloned successfully from human fetal cartilage tissue, and totally identified with the seouence of human GDF-5 in Genhank.     

胰岛素样生长因子结合蛋白4转基因小鼠脑内细胞分化的研究

目的 研究神经元特异性启动子血小板源性生长因子-β（platelet derived growth factor-β, PDGF-β）介导的胰岛素样生长因子结合蛋白4（insulin-like growth factor binding protein 4,IGFBP4）转基因小鼠脑内神经元和神经胶质细胞分化情况。方法 PCR扩增并测序鉴定PDGF-β启动子和IGFBP4 cDNA表达框的整合,Isotropic Fractionator细胞计数法分析海马少突胶质前体细胞比例,Western blotting法分析生后28 d小鼠海马等部位神经元和神经胶质细胞的分化、胰岛素样生长因子-1（insulin-like factor-1, IGF-1）受体通路激活以及细胞存活相关分子表达, Rotarod实验观察小鼠运动能力。结果 IGFBP4 cDNA稳定整合于小鼠基因组,转基因小鼠海马少突胶质前体细胞数目和成熟细胞髓磷脂碱性蛋白（myelin basic protein, MBP）均明显增多,神经元和星形胶质细胞标志物NeuN和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）表达改变不明显;Erk1, 2和Akt磷酸化升高,p38的激活不明显;Caspase-3表达下调,β-catenin和Bcl-2表达无明显改变,12月龄小鼠Rotarod运动能力明显增强,其小脑和皮质NeuN表达增多。结论 神经元过表达IGFBP4促进小鼠脑少突胶质细胞和神经元的分化。     

Effect of the gap junction blocker 1-heptanol on chondrogenic differentiation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

Objective:To investigate the effect of the gap junction blocker 1-heptanol on the in vitro chondrogenic differentiation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs) following induction by GDF-5. Methods:MSCs were isolated from mouse bone marrow and cultured in vitro. After 3 passages cells were induced to undergo chondrogenic differentiation with recombinant human GDF-5(100 ng/ml), with or without 1-heptanol(2.5μmol/L). The effect of 1-heptanol on MSCs proliferation was investigated using the MTT assay...     

Experimental Study on Meiotic Spindles and Chromosomes of Mouse Mature （MⅡ） Stage Oocytes under Laser Scanning Confocal Microscopy

The in vitro culture,maturation and cryopr-eservation of oocytes are all the i mportant parts inthe assisted reproductive technology.Mature oo-cyte(i.e.MⅡoocytes)is arrested at the meta-phase stage of meiosisⅡ,in which chromosomesare attached to the spindle microtubles and line uponthe equatorial plateinthe normal spindles.Dis-organized structure of spindles can not onlylead tosuch morphologic changes as unwound chromo-somes but also the chromosome nondisjuction andresultant aneuploid.When t…     

益气养阴方对卵巢低反应患者超促排卵的影响

目的研究益气养阴方对卵巢低反应(POR)患者超促排卵(COH)结局的影响。进一步探讨其对血清和卵泡液生长分化因子-9(GDF-9)、骨形态发生蛋白-15(BMP-15)表达的影响。方法将接受体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗的POR患者COH共94个周期,按COH开始日期,单号日纳入对照组48个,双号日纳入治疗组46个。2组均采取微刺激方案进行COH,治疗组在此基础上,从月经第2天开始加用益气养阴方至人绒毛膜促性腺激素(h CG)注射日。比较2组促性腺激素(Gn)使用总量、Gn刺激天数、获卵数、受精率、移植率、取卵周期妊娠率及周期取消率等临床数据。酶联免疫吸附(ELISA)法检测患者血清和卵泡液GDF-9、BMP-15水平,蛋白质印迹法(Western blot)检测蛋白表达。结果与对照组比较,治疗组Gn使用总量、周期取消率均显著降低;h CG日雌二醇(E2)水平、子宫内膜厚度、获卵数、取卵周期妊娠率均显著升高,差异均有统计学意义(P0.05)。治疗组血清和卵泡液GDF-9、BMP-15表达均较对照组显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论在IVF-ET中,益气养阴中药能与外源性激素协同作用,改善卵巢反应性,提高POR患者获卵数和妊娠率,可能与调控卵巢GDF-9、BMP-15表达有关。