人载脂蛋白C Ⅱ原核表达载体构建及蛋白表达方法

目的 构建人载脂蛋白CⅡ（ApoCⅡ）的原核表达载体,表达融合蛋白GST-hApoCⅡ.方法 采用限制性内切酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切pUC18/hApoCⅡ获得ApoCⅡ成熟肽基因片段,并与相同酶切处理的表达载体pGEX-3X连接构建重组质粒.重组质粒经酶切鉴定、测序验证后转化感受态E.coli DH5α,IPTG诱导表达,优化表达条件,表达产物经SDS-PAGE电泳分析鉴定.选取最佳条件诱导表达,亲和层系法纯化融合蛋白,采用Western blot鉴定.结果 重组质粒经酶切和测序后证实目的基因已连接入表达载体,SDS-PAGE检测到35 kD的目的蛋白条带,优化和纯化后经Western blot证实蛋白质产物为融合蛋白GST-hApoCⅡ.结论 本方法成功表达融合蛋白GST-hApoCⅡ,此为ApoCⅡ结构及其作用机理研究及制备ApoCⅡ抗体等提供了便利条件.     

金葡菌野生株SEB基因的亚克隆及其原核表达

目的亚克隆金葡菌野生株S407030肠毒素B(SEB)基因,并在大肠埃希菌(E.coli)中表达,以获得重组SEB(rSEB)蛋白。方法将含有SEB基因的质粒pMD-18T/SEB双酶切获得目的片段,插入表达载体pGEX-4T-2中构建重组子pGEX-4T-2/SEB,并转化E.coliJM109感受态菌,阳性克隆以双酶切和PCR法鉴定;含重组质粒的工程菌以IPTG诱导表达rSEB蛋白;表达产物进行SDS-PAGE分析,并采用B-PER GST融合蛋白试剂盒纯化重组rSEB,West-ern blot鉴定其免疫反应性。结果重组质粒经双酶切和PCR扩增鉴定均获得约705 bp的基因片段,与预期结果相一致;诱导表达的含GST的融合重组rSEB蛋白分子质量单位约为53 ku,纯化后作SDS-PAGE电泳显示一条蛋白带,Western blot显示rSEB能够被兔抗SEB抗体识别。结论金葡菌野生株SEB在大肠埃希氏菌中得到有效表达,并获得电泳级纯度的重组rSEB,重组蛋白具有一定的免疫活性,为进一步研究其生物毒性与开发诊断试剂提供了生物材料。     

华支睾吸虫成虫RPEF基因的克隆和表达

目的　构建华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子 (RPEF)基因重组质粒 ,分析其编码序列 ,并进行大肠杆菌原核重组表达和免疫鉴定。方法　根据RPEF基因已知序列设计一对引物 ,用常规PCR技术从华支睾吸虫质粒文库模板中扩增RPEF基因片段 ;将目的基因PCR产物和空质粒 pGEX 4T 1同时用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切 ,纯化回收后建立连接反应并转化大肠杆菌BL2 1。将构建的重组质粒pGEX 4T 1 RPEF双酶切、PCR、测序鉴定正确后在BL2 1中诱导表达 ,SDS PAGE电泳和Western blot方法鉴定其原核表达效果。结果　成功构建出RPEF基因原核重组质粒 pGEX 4T 1 RPEF。SDS PAGE分析显示RPEF基因在大肠杆菌BL2 1系统中得以高效表达 ,其融合蛋白分子量大约 4 5kD ,与理论值相符。Western blot的结果显示此RPEF融合蛋白可被山羊GST单抗所识别 ,融合蛋白具有GST免疫反应性。结论　筛选到华支睾吸虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子 (RPEF)基因 ,并成功构建原核表达载体及在E .coliBL2 1系统中高效表达。     

尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH和fimC基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建以尿路致病性大肠杆菌(UPEC)Ⅰ型菌毛编码基因fimH和fimC为目的基因的原核重组表达质粒,诱导其在E.coliBL-21中表达,并对其免疫原性进行分析。方法PCR法自UPEC标准菌株J96获取fimH和fimC基因,分别插入原核表达载体pGEX-4T-2;将重组表达质粒转染感受态E.coliBL-21,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE和Westernblot鉴定并纯化目的蛋白fimH和fimC蛋白,定量后免疫BALB/c小鼠,动态检测抗体产生水平。结果PCR法克隆出全长为903bp的fimH和720bp的fimC基因,构建的原核表达质粒pGEX-4T-2-fimH及pGEX-4T-2-fimC经诱导可分别表达出60KD和48KD左右的GST融合蛋白;蛋白经纯化后免疫动物能诱导产生高效价的IgG抗体。结论成功获取了UP-ECⅠ型菌毛基因fimH和fimC,所构建的原核表达质粒在BL-21中成功表达;fimH有免疫原性。     

旋毛虫Ts43基因的克隆与原核表达

目的构建旋毛虫Ts43基因原核表达载体，并且在大肠埃希菌中表达。方法将构建的pMD-Ts43克隆质粒酶切回收目的片段定向克隆到pET-28a（＋）载体上，构建原核表达载体pET-28a—Ts43，酶切鉴定正确后，导入菌株Rosetta中，用IPTG诱导表达，并经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果成功构建了含目的基因的原核表达质粒pET-28a—Ts43，IPTG诱导表达分子质量单位约为43ku的融合蛋白，与预测值相符。以0．9mmol／LIPTG诱导4．5h后表达量最高，薄层扫描表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20％。Western blot显示表达产物可被抗旋毛虫的多克隆血清识别。结论原核细胞融合表达旋毛虫Ts43基因获得成功，为旋毛虫重组苗的研究奠定了基础。     

卡氏肺孢子菌55kDa抗原的原核表达与纯化

目的体外扩增卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii,Pc)55kDa抗原(p55)570bp的基因片段,构建原核表达载体pGEX-570,诱导表达并纯化重组蛋白。方法以卡氏肺孢子菌DNA为模板,扩增其基因片段,连接至pGEM-T载体,随后构建pGEX-570重组表达质粒,经双酶切、PCR及测序鉴定后将其转化入BL21大肠杆菌中,经IPTG诱导表达融合蛋白。采用透析袋电泳法纯化融合蛋白。结果重组表达质粒pGEX-570经酶切,PCR鉴定及测序结果表明构建成功。IPTG诱导表达融合蛋白GST-p55/570,分子量约为47kDa。用透析袋电泳法纯化重组蛋白,经SDS-PAGE确认正确。结论本研究成功构建了pGEX-570原核表达载体,诱导表达并纯化GST-p55/570融合蛋白。为进一步开展肺孢子菌55kDa抗原的研究奠定了基础。     

猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因的原核表达、纯化以及免疫反应性分析北大核心CSCD

目的原核表达猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因,分析重组蛋白的免疫反应性。方法参照GenBank中Ts8B2基因序列设计引物,以合成基因为模板获得预期DNA片段,双酶切后连接至原核表达载体pGEX-4T-1。将重组质粒转化入大肠埃希菌DH5α(E.coli DH5α),PCR、双酶切筛选阳性质粒,测序确认后转化至E.coli Rosstea,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表达产物。尿素法提取重组蛋白,然后以脑囊虫病患者血清为一抗,Western blot分析其免疫反应性。结果 Ts8B2基因PCR扩增产物为258 bp,与理论值一致。双酶切和测序鉴定重组表达质粒构建成功,SDS-PAGE分析重组质粒转化菌表达相对分子质量为3.5×10~3,以包涵体形式存在目的蛋白,Western blot分析尿素法提取的重组蛋白能被脑囊虫患者血清识别。结论成功构建Ts8B2基因重组表达质粒表达的重组蛋白具有免疫反应性,为进一步研究该蛋白在抗体检测中的应用奠定了基础。     

猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因的原核表达、纯化以及免疫反应性分析

目的原核表达猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因,分析重组蛋白的免疫反应性。方法参照GenBank中Ts8B2基因序列设计引物,以合成基因为模板获得预期DNA片段,双酶切后连接至原核表达载体pGEX-4T-1。将重组质粒转化入大肠埃希菌DH5α(E.coli DH5α),PCR、双酶切筛选阳性质粒,测序确认后转化至E.coli Rosstea,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表达产物。尿素法提取重组蛋白,然后以脑囊虫病患者血清为一抗,Western blot分析其免疫反应性。结果 Ts8B2基因PCR扩增产物为258 bp,与理论值一致。双酶切和测序鉴定重组表达质粒构建成功,SDS-PAGE分析重组质粒转化菌表达相对分子质量为3.5×10~3,以包涵体形式存在目的蛋白,Western blot分析尿素法提取的重组蛋白能被脑囊虫患者血清识别。结论成功构建Ts8B2基因重组表达质粒表达的重组蛋白具有免疫反应性,为进一步研究该蛋白在抗体检测中的应用奠定了基础。     

两种血吸虫病疫苗候选分子在原核细胞的融合表达

目的 在原核细胞中表达SjGST和Sj14-3-3的融合蛋白。方法 RT－PCR法从日本血吸虫成虫总RNA中扩增出Sj14-3-3基因，亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，并转化E.coli BL21,IPTG诱导表达，Western-blot鉴定表达产物。结果 扩增产物约为765bp，重组质粒经Bam HI和Xho I双酶切后可得到一与PCR产物大小相同的DNA片段，经IPTG诱导后在55ku附近出现一新增蛋白条带，Western-blot结果显示，表达产物可被免抗鼠14－3－3ε多克隆抗体识别。结论 在原核细胞融合表达SjGST和Sj14-3-3成功。     

两种血吸虫病疫苗候选分子在原核细胞的融合表达

目的　在原核细胞中表达 Sj GST和 Sj14- 3- 3的融合蛋白。　方法　 RT- PCR法从日本血吸虫成虫总 RNA中扩增出 Sj14- 3- 3基因 ,亚克隆至原核表达载体 p GEX- 4T- 1,并转化 E.coli BL2 1 ,IPTG诱导表达 ,Western- blot鉴定表达产物。　结果　扩增产物约为 76 5 bp,重组质粒经 Bam H 和 Xho 双酶切后可得到一与 PCR产物大小相同的 DNA片段 ,经 IPTG诱导后在 5 5 ku附近出现一新增蛋白条带 ,Western- blot结果显示 ,表达产物可被兔抗鼠 14- 3- 3ε多克隆抗体识别。　结论　在原核细胞融合表达 Sj GST和 Sj14- 3- 3成功。     

融合基因IFN-α1b/CSPⅡ原核表达载体的构建及在大肠埃希菌中的表达

目的　构建融合基因IFN α1b/CSPⅡ的原核表达载体并予以表达。　方法　采用聚合酶链反应(PCR)从人基因组DNA中扩增出IFN α1b基因 ,克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1,构建原核表达载体 pGEX 4T 1/IFN α1b。利用PCR法从恶性疟原虫基因组DNA中扩增出环子孢子蛋白Ⅱ区 (CSPⅡ )基因 ,克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1,构建原核表达载体pGEX 4T 1/CSPⅡ 。用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ将IFN α1b从原核重组质粒 pGEX 4T 1/IFN α1b中切下 ,克隆入经相同酶切的原核重组质粒pGEX 4T 1/CSPⅡ 中 ,构建融合基因的原核表达载体 pGEX 4T 1/IFN α1b/CSPⅡ。融合基因IFN α1b/CSPⅡ经异丙基 β D硫代半乳糖苷 (IPTG )诱导 ,在大肠埃希菌中进行初步表达。结果　构建的原核表达载体 pGEX 4T 1/IFN α1b、pGEX 4T 1/CSPⅡ和 pGEX 4T 1/IFN α1b/CSPⅡ经PCR和酶切鉴定与预期结果一致。证实融合基因IFN α1b/CSPⅡ拼接成功并正确地克隆入原核表达载体。在大肠埃希菌中表达出融合蛋白IFN α1b/CSPⅡ ,该融合蛋白经十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析与理论预测值相符。经蛋白质印迹法 (Westernblotting)鉴定具有免疫原性。　结论　构建了融合基因IFN α1b/CSPⅡ的原核表达载体 ,并在大肠埃希菌中表达了。     

汉坦病毒Hunan03株S基因克隆、表达及核蛋白免疫原性分析

目的构建汉坦病毒Hunan03株核蛋白基因原核重组表达载体,在大肠杆菌中进行核蛋白表达,研究核蛋白的免疫性及免疫反应性。方法设计特异性扩增汉坦病毒Hunan03株S基因完整开放阅读框(ORF)的引物,RT-PCR扩增,产物克隆到pGM-T载体,转化感受态细胞TOP10,应用蓝白斑筛选、酶切、PCR鉴定,定向克隆到pGEX-6p-2原核表达载体,转化Ecoli.BL21 Star^TM(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot对重组蛋白进行鉴定。应用Glutathione Sepharose 4B纯化柱纯化重组蛋白,免疫新西兰兔,建立间接ELISA法对核蛋白的免疫原性与免疫反应性进行评价。结果PCR扩增S基因ORF区域产物大小约1 306 bp,重组载体pGEX-6p-2-S经双酶切、PCR、测序鉴定提示构建成功;在37 ℃,IPTG浓度为0.8 mmol/L诱导5 h的条件下,表达出最高量的相对分子量约74 kDa的GST-NP融合蛋白。建立的间接ELISA法检测GST-NP融合蛋白免疫后的新西兰兔血清,IgM抗体滴度达1∶8 000,IgG抗体滴度达1∶16 000。结论成功构建了高效表达的汉坦病毒S基因重组表达载体,获得了纯度较高具有较好的免疫原性与免疫反应性的核蛋白,为后续汉坦病毒单克隆抗体的制备奠定了基础。     

嗜肺军团菌htpA基因的克隆及其原核表达

目的克隆并检测嗜肺军团菌htpA基因在原核系统中表达情况,为进一步研究HtpA蛋白的免疫性能作必要的准备。方法采用聚合酶链反应(PCR)从嗜肺军团菌基因组DNA中扩得军团菌热休克蛋白A基因htpA,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGhtpA,重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后,转化宿主菌大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果扩增出了291bp完整的htpA基因,构建了原核表达重组质粒pGhtpA,并检测到约36kDa的GST-htpA融合蛋白质表达条带。结论成功克隆了嗜肺军团菌htpA基因并使HtpA蛋白在原核表达系统中得到了有效的表达,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

Heymann肾炎RAP全长及氨基端融合蛋白表达载体的构建及表达

目的构建大鼠Heymann肾炎致病源RAP全长和氨基端多肽原核融合表达载体,表达并纯化融合蛋白。方法采用RT—PCR法获得RAP全长的cDNA,将其与pGEM-T克隆载体连接并转化,筛选阳性克隆测序;设计针对RAP全长和氨基端的引物进行PCR扩增,获得相应的DNA。纯化后与PGEX-4T-1载体连接,亚克隆到感受态细菌B121中,经IPTG诱导,表达融合蛋白并纯化,经SDS-PAGE和Western Blot检验。结果酶切分析、PCR及DNA序列测定结果表明成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1-RAP1083/283,并表达出RAP全长70kD和氨基端36kD的融合蛋白。WesternBlot结果显示分别在70、36kD处出现特异性条带,与理论相符。结论RAP,083／258与pGEX-4T-1融合基因表达载体的成功构建及其融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,为后续研究RAP不同区段在Heymann肾炎发病机制中的作用奠定了基础。     

HSP70-GST融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建小鼠热休克蛋白70(HSP70)重组原核表达质粒,获取小鼠HSP70-GST融合蛋白。方法先用RT-PCR方法从小鼠脑基因组中扩增出HSP70基因cDNA序列,应用T-A克隆技术,克隆到质粒pMD—Tvector,经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1 中进行表达。结果表达产物经Western Blot分析,在109 KD处有一明显特异带,与预期结果相符。结论构建重组融合表达载体pGEX—HSP70,用基因工程的方法在原核细胞中成功表达出小鼠 HSP70-GST融合蛋白。     

产单核细胞李斯特菌plcB基因的克隆与原核表达

目的克隆并原核表达产单核细胞李斯特菌plcB基因。方法利用PCR技术从产单核细胞李斯特菌基因组中扩增不含编码信号肽的plcB基因。采用T-A克隆构建pGEM-T-plcB重组质粒,BamHI、XhoI双酶切pGEM-T-plcB获得plcB片段后再插入pGEX-6p-1原核表达载体,获得pGEX-6p-1-plcB重组表达质粒并在表达宿主菌BL21中诱导表达。对表达产物进行纯化和SDS-PAGE、Western-blotting、磷脂酶活性实验分析。结果克隆的plcB基因长834bp,与GenBank上公布的序列完全相同;表达的与GST标签蛋白融合的广谱磷脂酶C蛋白(GST-PC-PLC)具有磷脂酶生物活性和免疫原性。结论成功构建产单核细胞李斯特菌plcB基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中得到有效表达,这为进一步研究PC-PLC蛋白的致病与免疫机理奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白。结果PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到pMD18-T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别。结论成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白。     

华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶基因的扩增、克隆和表达(英文)

华支睾吸虫病严重危害着人们的身体健康 ,研制快速诊断试剂盒对于华支睾吸虫病的防治显得非常重要。目前 ,市场上销售的快速诊断试剂盒 ,其诊断抗原主要来自华支睾吸虫成虫的粗抗原 ,抗原敏感性高 ,特异性却不高 ,所以寻找并生产基因工程重组抗原有着非常重要的意义。半胱氨酸蛋白酶是一类含有半胱氨酸残基的蛋白水解酶 ,多种寄生虫都能产生或分泌半胱氨酸蛋白酶 ,它对寄生虫的生存、发育以及在寄生虫与宿主的相互关系上均有着极其重要的作用。越来越多的科研工作者开始重视它的免疫诊断价值 ,本文研究的目的是为华支睾吸虫快速诊断试剂盒寻找基因工程重组抗原。我们根据已知华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶基因序列设计一对引物 ,用文库构建试剂盒提取总RNA ,并反转录成cDNA ,以cDNA为模板 ,通过PCR技术从cDNA中扩增出目的基因。PCR产物通过测序鉴定 ,用工具酶BamHI和XholI同时消化目的基因和pGEX - 4T - 1原核表达载体 ,消化后的产物用连接酶连接 ,构建成 pGEX - 4T - 1-CP重组体 ,并将其转入Jm10 9大肠杆菌中。用PCR初步筛选阳性克隆 ,共获得阳性克隆 8个 ,再用双酶切和测序进一步鉴定初步筛选的阳性克隆。挑取阳性克隆 ,37℃条件下用IPTG诱导重组体表达 ,表达产物通过SDS -PAGE电泳鉴定。通过上述实验 ,获     

嗜肺军团菌主要外膜蛋白与鞭毛亚单位蛋白双基因融合表达载体的构建及其诱导表达

目的构建嗜肺军团菌主要外膜蛋白S基因(mompS)与鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)的融合表达载体,并在原核系统表达。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR分别扩增获得嗜肺军团菌mompS基因和flaA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建mompS与flaA基因完全融合的重组质粒,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-MOMPS-FlaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了嗜肺军团菌904bp的mompS及1432bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-LpSF,SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET-LpSF在原核系统中得到了表达。结论成功构建了嗜肺军团菌mompS-flaA双基因的原核融合表达载体,并在大肠杆菌中得到了表达,为进一步研究嗜肺军团菌核酸双价疫苗提供研究基础。