RNAi抑制存活素基因表达对前列腺癌细胞侵袭的影响

目的 探讨存活素(survivin)基因对前列腺癌细胞侵袭的影响和可能机制. 方法 采用survivin基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染处理人前列腺癌细胞系PC-3后,分别采用实时-定量RF PCR和Western blot检测survivin基因和基质金属蛋白酶家族-2、-9(matrixmetalloproteinases-2、-9)mRNA和蛋白水平,分别采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力;其次,将转染48 h的细胞接种裸鼠,观察对癌细胞体内侵袭的影响. 结果 软琼脂集落形成试验显示,3.125、6.250 nmol/L和12.500 nmol/L siRNA组集落形成数分别为17.8±1.6、13.6±1.5、8.8±1.4,而对照组为22.65±1.8(P<0.05);Boyden小室模型试验显示,3.125、6.250 nmol/L和12.500/ nmol/L siRNA组穿过滤膜的细胞数分别为33.6±2.1、19.5±1.9、8.1±1.8,而对照组为49.4±2.3(P<0.05).体内试验显示,对照组裸鼠组织癌细胞侵袭横纹肌和血管,而转染组未见这些现象.同时发现,转染组细胞MMP-2、-9基因mRNA和蛋白水平明显下调,呈浓度和时间依赖性(P<0.01). 结论 采用survivin siRNA转染可抑制前列腺癌细胞侵袭转移,其机制可能与下调MMP-2和MMP-9表达有关.     

VEGF基因沉默对肝癌HepG2细胞侵袭和迁移的影响

目的观察VEGF基因沉默对人肝癌细胞株HepG2迁移和侵袭的影响。方法采用siRNA技术沉默HepG2细胞内血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因。体外成功构建针对VEGF的3种siRNA表达载体和1个阴性对照,分别命名为pGenesil-1-VEGF-shRNA-1、2、3和pGenesil-1-VEGF-shRNA-scramble。Lipofectamine 2000介导转染HepG2,用RT-PCR筛选出沉默效果最好的siRNA片断(pGenesil-1-VEGF-shRNA-2),将其重组质粒转染HepG2(观察组),以空质粒细胞(空载组)和空白细胞(空白组)作为对照。采用细胞创伤愈合试验、Transwell小室体外侵袭试验分别检测三组细胞迁移、侵袭能力。结果细胞创伤愈合试验显示,观察组细胞迁移速度为(3.02±0.03)μm/h,显著慢于空载组的(8.67±0.02)μm/h和空白组的(8.78±0.03)μm/h,P均<0.05;细胞侵袭试验显示,观察组穿膜细胞数为(14.0±1.3)个,显著低于空载组的(35.0±2.3)个和空白组的(36.0±2.5)个,P均<0.05。结论 VEGF基因沉默可抑制肝癌细胞株HepG2的迁移和侵袭能力。     

小干扰RNA沉默甲胎蛋白基因对HepG2细胞迁移及侵袭的影响

目的研究甲胎蛋白(AFP)对肝癌HepG2细胞迁移和侵袭能力的影响及其机制。方法应用合成的靶向沉默AFP小干扰RNA(siRNA)转染肝癌HepG2细胞,分为空白对照、阴性对照组及AFP siRNA组,各组细胞干预48 h后,采用实时定量PCR(qRT-PCR)和ELISA法检测细胞转染后的沉默效率,Transwell小室实验检测沉默AFP基因后HepG2细胞的侵袭、迁移能力,用Western blotting法观察沉默AFP基因的表达对上皮-间质转化(EMT)相关蛋白(N-cadherin、Vimentin和E-cadherin)、AKT和p-AKT蛋白表达的影响。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果转染沉默后,与空白对照组相比,AFP siRNA组中AFP mRNA的相对表达量明显降低(P 0.01),抑制率达86.440%,同时AFP siR NA组细胞上清液中AFP蛋白表达水平同样明显降低(P 0.01)。与空白对照组相比,AFP siRNA组的迁移细胞数和侵袭细胞数显著下降,差异具有统计学意义(P值均0.01)。沉默HepG2细胞中AFP基因的表达后,与空白对照组比较,AFP siRNA组EMT相关蛋白E-cadherin蛋白的表达水平升高(P 0.01),而N-cadherin及Vimentin表达水平均明显降低(P值均0.05),且PI3K/AKT信号通路相关蛋白p-AKT的表达水平明显降低(P 0.01)。结论沉默AFP可抑制肝癌细胞转移,基于HepG2细胞株的机制研究可能与阻断PI3K/Akt通路抑制EMT相关。     

RNAi沉默PRL-3基因对大肠癌细胞侵袭的抑制

目的:探讨RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默促肝细胞再生磷酸酶3(proteins in regenerating liver cell-3,PRL-3)基因对大肠癌细胞侵袭的影响.方法:应用PRL-3基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染处理大肠癌细胞系HCT116后,采用荧光实时定量PCR方法检测PRL-3基因mRNA水平,分别采用软琼脂集落培养实验和Boyden小室模型实验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力.其次将转染48 h的细胞接种裸鼠,观察对癌细胞体内侵袭的影响.结果:与两对照组比较,siRNA组PRL-3mRNA水平明显降低,且呈浓度和时间依赖性(P＜0.05).体外实验发现:与对照组比较,PRL-3 siRNA转染组软琼脂集落形成数和穿过滤膜的癌细胞均呈剂量依赖性减少(P＜0.05,P＜0.05).体内实验发现:空白对照组和空载对照组有较多癌细胞侵袭癌肿组织周围的横纹肌,并侵犯血管,而siRNA转染组未见这些现象.结论:PRL-3在大肠癌细胞侵袭中起着重要的作用,采用PRL-3 siRNA转染可抑制大肠癌细胞侵袭.     

Axin2在胰腺癌细胞中的表达及意义

目的探讨Axin2在胰腺癌细胞中的表达情况及其对人胰腺癌细胞(PANC-1)增殖、侵袭及迁移能力的影响。方法采用实时荧光定量核酸扩增检测系统(QPCR)检测不同侵袭能力的胰腺癌细胞株(PANC-1、Mia Pa Ca-2、Bx PC-3)和永生化正常胰腺细胞(H6C7)中Axin2表达情况;过表达Axin2质粒瞬时转染低表达的PANC-1细胞株,采用MTT法、Transwell法及划痕实验分别检测转染过表达Axin2后细胞增殖、侵袭及迁移能力变化。多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用SNK-q检验。结果 Axin2在PANC-1、Bx PC-3、Mia PaCa-2及H6C7细胞中相对表达量分别为0.13±0.01、0.42±0.05、0.24±0.011和1.00±0.00,其中PANC-1细胞中表达水平最低,与其他组比较差异均有统计学意义(P值均0.05);过表达Axin2载体转染PANC-1细胞后,过表达组细胞中Axin2相对表达量与空白、阴性对照组相比,其表达量显著升高,差异均有统计学意义(P值均0.05);与未转染组和空白对照组相比,过表达组的PANC-1细胞增殖、侵袭及迁移能力均明显减弱。结论 Axin2在胰腺癌细胞株较正常胰腺细胞表达下调,在侵袭能力越高的癌细胞株中表达越低,提示起抑癌基因作用;Axin2高表达能减弱PANC-1细胞的增殖、迁移及侵袭能力。     

KiSS-1与肝癌细胞增殖及黏附和侵袭关系的体外实验研究

目的 观察KiSS-1基因表达对肝癌细胞体外增殖、黏附及侵袭能力的影响,为进一步探讨其抗肝细胞癌侵袭转移的机制奠定基础.方法 培养具有高转移潜能的人肝癌细胞株MHCC97-H,瞬时转染KiSS-1基因的细胞为实验组,转染空载体pcDNA3.1/HisC的细胞为空白对照组,未转染细胞为阴性对照组,采用流式细胞术与四甲基偶氮唑盐法、基质黏附实验、Transwell体外侵袭和趋化运动实验检测KiSS-1表达对MHCC97-H细胞体外增殖、黏附、侵袭和运动能力的影响.应用SPSS13.0统计软件包进行统计分析,组间差异以两样本t检验分析. 结果 转染组、空载体组和未转染组与Matrigel基质的黏附能力(A值)分别为0.257±0.029、0.374±0.016和0.394±0.031,转染组明显低于空载体组(t=-7.90345,P＜0.01)和未转染组(t=-7.22752,P＜0.01);与Fibronectin基质的黏附能力(A值)分别为0.292±0.004、0.394±0.010和0.412±0.023,转染组明显低于空载体组(t=-20.93138,P＜0.01)和未转染组(t=-11.31371,P＜0.01);趋化运动至Transwell小室下室表面的细胞数分别为65.80±1.92、93.80±2.28和96.40±2.07,转染组明显低于空载体组(t=-30.11750,P＜ 0.01)和未转染组(t=-24.19142,P＜0.01);侵袭至Transwell小室下室表面的细胞数为42.40±1.14、66.00±1.58和67.80±1.92,转染组明显低于空载体组(t=-27.0711,P＜0.01)和未转染组(t=-25.4,P＜0.01).而转染组、空载体组和未转染组的细胞增殖能力(A值)分别为0.644±0.027、0.669±0.022和0.678±0.027,转染组略低于空载体组(t=-1.60371,P＞0.05)和未转染组(t=-1.97828,P＞0.05);同时,转染组较空载体组和未转染组未出现明显的G1期阻滞和S期阻滞,也未出现明显的凋亡峰.结论 KiSS-1表达虽不影响肝癌细胞的体外增殖能力,但可抑制其黏附、侵袭和运动能力,提示KiSS-1可作为一个候选的肝细胞癌转移抑制基因,可望成为肝癌侵袭转移治疗的新靶点.     

沉默畸胎瘤衍生生长因子-1基因对胰腺癌细胞株PANC1侵袭力的影响

目的 探讨TDGF-1基因沉默对胰腺癌细胞株PANC1侵袭力的影响.方法 设计并合成3个(S1、S2、S3)靶向TDGF-1基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),筛选出沉默效果最好的siRNA.以该siRNA的不同浓度(3.125、6.25、12.5 nmol/L)转染PANC1细胞,并设对照组和脂质体组.采用实时定量PCR和Western blotting检测TDGF-1 mRNA和蛋白表达,以软琼脂集落培养试验和Boyden小室检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力,并将转染48 h的细胞接种裸鼠,观察癌细胞的体内侵袭.结果 siRNA转染组细胞的TDGF-1 mRNA和蛋白表达水平呈浓度和时间依赖性下降,且较脂质体组明显降低(P值均＜0.01).对照组细胞集落形成数和穿膜细胞数分别为19.8±2.2和49.8±2.6;siRNA组呈浓度依赖性明显减少,12.5 nmol/L转染组分别为5.6±1.2和8.1±1.1.对照组、脂质体组和12.5 nmol/L转染组接种4周后裸鼠种植瘤体积分别为(2.228±0.026)cm3、(2.186±0.028)cm3和(0.728±0.023)cm3.对照组和脂质体组种植瘤侵犯周围肌层组织,转染细胞组未见侵犯.结论 采用RNA干扰技术沉默PANC 1细胞的TDGF-1基因表达可抑制癌细胞的侵袭力.     

siRNA抑制PTTG表达对人结肠癌LoVo细胞生物学活性的影响

目的 探讨PTTG干扰质粒对人结肠癌LoVo细胞黏附、侵袭及迁移能力的影响.方法 分别采用MTT和Transwell小室研究转染PTTG-siRNA对结肠癌细胞LoVo黏附、侵袭及迁移的作用.结果 特异性siRNA干扰PTTG表达后,LoVo细胞黏附百分率显著低于正常对照组(P＜0.01),穿透Transwell小室的细胞百分率显著低于正常对照组,细胞迁移百分率低于正常对照组.结论 特异性siRNA干扰PPTTG表达后,LoVo细胞黏附、侵袭及迁移能力受到抑制.     

RNA干扰阻断CXCR4基因对胰腺癌AsPC-1细胞侵袭转移的影响

目的:观察针对CXCR4基因慢病毒Lentiviral(LV)介导的RNAi转染胰腺癌细胞株As PC-1后细胞增殖、迁移、侵袭的影响,探讨可能机制.方法:人CXCR4基因干扰靶点设计后成功转染人胰腺癌细胞系As PC-1细胞,然后分为转染组(LV-si CXCR4-1)、阴性对照组(As PC-1-LV-con)和空白对照组(AsP C-1细胞),实验组加入基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α),MTT法检测细胞增殖,迁移实验检测细胞迁移,Transwell检测细胞的体外侵袭,Western blot检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质蛋白金属酶(matrix metalloproteinases,MMP)2和MMP9的表达.结果:在SFM或10%NCS培养条件下,SDF-1α均可刺激As PC-1细胞、As PC-1-LV-Con细胞增殖(P0.01),对LV-si CXCR4-1增殖均无明显促进作用;SDF-1α可促进As PC-1、As PC-1-LV-C o n细胞迁移和侵袭(P0.01),对LVsi CXCR4-1无明显促进作用;在SDF-1α作用下,LV-si CXCR4-1细胞的MMP9及VEGF的蛋白表达低于As PC-1、As PC-1-LV-Con细胞(P0.01).结论:CXCR4基因RNAi可显著抑制SDF-1α引起的As PC-1细胞的增殖、体外迁移和侵袭,进一步证实SDF-1/CXCR4受体配体系统参与了胰腺癌的增殖、侵袭及转移,通过RNAi技术可抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭及转移.     

HO-1活性改变对肝癌细胞周期调控因子CKS1和Cyclin D的影响

目的探讨血红素加氧酶(HO)-1活性改变对肝癌细胞株Hep G2细胞周期蛋白(Cyclin)依赖性激酶调节亚基(CKS)1和Cyclin D的影响。方法采用靶向抑制HO-1的小分子RNA(siRNA)沉默细胞癌Hep G2细胞HO-1基因的表达,应用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)测定Hep G2细胞的增殖情况,应用RT-PCR法测定HO-1、CKS1和Cyclin D mRNA,应用Western印迹检测HO-1、CKS1和Cyclin D蛋白表达水平。结果 MTT实验结果显示,HO-1 siRNA转染组细胞转染后24 h和48 h的吸光度较空白对照组显著降低(P0.01),HO-1 siRNA转染组细胞转染后48 h的HO-1、CKS1和Cyclin D mRNA水平较空白对照组显著降低(P0.01),HO-1 siRNA转染组细胞转染后48 h的HO-1、CKS1和Cyclin D蛋白水平较空白对照组显著降低(P0.01)。结论 HO-1的活性降低可抑制肝癌Hep G2细胞的增殖,其调控作用可能通过降低Hep G2细胞CKS1和Cyclin D表达而实现。     

RNAi‐mediated silencing of ezrin gene reverses malignant behavior of human gastric cancer cell line SGC‐7901

OBJECTIVE: To investigate the effects of ezrin targeting gene of RNA interference (RNAi) on human gastric cancer cell line SGC‐7901 in vitro. METHODS: The highly metastatic human gastric cancer cell line SGC‐7901 transfected with a small interfering (siRNA) lentivirus vector was selected for this research study. Expressions of ezrin mRNA and ezrin protein in the SGC‐7901 cells were detected using RT‐PCR and Western blot. Cell apoptosis was observed using flow cytometry. Transwell invasion and the cell adhesion test were used to verify the effect of RNAi on ezrin expression in the human gastric cancer cell line SGC‐7901 in vitro. RESULTS: Ezrin gene targeting via a RNAi‐mediated lentivirus vector had obvious inhibitory effects on ezrin expression in the human gastric cancer cell line SGC‐7901. The results of the RT‐PCR show the obvious inhibition of ezrin mRNA expression in Eai and Ebi groups (0.22 ± 0.01 vs 0.95 ± 0.04, P < 0.05; 0.31 ± 0.01 vs. 0.95 ± 0.04, P < 0.05). Western blot analysis revealed a 72.35 ± 3.74% reduction of the ezrin protein level after interference with the ezrin targeting gene. Moreover, the inhibition of ezrin expression clearly inhibited SGC‐7901 cell migration and invasion, and improved cell adhesion as well as increased sensitivity to camptothecin‐induced apoptosis. CONCLUSION: Ezrin gene targeting by RNAi can inhibit the metastatic growth and migration of SGC‐7901 human gastric cancer cells.     

Establishment of CXCR4-small interfering RNA retrovirus vector driven by human prostate-specific antigen promoter and its biological effects on prostate cancer in vitro and in vivo

Purpose  CXC chemokine receptor-4 (CXCR4) is closely involved in bone metastasis of prostate cancer, and CXCR4 levels are frequently increased in prostate cancer cells and tissues. In the present study, its biological effects on prostate cancer in vitro and in vivo and feasibility to be a therapy target were investigated using a RNA interfering retrovirus vector targeting CXCR4 gene driven by human prostate-specific antigen promoter (pPSA). Methods  We established a pPSA-siCXCR4 retrovirus vector and transfected prostate cancer cell PC-3m, LNCaP and breast cancer cell MCF-7, respectively. The expression of CXCR4 mRNA and protein was detected by RT-PCR and western blot, and the ability of adhesion, migration, invasion of prostate cancer cells was assessed using Transwell chamber. A metastasizing model using BALB/cA mice with human bone tissue implantation was established too, and transfected prostate cancer cells were via caudal vein. Survival time of mice suffering bone metastatic tumor as well as the weight and volume of these tumors were recorded and analyzed. Results  The expression of CXCR4 mRNA and protein in androgen-responsive LNCaP cells was blocked by the pPSA-siCXCR4 vector, but it could not work in non androgen-responsive PC-3m cell and breast cancer cell MCF-7. The results of experiments in vitro also showed that the adhesion, transendothelial migration and invasive ability of transfected LNCaP cells were impaired, while there was no change in PC-3m and MCF-7 cells after transfection. pPSA-siCXCR4 represented a similar inhibitory effect in fluorescent bone metastasis model of LNCaP cells compared with PC-3m cells. Conclusion  These results suggest that the downstream siRNA controlled by PSA promoter in retrovirus system can express selectively in androgen-responsive prostate cancer in vitro and in vivo, and CXCR4 plays an important role in prostate cancer metastasis. We believe that the pPSA-siCXCR4 retrovirus vector is a potential choice in gene therapy for androgen-responsive prostate cancer. An erratum to this article can be found at     

cripto-1基因siRNA对乳腺癌细胞侵袭力的影响

目的观察cripto-1基因小于扰RNA（siRNA）对乳腺癌细胞侵袭力的影响。方法将人乳腺癌MDA—MIM68细胞分为4组,A组不处理,B组转染空载脂质体,C组转染错配siRNA,D组转染分别转染含3．125、6．25、12．5nmol／Lcfipto-1基因siRNA的脂质体。分别于处理24．48、72h收集各组细胞。采用实时定量RT—PCR法和Western blot法检测MDA—MB468的cripto-1 mRNA和蛋白,采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室检测MDA—MB468的锚着不依赖性增殖和侵袭能力。结果与A、B、C组比较,D组MDA—MB468的cripto-1 mRNA、cripto-1蛋白、集落形成数量、穿膜细胞数均呈浓度依赖性减少（P均〈0．005）。结论cripto-1基因siRNA可抑制乳腺癌细胞侵袭。     

siRNA沉默NHE1基因对MHCC97-H肝癌细胞侵袭迁移的影响

目的:探讨RNA干扰沉默NHE1基因后对人肝癌细胞株MHCC97-H细胞侵袭迁移的影响,方法:应用NHE1基因小干扰RNA(smallinterfering RNA,siRNA)转染人肝癌细胞株MHCC97-H细胞,同时设立空白对照组和无关对照组.转染成功后采用RT-PCR和Western blot分别从基因和蛋白水平...     

槲皮素对大肠癌细胞SW-480增殖、侵袭力及其表面抗原-2表达的影响

目的 观察槲皮素（Que）对大肠癌细胞增殖、侵袭力的影响,并探讨其可能机制。方法加入不同浓度的Que培养大肠癌细胞SW-480后,用软琼脂克隆培养试验检测SW-480的增殖能力,用Boyden小室模型法检测SW-480侵袭力,用荧光实时定量RT—PCR检测SW-480的滋养层细胞表面抗原2（TROP-2）mRNA,以Westernblot法检测SW-480的TROP-2蛋白。结果SW-480加入Que培养后,恶性增殖和穿膜细胞数均明显下降,且呈剂量依赖性（P均〈0．01）;同时其TROP-2mRNA和蛋白表达水平均明显下调,且呈时间和剂量依赖性（P均〈0．01）。结论Que可明显抑制大肠癌SW-480细胞的增殖、侵袭力,其机制可能与下调TROP-2基因表达有关。     

survivin基因表达对肺鳞状细胞癌细胞侵袭的影响

目的探讨survivin基因对肺鳞状细胞癌细胞侵袭能力的影响及作用机制。方法应用survivin基因小干扰RNA（siRNA）转染处理人肺鳞状细胞癌细胞后,用荧光实时定量PCR和Western blot检测survivin mRNA和survivin蛋白表达,用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力,用琼脂糖凝胶电泳和细胞凋亡原位检测试剂盒检测癌细胞失巢凋亡情况。结果转染组癌细胞survivin mRNA和survivin蛋白表达明显受抑制,且与时间和浓度相关。与对照组比较,转染组细胞形成的软琼脂集落数和穿膜细胞数明显减少,细胞出现明显凋亡现象,并出现明显DNA条带。结论survivin基因siRNA转染可明显抑制肺鳞状细胞癌细胞的锚着不依赖性增殖和恶性侵袭,其机制可能与诱导失巢凋亡有关。     

RNAi抑制人大肠癌LOVO细胞Bmi-1基因的表达

目的探讨RNA干扰（RNAi）技术沉默Bmi-1基因表达对人大肠癌细胞株LOVO增殖和侵袭力的影响及机制。方法将化学法合成的针对Bmi-1mRNA不同位点设计的3对siRNA序列（siR-NA1～3）和1对带有荧光标记的FAM-siRNA（siRNA4）转染至人大肠癌LOVO细胞,荧光显微镜下观察siRNA的转染效率,QRT-PCR检测Bmi-1mRNA表达抑制作用,Western Blot检测Bmi-1蛋白表达变化,MTT法检测LOVO细胞体外增殖变化,小室侵袭实验检测LOVO细胞侵袭能力。结果利用荧光标记的Oligo观察到siRNA转染效率达70%。siRNA1对mRNA表达抑制率最高,从而筛选出沉默效应最强的siRNA序列为siRNA1。siRNA1转染组LOVO细胞Bmi-1蛋白表达,增殖及侵袭力明显低于阴性对照组和空白对照组（P〈0.05）。结论化学合成的靶向Bmi-1siRNA转染人大肠癌LOVO细胞能有效抑制Bmi-1的mRNA和蛋白质表达水平,Bmi-1基因的RNA干扰可有效抑制人大肠癌LOVO细胞的增殖和侵袭能力。