Smad4 siRNA对乳腺癌细胞侵袭力和MMP-9表达的影响

目的:探讨Smad4特异性小分子干扰RNA(siRNA)对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭力及MMP-9表达的影响。方法:构建Smad4 siRNA,将细胞分为空白对照组,Smad4 siRNA转染组,TGF-β处理组,Smad4 siRNA转染+TGF-β处理组。首先用Western blot法检测转染Smad4 siRNA后细胞中Smad4蛋白的表达,以及用荧光素酶报告基因法检测TGF-β处理后细胞Smad结合元件(4xSBE)的活性;然后用Transwell小室模型和Western blot法检测各组细胞的黏附侵袭能力以及基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表达水平。结果:转染Smad4 siRNA后,乳腺癌细胞的Smad4蛋白表达及其TGF-β诱导的4xSBE活性增强均被明显抑制(均P<0.05);与对照组细胞比较,细胞经TGF-β刺激后的侵袭能力及MMP-9的表达量均明显增加(均P<0.05),但预先转染Smad4 siRNA的细胞的上述TGF-β刺激作用被明显抑制(均P<0.05),单纯Smad4 siRNA转染对细胞的侵袭能力及MMP-9的表达量无明显影响。结论:Smad4 siRNA能减弱TGF-β诱导的MDA-MB-231细胞的侵袭能力,该作用可能与其抑制MMP-9的表达有关。     

Smad4小分子干扰RNA对转化生长因子-β诱导的纤溶酶原激活物抑制剂-1表达的影响

目的 探讨Smad4小分子干扰RNA(siRNA)对转化生长因子(TGF)-β诱导纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1的表达的影响及作用机制.方法 将Smad4 siRNA转染入肝星状细胞24h后行TGF-β(1μg/L)刺激,24、48 h后收集细胞.利用萤光素酶报告基因法测定Smad结合转写因子的活性;Northern印迹分析技术检测PAI-1 mRNA表达的变化;Western印迹分析观察Smad4蛋白、PAI-1蛋白的变化.结果 Smad4 siRNA能抑制Smad4蛋白(3.0±0.1比16.0±0.5)表达;Smad4 siRNA抑制TGF-β1和ALK5激活的4×SBE荧光素酶报告基因活性;TGF-β时间依赖性促进PAI-1 mRNA表达,24 h达高峰;Smad4 siRNA从mRNA(1.3±0.1比6.5±0.2)和蛋白(1.50±0.15比5.52±0.36)水平抑制TGF-β激活的PAL-1的表达.结论 Smad4 siRNA能够有效地阻断TGF-β诱导的PAI-1表达.     

大鼠肝星状细胞TGF-β3/TGF-β1mRNA比值与TGF-β1、MMP-9、TIMP-1表达的关系

目的 探讨大鼠肝星状细胞(HSC-T6)中转化生长因子-β3(TGF-β3)和转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA比值变化与TGF-β1、MMP-9、TIMP-1表达的关系.方法 构建质粒pcDNA 3.1(+)-TGF-β3和pcDNA 3.1(+)-TGF-β1.将pcDNA 3.1(+)-TGF-1β1转染HSC-T6细胞株,经筛选建立高表达TGF-β1的HSC-T6细胞阳性克隆.pcDNA 3.1(+)-TGF-β3转染该阳性克隆,48 h后荧光定量PCR法和Western blot法分别检测TGF-β3、TGF-β1、MMP-9和TIMP-1 mRNA和蛋白的变化.结果 空白组、对照组、阳性克隆组及TGF-β3干预组中,TGF-β3/TGF-β1mRNA比值分别为0.286±0.070、0.874±0.141、0.448±0.327和1.277±0.244;阳性克隆组与空白组和对照组相比,TGF-β1和TIMP-1的mRNA及蛋白表达明显增高(P<0.05),MMP-9的mRNA及蛋白表达明显减少(P<0.05);TGF-β3干预组与阳性克隆组相比,TGF-β1蛋白和TIMP-1 mRNA及蛋白表达明显下降(P<0.05),MMP-9 mRNA及蛋白表达明显增加(P<0.05).结论 TGF-β3能下调TGF-β1蛋白表达;当TGF-β3/TGF-β1mRNA比值>1时,TGF-β1和TIMP-1表达减少,MMP-9表达增加;当TGF-β3/TGF-β1mRNA比值<1时,TGF-β1表达减少,TIMP-1和MMP-9表达无变化.     

γ干扰素对瘢痕疙瘩成纤维细胞转化生长因子β/Smad信号通路的作用

目的 了解γ干扰素(IFN-γ)对瘢痕疙瘩Fh(KFb)中TGF-β/Smad信号通路的作用,探讨IFN一γ治疗病理性搬痕的可能机制. 方法 切取3例患者的瘢痕组织,体外分离培养KFb,实验选用第3～5代细胞.(1)将KFb分为:对照组,加无血清DMEM培养;TGF-β_1组,用10 ng/mL的TGF-β_1单独作用;IFN-γ组,用100 ng/mL的IFN-γ单独作用;TGF-β_1+IFN-γ组,10 ng/mL的TGF-β_1与100 nS/mL的IFN-γ联合作用.采用实时荧光定量RT-PCR、蛋白质印迹法和免疫荧光细胞化学染色法,分别检测结缔组织生长因子(CTGF)的mRNA、蛋白表达,以及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达与阳性细胞表达情况.(2)另取KFb,用10 ng/mL的IFN-γ作用,于作用前及作用后30 min和1、2、4、6、8 h通过实时荧光定量RT-PCR检测Smad 3和Smad 7的mRNA表达,于作用前及作用后1、2、4、6、8 h用蛋白质印迹法检测Smad 3和Smad 7的蛋白表达.(3)另取KFb,根据添加的IFN-γ终浓度不同分为1、10、100 ns/mL IFN-γ组,均作用4 h;设立未添加IFN-γ的KFb为对照组.同前检测各组Smad 3和Smad 7的mRNA及蛋白表达. 结果 (1)IFN-γ组KFb CTGF的mRNA和蛋白表达量为0.017±0.009与1.198±0.004,较对照组(0.024±0.013与1.229±0.011)显著减少(P<0.05);TGF-β1+IFN-γ组CTGF的mRNA和蛋白表达量为0.634±0.138与1.204±0.010,较TGF-β_1组(1.331±0.298与1.727±0.004)显著减少(P<0.01).IFN-γ组KFb中,α-SMA阳性细胞荧光强度(0.922±0.059)和α-SMA蛋白表达量(0.3051±0.0031)较对照组(1.055±0.005与0.4513±0.0094)显著减少(P<0.01);TGF-β1+IFN-γ组SMA阳性KFb荧光强度(1.129±0.004)和SMA蛋白表达量(0.6734±0.0098)较TGF-β_1组(1.270±0.005与1.38420.0024)显著减少(P<0.01).(2)10 ng/mL IFN-γ作用后第1个时相点,Smad 3的mRNA和蛋白表达量均出现一过性增高,随后降低,mRNA表达量于作用后4 h降至最低点,随后缓慢上升,至作用后8 h仍低于作用前(P<0.01);其蛋白表达量于作用后2~8 h显著低于作用前(P<0.01).而Smad 7的mRNA和蛋白表达量在INF-γ作用后逐渐增高,分别于作用后2、4 h达峰值随后降低,至作用后8 h仍高于作用前(P<0.05).(3)与对照组比较,1、10、100 ng/mL IFN-γ组Smad 3的mRNA及蛋白表达量显著减少(P<0.05或P<0.01),Smad 7的mRNA及蛋白表达量显著增加(P<0.05或P<0.01),且随IFN-γ浓度升高,减少或增高幅度愈为显著. 结论 IFN-γ呈时间和剂量依赖方式下调Smad 3、上调Smad 7,降低基础状态下或经TGF-β_1诱导后KFb的CTGF和α-SMA表达量,表现出对TGF-β/Smad 信号通路的显著拮抗作用,这可能是IFN-γ治疗病理性瘢痕的重要机制.     

转化生长因子-β1对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3、7mRNA表达的影响

研究转化生长因子-β1(TGF-β1)对瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)Smad3、7mRNA表达的影响。方法：用RT-PCR法分别检测TGF-β1不同浓度(0，5，50，500pmol／1：Smad3 mRNA 24h，smad7 mRNA 90min)和TGF-β1(500pmol／1)作用不同时间(Smad3 mRNA：1，2，4，24，48h；Smad7 mRNA：0．5，1，1，5，2，4，24h)对Smad3、7mRNA表达的影响。结果：Smad3 mRNA水平随TGF-β1浓度的增加而呈浓度依赖性下降；5pmol／lTGF-β1就能使Smad7 mRNA水平明显地升高，并随TGF-β1浓度加大而略有改变；随作用时间延长，Smad3mRNA水平逐渐下降，在作用48h后下降到最低，呈时间依赖性。而Smad7 mRNA水平在细胞受到TGF-β1刺激后l20min即达到最高值。结论：TGF-β1能使KFB细胞Smad3 mRNA发生配体依赖性的下调，而使Smad7 mRNA表达迅速增加。     

肾衰饮对肾纤维化大鼠TGF-β_1/Smad信号通路的作用研究

目的:探讨肾衰饮抗肾纤维化分子生物学机制。方法:采用腺嘌呤肾病模型,随机将60只SD大鼠分为空白组、模型组、肾衰饮组与尿毒清组,采用RT-PCR观察肾衰饮对CRF大鼠TGF-β1mRNA表达的影响;ELISA法检测Smad2、Smad3、Smad7蛋白表达;免疫组化法检测α-SMA蛋白表达。结果:模型组与正常组比较TGF-β1mRNA表达增强,Smad2、Smad3水平升高,Smad7下降,治疗后肾衰饮组TGF-β1mRNA表达明显减少,Smad2、Smad3水平下降,Smad7升高,同时肾组织α-SMA表达下降,明显优于尿毒清(P0.05)。结论:肾衰饮抑制TGF-β1mRNA表达,提高Smad7水平,通过调节TGF-β1/Smad信号通路,以抑制肾纤维化的发生、发展。     

转化生长因子对两种人骨肉瘤细胞株侵袭和迁移的影响

目的观察外源性转化生长因子beta(TGF-β)对人骨肉瘤细胞HOS、MG-63细胞侵袭和迁移能力的影响,并初步探讨其作用机制。方法 SD208是TGF-β受体抑制剂,可以特异性抑制TGF-β信号通路。本实验所需细胞由广州医科大学实验医学研究中心赠与。用TGF-β与SD208分别和共同处理人骨肉瘤细胞HOS、MG-63,采用划痕实验检测TGF-β对细胞迁移的影响,侵袭实验(Transwell)检测TGF-β对细胞侵袭的影响,实时荧光定量聚合酶链锁反应(qRT-PCR)检测TGF-β与SD208处理细胞后PTHr P(甲状旁腺激素相关蛋白)、解离素19(ADAM19)、白细胞介素-11(IL-11)、血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)基因的变化,蛋白免疫印迹检测TGF-β与SD208对细胞PTHr P和MMP-2蛋白的作用。TGF-β和SD208处理细胞后各基因、蛋白及侵袭和迁移能力的变化,通过Graphpad Prism 5统计学软件进行统计分析,采用单因素方差分析经行分析,两两比较采用Bonferroni法进行比较。结果 TGF-β刺激骨肉瘤细胞后,细胞侵袭及迁移能力增强,HOS对照组、TGF-β组、SD208组和TGF-β+SD208组24 h侵袭细胞数分别为(73.4±5.2)个、(161.8±8.1)个、(55.3±4.5)个、(68.2±6.1)个,差异有统计学意义(F=6.9,P0.05);MG63细胞为(19.9±1.5)个、(32.3±2.2)个、(15.7±1.5)个、(17.6±2.5)个,差异有统计学意义(F=7.3,P0.05)。TGF-β能够明显上调细胞PTHr P、ADAM19、IL-11、VEGF和MMP-2 mRNA的表达,同时PTHr P与MMP-2的蛋白表达明显升高。HOS对照组、TGF-β组、SD208组和TGF-β+SD208组PTHr P蛋白表达量分别为(0.2±0.02)、(0.5±0.07)、(0.2±0.02)、(0.2±0.14)差异有统计学意义(F=4.6,P0.05)。MMP-2蛋白表达量分别为(0.4±0.03)、(0.8±0.02)、(0.2±0.02)、(0.3±0.02)差异有统计学意义(F=5.1,P0.05)。结论外源性TGF-β能够增强人骨肉瘤细胞HOS、MG-63细胞的侵袭和迁移能力,其机制可能与升高细胞内PTHr P、ADAM19、IL-11、VEGF和MMP-2有关。     

氧化苦参碱抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成作用机制的初步研究

目的 研究氧化苦参碱抑制体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的作用机制.方法 将不同浓度的氧化苦参碱作用于人瘢痕疙瘩成纤维细胞,分别培养24、48、72h后,采用Western blot检测TGF-β/Smad信号转导通路中信号分子TGF-β1,TβRⅠ,TβRⅡ,Smad3,Smad4和Smad7的表达,对阳性信号分子采用RT-PCR进一步检测其mRNA的表达.结果 Western blot结果显示,不同浓度的氧化苦参碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞中TGF-β1,TβRⅠ,TβRⅡ,Smad4和Smad7蛋白的表达无明显的影响,但是对Smad3蛋白表达具有明显抑制作用;RT-PCR结果显示,Smad3 mRNA的表达也受到明显抑制.结论 氧化苦参碱可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成,作用机制可能是通过抑制TGF-β/Smad信号通路中Smad3的表达.     

乙型肝炎病毒X蛋白对卵圆细胞中Smad2、Smad3、Smad4基因表达的调控作用

目的 观察乙型肝炎病毒编码X蛋白(HBX)对肝脏卵圆细胞中转化生长因子-β(TGF-β)/Smad中核心元件Smad2、Smad3、Smad4表达的调控作用。方法 稳定转染HBX基因的大鼠卵圆细胞株HBX-EGFP-LE/6作为实验组,转染绿色荧光蛋白标记空载体的大鼠卵圆细胞株EGFP-LE/6,大鼠卵圆细胞株LE/6作为对照组。Real-time聚合酶链反应(PCR)与Western blot分别检测3种细胞株中Smad2、Smad3、Smad4的mRNA和蛋白表达。结果 对照组Smad3的mRNA表达量分别是实验组的(4.56±0.79)倍和(4.14±0.38)倍,差异有统计学意义(P＜0.01)。对照组Smad4的mRNA表达量分别是实验组的(1.41±0.04)倍和(1.63±0.43)倍,差异有统计学意义(P＜0.01)。实验组Smad3蛋白表达水平有一定程度降低。结论 HBX可以在卵圆细胞中影响TGF-β/Smad信号通路中的核心元件Smad3的转录及蛋白合成,对Smad4的转录有一定影响。     

瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3、7mRNA表达的调控机制

目的研究转化生长因子-β1影响瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)Smad3、7mRNA表达的调控机制。方法用放线菌酮(CHX)和放线菌素D预处理KFB,以分别阻断KFB内源性蛋白质的合成及mRNA合成。采用逆转录PCR法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3、7mRNA表达水平。结果经CHX预处理后,KFB的Smad3mRNA表达轻度上调,并完全抑制了TGF-β1对KFBSmad3mRNA的下调作用(P<0.01);而CHX预处理对KFB的Smad7mRNA表达及TGF-β1上调Smad7mRNA的作用并无明显影响。经放线菌素D预处理后,随TGF-β1作用时间延长,KFB的Smad3mRNA表达水平无明显下降。结论TGF-β1对KFBSmad3mRNA表达的调控过程可能还需要细胞合成其他蛋白的参与;但对Smad7mRNA表达的调控则不需要细胞合成其他蛋白参与,KFB细胞中的Smad7可能也是活化的SMADs的直接靶基因。     

脂多糖协同转化生长因子-β1对乳腺癌MCF-7细胞上皮-间充质转化及迁移侵袭能力的影响

目的 观察脂多糖(LPS)协同转化生长因子-β1 (TGF-β1)作用于乳腺癌MCF-7细胞的生物学效应,并探讨其分子生物学机制.方法 倒置显微镜下观察细胞形态;罗丹明-鬼笔环肽标记细胞骨架;实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、转录因子Snail、Twist以及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的基因表达水平;Transwell小室检测迁移、侵袭能力;明胶酶谱检测活性蛋白MMP-9的表达水平;Western blot检测核因子(NF)-κB、细胞外信号调节激酶(ERK)和Smad信号通路.结果 LPS和TGF-β1联合组(联合刺激组)的细胞呈纺锤状,细胞骨架明显改变.联合刺激组E-cadherin显著下调,Vimentin、Snail-2、Twist、MMP-9 mRNA表达水平显著上调;对照组、LPS组、TGF-β1组、联合刺激组每个视野迁移细胞数分别为(6.8±4.1)、(10.2±4.3)、(39.5士3.8)、(69.7±4.4)个,每个视野侵袭细胞数分别为(4.4±1.1)、(6.8±2.4)、(32.1±2.3)、(54.9±4.5)个.联合刺激组活性MMP-9表达水平最高;联合刺激组磷酸化ERK和磷酸化Smad-2的水平要高于TGF-β1组.结论 LPS能够增强TCF-β1诱导乳腺癌MCF-7细胞发生上皮-间充质转化,并且两者联合作用能够促进MCF-7细胞发生侵袭迁移.     

肿瘤相关钙信号传导蛋白-2基因对人乳腺癌细胞黏附和侵袭力的影响

目的 观察肿瘤相关钙信号传导蛋白-2(TROP-2)基因小干扰RNA (siRNA)对乳腺癌细胞黏附和侵袭力的影响.方法 培养人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株,以荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)方法检测TROP-2基因mRNA表达;筛选出TROP-2表达最高者.采用TROP4基因siRNA转染乳腺癌细胞,分别以荧光实时定量RT-PCR和免疫荧光方法观察TROP-2基因mRNA和蛋白水平,然后以噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞黏附性,以Transwell方法检测癌细胞侵袭能力.结果 人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-35、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株TROP-2 mRNA分别是1.362±0.057、2.207±0.056、2.997±0.052、0.136±0.045、0.122±0.025、0.194±0.028和2.706±0.039,以MCF-7细胞最高;以TROP-2 siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞后,癌细胞TROP-2基因mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性;黏附实验结果显示,5、10、20 nmol/L siRNA组黏附率分别为(52.9±2.5)％、(25.6±2.3)％、(12.8±2.2)％(P＜0.01);Transwell实验结果显示,5、10和20 mol/L siRNA组穿过滤膜的细胞分别为78±17、39±15、19±16,而对照组分别为136±25、139±21(P＜0.01).结论 TROP-2基因在乳腺癌细胞黏附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染乳腺癌细胞,可抑制乳腺癌细胞黏附和侵袭能力.     

转化生长因子-β1对人软骨细胞基质金属蛋白酶-1mRNA及其阻滞剂mRNA表达的影响

目的观察转化生长因子-β1(TGF-β1)对人透明软骨细胞基质金属蛋白酶-1(MMP-1)及其阻滞剂T(IMP-1)mRNA表达的作用及相关意义,更好地理解骨关节炎软骨损伤的相关机制。方法TGF-β1作用于传代培养的人软骨细胞12h,浓度分别为1ng/mL、10ngm/L、100ng/mL;上述不同浓度TGF-β1与白介素-1β(IL-1β)10ng/mL组成联合作用组,继续培养12h。应用逆转录PCRR(TP-CR)方法及实时荧光定量方法(FQP-CR),检测TGF-β1及其与IL-1β联合作用于传代培养的人透明软骨细胞MMP-1、TIMP-1mRNA表达的含量。结果正常对照组透明软骨细胞可见MMP-1、TIMP-1mRNA扩增产物,而实验组TGF-β11ng/mL、10ng/mL、100ngm/L作用于透明软骨细胞12h后,MMP-1mRNA表达逐渐降低,TIMP-1mRNA表达逐渐增高;TGF-β1与IL-1β联合作用后,随着TGF-β1浓度的升高,MMP-1mRNA表达逐渐降低,TIMP-1mRNA表达逐渐增高,各组之间差异有显著性意义(P<0.05)。提示TGF-β1与MMP-1、TIMP-1mRNA表达之间存在剂量依赖关系。结论不同浓度TGF-β1按照剂量依赖方式抑制人软骨细胞MMP-1mRNA基因的表达,刺激人软骨细胞TIMP-1mRNA基因表达;TGF-β1具有对抗IL-1β对人软骨细胞MMP-1、TIMP-1mRNA表达的作用,也呈现剂量依赖关系。研究结果对揭示骨关节炎的发病机理,指导其治疗具有积极意义。     

苦参碱调控Snail2表达水平抑制转化生长因子β1诱导的人腹膜间皮细胞上皮间充质转分化

目的 研究苦参碱对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导腹膜间皮细胞上皮间充质转分化(EMT)后转录因子Snail2的影响.方法 采用TGF-β1刺激人腹膜间皮细胞并同时予不同浓度苦参碱干预处理,实验分为空白对照组、TGF-β1(5 ng/ml)诱导组、TGF-β1+0.4 mg/ml苦参碱干预组、TGF-β1+0.6 mg/ml苦参碱干预组、TGF-β1+0.8 mg/ml苦参碱干预组和TGF-β1+1.0 mg/ml苦参碱干预组.实时荧光定量PCR和Western印迹检测Snail2、上皮标志分子E钙黏蛋白(E-cadherin)和间质标志分子α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)、胶原Ⅲ(ColⅢ)的表达,Western印迹检测Smad2、Smad3和细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的蛋白磷酸化水平.结果 TGF-β1(5 ng/ml)刺激能上调人腹膜间皮细胞Snail2、α-SMA、FN和ColⅢmRNA和蛋白的表达水平,上调Smad2、Smad3和ERK1/2的蛋白磷酸化水平,下调E-cadherinmRNA和蛋白的表达水平;苦参碱(0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ml)干预处理后能下调Snail2和α-SMA、FN和ColⅢmRNA和蛋白的表达水平以及ERK1/2的蛋白磷酸化水平,上调E-cadherin mRNA和蛋白的表达水平.结论 TGF-β1能诱导人腹膜间皮细胞EMT,苦参碱可能通过ERK1/2信号通路下调Snail2的表达水平来抑制TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞EMT.     

3′-脱氧腺苷对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡和p53表达的影响

目的 观察3′-脱氧腺苷对MDA-MB-231细胞生长、细胞周期、凋亡和p53表达的影响.方法 噻唑蓝(MTT)比色法观察3′-脱氧腺苷对体外培养MDA-MB-231细胞的生长抑制作用;流式细胞仪检测3′-脱氧腺苷作用于MDA-MB-231细胞48 h后细胞凋亡率和细胞周期变化;免疫组织化学方法检测MDA-MB-231细胞p53蛋白表达的变化.结果 MDA-MB-231细胞经3′-脱氧腺苷作用后,生长明显抑制,呈剂量和时间依赖性,以80 mg/L时作用最强;不同浓度(2、20、40、80、160mg/L)的3′-脱氧腺苷作用48h后,细胞凋亡率明显升高,其中在40 mg/L( 11.23±0.98)组、80 mg/L (15.21 ±2.0l)和160 mg/L( 13.27±2.26)与对照组(3.25±0.12)比较差异有统计学意义(P＜0.05).G0/G1期细胞比例逐渐升高,同时S期、G2/M期细胞比例相应减少(P＜0.05);免疫组织化学染色结果表明,随着3′-脱氧腺苷浓度的增加,MDA-MB-231细胞p53蛋白表达水平逐渐降低.结论 3′-脱氧腺苷对MDA-MB-231细胞具有明显的生长抑制和促凋亡作用,这种作用可能是通过下调p53蛋白表达以及阻滞细胞周期而实现.     

右归丸对骨性关节炎模型大鼠TGF-β1/Smads信号通路的影响

目的分析右归丸对骨性关节炎大鼠TGF-β1/Smads信号通路的影响。方法将64只成年SD大鼠利用随机数字表法分为4组,每组15只。正常组不做任何处理;模型组、右归丸组、抑制剂组采用经典的Hulth法建立膝骨性关节炎模型,造模6周后,右归丸组灌服20 g/(kg·d)的右归丸;抑制剂组腹腔注射100μg/(kg·d)的TGF-β1/Smads信号通路抑制剂SB431542,同时灌服20 g/(kg·d)的右归丸;模型组灌服等剂量的生理盐水,连续给药8周。末次给药24 h后取关节软骨组织,制作病理切片观察软骨病理改变,采用ELISA法检测软骨组织中肿瘤坏死因子α与白细胞介素1β水平,免疫组化染色观察软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白与基质金属蛋白酶13(MMP-13)阳性表达,采用RT-PCR法检测软骨组织中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达,采用Western blot检测软骨组织中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达。结果与模型组比较,抑制剂组软骨组织Mankin评分降低(P0.05),软骨组织中肿瘤坏死因子α与白细胞介素1β水平降低(P0.05),Ⅱ型胶原蛋白阳性表达升高(P0.05),MMP-13阳性表达降低(P0.05),TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达升高(P0.05),TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达升高(P0.05)。与抑制剂组比较,右归丸组软骨组织Mankin评分降低(P0.05),软骨组织中肿瘤坏死因子α与白细胞介素1β水平降低(P0.05),Ⅱ型胶原蛋白阳性表达升高(P0.05),MMP-13阳性表达降低(P0.05),TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达升高(P0.05),TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达升高(P0.05)。结论右归丸对骨性关节炎大鼠软骨组织具有保护作用,其作用机制可能与TGF-β1/Smads信号通路有关。     

Smad7在肌腱粘连组织中的表达及对肌腱成纤维细胞纤维化的作用

[目的]通过观察人肌腱粘连组织中Smad7的表达情况,并在TGF-β1诱导的肌腱成纤维细胞(TDFs))中沉默或过表达Smad7,观察细胞纤维化相关指标的变化,讨论Smad7在肌腱粘连中的作用及调控机制。[方法]收集肌腱粘连组织及正常肌腱腱周组织,Western blotting检测Smad7蛋白含量。设计并合成针对Smad7基因编码区的siRNA,同时构建Smad7基因表达载体,经脂质体转染至TDFs细胞,Real Time-PCR检测胞内Smad7基因含量,Western-blot检测细胞中Smad7蛋白表达;使用TGF-β1诱导转染后TDFs细胞,CCK-8检测细胞增殖活性变化,Western blotting检测纤维化相关的蛋白指标。[结果]与正常腱周组织比较,肌腱粘连组织中Smad7蛋白减少。siRNA及Smad7基因过表达载体转染TDFs,可以明显抑制或者上调细胞内Smad7基因含量及蛋白表达,与未转染组比较,差异均有统计学意义(P0.05);TGF-β1诱导的TDFs细胞,可以明显增强细胞增殖活性(P0.01,vs未诱导组),siRNA转染后,TGF-β1诱导TDFs增殖活性和纤维化蛋白指标上升的趋势进一步增强,Smad7基因表达载体转染则使得TGF-β1诱导TDFs增殖活性和纤维化蛋白指标增强的趋势得到明显抑制,基因干预且诱导组与只诱导组细胞活性和蛋白含量相比较,差异均有统计学意义(P0.05)。[结论]肌腱粘连组织中Smad7蛋白减少,提示肌腱粘连发生过程中Smad7表达受抑制;Smad7基因过表达可以抑制TGF-β1诱导TDFs细胞纤维化。     

γ干扰素对小鼠骨骼肌钝挫伤后转化生长因子-β-Smad信号通路表达的影响

目的 观察γ干扰素(IFN-γ)局部注射对小鼠骨骼肌钝挫伤后纤维化以及转化生长因子-β(TGF-β)-Smad信号通路表达的影响.方法 将30只成年雌性C57bl小鼠随机分为正常组(A组)、磷酸盐缓冲液(PBS)注射组(B组)和hIFN-γ注射组(C组),每组10只.B、C组采用50g钢球于30cm高度下砸的方法 造成双侧腓肠肌钝挫伤,分别于伤后1、2、3周局部皮下注射0.1ml PBS或hIFN-γ,A组不行任何处理;4周后取双侧腓肠肌检测.以Masson染色后计算胶原纤维面积评估骨骼肌纤维化程度,Western blot检测TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表达水平.结果 Masson染色显示B组胶原面积最大为(14074.0±15.2)μm2(P<0.05),C组为(4019.0±13.4)μm2高于A组(1741.0±10.1)μm2(P<0.05);TGF-β1在B、C组表达增高(P<0.05),但两组之间表达差异无统计学意义(P>0.05);3组间Smad4、7的表达差异无统计学意义(P>0.05);Smad2、3及其磷酸化蛋白在B、C组表达升高(P<0.05),其中磷酸化的Smad2、3 在C组较B组表达明显降低(P<0.05).结论 局部注射hIFN-γ,未发现影响TGF-β1的表达,但能够有效降低Smad2、3磷酸化蛋白的表达,可能是其抑制损伤骨骼肌纤维化的作用机制.

Abstract：

Objective To observe the influence of local injection of human interferon γ (hIFN-γ) on the fibrosis and transforming growth factor-β1 (TGF-β1)-Smad signal pathway in the skeletal muscle following acute contusion. Methods Thirty female C57bl mice were randomly divided into 3 groups as A, B and C. The mice in groups B and C were injured by heavy hit of a 50 g ball from 30 cm height to establish gastrocnemius contusion models, and then subcutaneously injected with 0.1 ml PBS and hIFN-γ respectively. No interference was given to group A. All mice were sacrificed 4 weeks later to harvest the gastrocnemius. Fibrosis was estimated by calculating collagen areas on masson staining section. Expression of the proteins as TGF-β1, Smad2, Smad3, Smad4 and Smad7 was detected by Western blotting. Results The collagen area on masson staining section of group B was the greatest as (14 074.0±15.2) μm2, and that in group C was (4019.0±13.4) μm2, greater than that in group A (1741.0±10.1) μm2 (P<0.05). The level of TGF-β1 was increased in both groups B and C, but without statistically significant difference between them (P>0.05). No significant difference was found in Smad4 and Smad7 protein expression among three groups (P>0.05). Total Smad2 and Smad3 were increased in groups B and C but without significant difference (P>0.05). Phosphorylated Smad2/3 level was also increased in both groups B and C, and that was lower in group C (P<0.05). Conclusion Without influence on the expression of TGF-β1, local injection of hIFN-γ could reduce the phosphorylation of Smad2/3 significantly, which probably contributed to the suppression of fibrosis within injured skeletal muscle.     

褪黑激素对增生性瘢痕成纤维细胞分泌转化生长因子β1的影响及其机制

目的 研究褪黑激素对增生性瘢痕Fb分泌TGF-β1的影响及机制. 方法 采用组织块法分离培养人增生性瘢痕Fb,按随机数字表法将细胞分为褪黑激素组、褪黑激素+Luzindole(褪黑激素受体拮抗剂)组、Luzindole组和对照组(仅以细胞培养液培养),前3组每孔细胞分别添加相应物质与细胞培养液培养,褪黑激素终浓度为1×10-3 mmol/L、Luzindole终浓度为1 mmol/L.每组10个复孔.培养24 h,采用ELISA法检测细胞培养上清液中TGF-β1含量,实时荧光定量PCR检测细胞TGF-β1、Smad 7和Rho激酶(ROCK) mRNA表达.对数据进行单因素方差分析或LSD-t检验或Kruskal-Wallis检验,组间比较采用Nemneyi法. 结果 褪黑激素组Fb上清液中TGF-β1含量为(2.8±2.4) pg/mL,低于褪黑激素+Luzindole组的(23.9±2.7)pg/mL、对照组的(28.9±2.0) pg/mL和Luzindole组的(24.9 ±2.8)pg/mL(F=94.58,P＜0.05).褪黑激素组细胞TGF-β1 mRNA表达量为11.9±1.2,明显低于其他组(F=20.79,P＜0.05)；褪黑激素+Luzindole组TGF-β1mRNA表达量(14.9±1.8)与对照组(17.2±0.6)比较差异无统计学意义(t=0.806,P＞0.05).褪黑激素组Fb Smad 7 mRNA表达量(0.076±0.080)明显高于对照组(0.023±0.024)、褪黑激素+Luzindole组(0.026 ±0.026)、Luzindole组(0.037±0.021),x 2=9.567,P＜0.05.褪黑激素组ROCK mRNA的表达量明显低于对照组(0.002 30±0.002 70)、褪黑激素+Luzindole组(0.001 30±0.001 20)和Luzindole组(0.001 10 ±0.001 20),x 2=9.420,P＜0.05. 结论 褪黑激素可通过与受体结合,上调瘢痕Fb中Smad 7表达、下调ROCK表达,从而抑制增生性瘢痕Fb表达TGF-β1.     

基质金属蛋白酶9及TGF-β1 mRNA和蛋白在骨关节炎中的表达

目的 TGF-β1对骨关节炎(osteoarthritis,OA)关节软骨起保护作用,探讨OA中基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)、TGF-β1 mRNA和蛋白表达的相关性,为临床治疗OA寻找有效的干预靶点提供理论依据。方法取自愿捐赠的关节软骨及滑膜标本,其中OA患者60例(实验组),外伤截肢、交叉韧带断裂、盘状软骨损伤与半月板损伤患者20例(正常对照组)。行HE染色观察关节软骨与滑膜的病理组织学改变,免疫组织化学染色观测MMP-9及TGF-β1蛋白表达,原位杂交技术检测MMP-9及TGF-β1 mRNA表达;并进行相关性分析。结果 HE染色显示实验组关节软骨细胞固缩、坏死、排列紊乱,细胞外基质断裂,关节滑膜细胞肥大增生、淋巴细胞和单核细胞浸润,多数小血管增生;正常对照组软骨细胞排列整齐、基质染色均匀,滑膜组织无慢性炎症表现、无明显增生。两组均可见MMP-9、TGF-β1 mRNA和蛋白阳性表达,阳性细胞包括软骨细胞、滑膜衬里层细胞及滑膜下层的血管内皮细胞、成纤维细胞、炎性浸润细胞等。实验组MMP-9及TGF-β1 mRNA和蛋白表达均高于正常对照组(P<0.01)。实验组MMP-9 mRNA与蛋白表达成正相关(r=0.924,P=0.000),TGF-β1 mRNA及蛋白表达亦成正相关(r=0.941,P=0.000);实验组MMP-9及TGF-β1蛋白表达成负相关(r=—0.762,P=0.000),MMP-9 mRNA及TGF-β1 mRNA表达成负相关(r=?0.681,P=0.000)。结论 OA中TGF-β1的高表达下调了关节软骨与滑膜中MMP-9的表达,对OA关节软骨起保护作用,从而延缓OA进展。