球形芽孢杆菌两毒蛋白基因的分别克隆及杀蚊幼活性的协…

将球形芽孢杆菌两毒蛋白基因分别克隆并分别在大肠杆菌及鱼腥藻中表达，经对淡色库蚊幼虫毒性测试结果表明：只表达一种毒蛋白基因的大脾性杆菌或鱼腥藻对蚊幼虫无毒效，而将分别表达这两处基因的大脾性杆菌或鱼腥藻等浓度混合使用时表现出高的杀蚊活性，从而证明球形芽孢杆菌两毒蛋白基因具有明显的协同作用，其杀蚊性与同细胞表达两种毒蛋白基因的大肠杆菌或鱼腥藻相比，结果相似，无明显差异。     

建立三种基因工程杀蚊幼蓝藻

基因工程杀蚊幼蓝藻的应用，为持续控制蚊幼虫的研究提供了新的途径。本文将携有球形芽孢杆菌晶体蛋白基因的ｐＤＣ２６穿梭质粒，通过接合转移导入多种鱼腥藻中进行表达。结果表明，所得到的基因工程藻Ａｎａｂａｅｎａｓｐ．７１２０Ａｎａｂａｅｎａｃｙｌｉｄｒｉｃａ和Ａｎａｂａｅｎａｓｕｂｔｒｏｐｉｃ对淡色库蚊幼虫具有较高的毒效，２４ｈ半数致死浓度（ＬＣ５０）分别为：３．５１×１０４细胞／ｍｌ、３．３２×１０４细胞／ｍｌ和４．３４×１０４细胞／ｍｌ，其杂合质粒在蓝藻中有很高的稳定性，具备现场应用的要求。     

苏云金芽孢杆菌杀蚊新菌株LLP29对白纹伊蚊作用机理的研究

从武夷山自然保护区白玉兰叶片上分离获得1株新的苏云金芽孢杆菌菌株LLP29,内含cyt1Aa6杀蚊基因。纯化的Cyt1Aa6毒素蛋白对白纹伊蚊幼虫和C6/36细胞都有高效活性。为更好地利用该菌株对白纹伊蚊进行生物防治,本试验以白纹伊蚊敏感品系及C6/36细胞为研究对象初步研究了其作用机理。免疫荧光染色和免疫组织化学实验结果表明:Cyt1Aa6毒素蛋白主要结合于C6/36细胞膜和白纹伊蚊幼虫中肠上。     

转入人肿瘤坏死因子α基因的鱼腥藻IB02（＋）的细胞毒活性及其体内抗肿瘤药效学研究

目的测定转入人肿瘤坏死因子α（hTNFα）基因的鱼腥藻IB02（＋）的抗肿瘤药效。方法在相同的培养条件下通过100L光生物反应器培养4组转入hTNFα基因鱼腥藻IB02（＋）,分别命名为批次1、2、3、4,经过反复冻融和真空冷冻干燥处理,得到转入hTNFα基因鱼腥藻IB02（＋）粗提物干粉样品。采用结晶紫染色法检测转入hTNFα基因鱼腥藻IB02（＋）粗提物干粉样品的细胞毒活性,并通过测定不同批次间的细胞毒活性差异检测其稳定性。采用转入人肿瘤坏死因子α（hTNFα）基因鱼腥藻IB02（＋）对小鼠肝癌细胞H-22的抑制来测定体内抗肿瘤药效。结果转入hTNFα基因鱼腥藻IB02（＋）的细胞毒活性约为8000U/mg。4种不同批次的转入hTNFα基因蓝藻IB02（＋）细胞毒活性相当,hTNFα蛋白性质比较稳定。小鼠1次口服最大耐受量为16.0g/kg,在观察期内所有受试小鼠无一死亡,生长发育正常,主要脏器未见异常,未显示明显毒性。药效学研究表明,口服6g/kg转入hTNFα基因蓝藻IB02（＋）对小鼠肝癌细胞H-22的抑制率平均值（37.7±3.4）%,最高值为41.5%（P〈0.001）。结论转入hTNFα基因鱼腥藻IB02（＋）抗肿瘤作用明显,无明显的毒副作用且药效学性质稳定。     

武夷山土壤中分离的Bt杀蚊新菌株

本研究对武夷山的5份土壤样本进行苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)菌株的分离,获得2株Bt新菌株,编号分别为QQ3和QQ17。生物测定结果表明,QQ17对白纹伊蚊有很高的杀虫活性,校正死亡率达95.6%,超过标准菌株Bt H-14;SDS-PAGE结果显示,QQ17菌株含多种杀蚊蛋白。因此该新菌株将会是一个很好的生物杀蚊制剂候选菌株。     

恶性疟原虫环子孢子蛋白单链抗体与按蚊cecropin A融合基因的构建、原核表达及生物学活性的初步分析

根据按蚊偏嗜性密码子对鼠源性恶性疟原虫环子孢子蛋白单链抗体2a10基因进行改造,并融合按蚊抗菌肽cecropin A编码基因。将获得的cecrop-m2a10融合基因克隆入原核表达载体pET32a（＋）中,对表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析并利用琼脂糖扩散法检测其抗菌活性。结果对鼠源性环子孢子蛋白单链抗体2a10中6种氨基酸的170个核苷酸进行了改造,融合cecropinA编码基因,成功构建了cecrop-m2a10融合基因。靶基因在大肠杆菌中以融合蛋白和包涵体的形式高效表达,包涵体经尿素溶解变性及透析复性后表达蛋白的纯度达75%并具备抗大肠杆菌DH5α的活性。本实验为进一步研究cecrop-m2a10在转基因蚊中的多重抗病原效应提供了基础。     

血管抑制素和内皮抑制素在大肠杆菌中的融合表达与鉴定

血管抑制素（AS）和内皮抑制素（ES）是两种具有较强活性的内源性血管抑制剂，联合应用具有协同作用。本研究通过大肠杆菌表达AS-ES融合蛋白，观察其对血管生成的抑制作用。首先用RT-PCR方法分别获得AS和ES基因，通过基因拼接获得融合基因，构建了含有该融合基因的原核表达质粒——pET-42（b）／AS-ES。表达菌株经IPTG诱导后目的蛋白以包涵体形式表达，表达量为14％，分子量约65KD。Western blotting检测表明表达产物可分别与AS和ES抗体产生特异的免疫反应。经复性、肝素亲和层析柱纯化的表达产物对鸡胚尿囊膜血管有明显抑制作用。本研究获得了AS、ES在大肠杆菌中的融合表达．目的蛋白具有特异的免疫反应性和血管抑制活性。     

二硫键稳定的抗肝癌人源化scFv—hTNFα突变体融合在大肠杆菌中表达

目的 提高抗肝癌体靶向人肿瘤坏死因子（scFv-hTNFα）的稳定性和杀伤活性，并探讨该新型靶向细胞因子在大肠杆菌中的可溶性表达。方法 以引物PCR法和重叠延伸PCR法，对人源化抗肝癌hscFv25及hTNFα基因进行定点突变，构建重组表达载体pGEX-hFvT，并以IPTG在大肠杆菌中诱导表达。用免疫组化染色和MTT比色法，分别检测重组蛋白折抗体和hTNFα突变体的双重活性。结果 重组基因在大肠杆菌中获得高效可溶性表达。表达产物具有抗体和hTNFα突变体的双重活性，重组蛋白的稳定性得到大幅度提高，抗体活性于4℃放置3个月活性无明显下降，抗肿瘤活性较天然hTNFα高4倍。结论 重组基因在大肠杆菌中获得了高效功能性表达；重组蛋白稳定性及抗肿瘤性得到大幅度提高，为进一步的临床应用研究奠定了基础。     

生物杀虫剂球形赖氨酸芽孢杆菌的研究进展

自从20世纪60年代分离得到第1株具有杀灭蚊幼虫的细菌后,陆续出现了很多具有作为生物杀虫潜力的菌株.球形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sphaericus（又称球型芽孢杆菌Bacillus sphaericus）和苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis是目前研究最为深入,在我国应用最广泛的生物杀虫剂.本文旨在通过对以往有关L.sphaericus的研究进行总结综述,包括其关键特性、灭蚊毒素及作用机制等,为进一步研究新型无污染的生物杀虫剂产品提供研究的视角.     

重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌的构建和分泌表达

目的构建重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌及其目的蛋白的分泌表达,并对其酶活性进行测定。方法从pET-22b/pUOX重组质粒上PCR获得pUOX基因,然后通过重叠延伸PCR技术将pUOX与一段nprB信号肽基因相连,导入穿梭载体pP43X,构建重组载体pP43X/pUOX,运用化学转化法转化枯草芽孢杆菌WB800中。结果发酵表达后胞外分泌液经SDS-PAGE检测,在约34kD处有一清晰蛋白条带,这与预期分子量一致。发酵液中该重组蛋白的酶活力达2.322U/ml。结论成功构建重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌,目的蛋白分泌表达并具有较高活性。     

应用枯草芽孢杆菌表达系统制备肠道病毒71型VP1蛋白

目的利用枯草芽孢杆菌系统表达肠道病毒71型（EV71）病毒VPl蛋白。方法使用基因特异性引物扩增VPl开放读码框（ORF）,构建包含VP1完整开放读码框的pSac—VPl穿梭载体。根据枯草芽孢杆菌表达系统双交叉同源重组的特点,将EV71的结构抗原基因VPl整合在枯草芽孢杆菌sacA染色体,并经测序鉴定。使用VPl特异性抗体,通过蛋白印记（Western—Blot）鉴定枯草芽孢杆菌中VPl蛋白的表达情况。结果成功克隆EV71的VPl基因,长度1361bp,并将其克隆入穿梭载体pSae—Kan。测序结果显示VPl基因成功整合如sacA染色体。Western．Blot证实VPl抗原在枯草芽孢杆菌的成功表达,相对分子质量约35×10^3。结论利用枯草芽孢杆菌表达系统成功制备EV71病毒VPl抗原,为后续EV71诊断试剂、疫苗研发奠定基础。     

顺式氯氰菊酯对蚊幼虫脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶和多酚氧化酶的影响

分别用０．６９７ｎｍｏｌ／Ｌ和１．３９３ｎｍｏｌ／Ｌ顺式氯氰菊酯处理嗜人按蚊、斯氏按蚊和白纹伊蚊３龄幼虫，待生长至４龄，测定其脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶和多酚氧化酶活性。与对照组相比，用药组蚊幼虫三种酶活力均有显著变化，表明顺式氯氰菊酯对蚊幼虫的这三种酶产生了明显的影响。     

HSP65-MUC1 VNTR2融合蛋白的表达、纯化及其抗肿瘤作用

目的：通过基因工程手段在大肠杆菌中表达HSP65-MUC1 VNTR：融合蛋白、鉴定和纯化，并研究其在动物体内的肿瘤生长抑制活性。方法：通过PCR获得结核分支杆菌HSP65基因，以重叠PCR获得人MUC1基因VNTR的2个重复序列，构建原核重组表达载体HSP65-MUC1 VNTR2-pET28a（＋）。在大肠杆菌BL21（DE3）中利用IPTG诱导表达；利用单克隆抗体（mAb）进行Western blot鉴定，以Q柱和凝胶过滤纯化获得纯化蛋白。通过建立转染人MUC1基因的B16黑色素瘤小鼠肿瘤模型，在C57BL／6小鼠体内研究HSP65-MUC1 VNTR，融合蛋白的肿瘤生长抑制活性。结果：获得的结核分支杆菌HSP65基因和人MUC1基因VNTR区的2个重复片段，经测序证明分别与GenBank中结核杆菌HSP65基因和人MUC1基因的VNTR完全相符；构建的原核表达载体HSP65-MUC1 VNTR2-pET28a（＋）可稳定的可溶性表达HSP65-MUC1VNTR2蛋白；经Q柱和凝胶过滤纯化，纯化的目的蛋白纯度达95％以上；利用鼠抗人MUC1mAb对表达蛋白进行验证，结果阳性；小鼠肿瘤预防免疫实验表明，实验组小鼠抑瘤率大于对照组，且具有明显性差异。结论：成功地利用原核表达系统实现了对HSP65-MUC1 VNTR2蛋白的可溶性表达，并对其体内预防实验进行了初步研究，证明该融合蛋白能明显抑制表达MUC1的肿瘤生长。为进一步评价其作为肿瘤疫苗可能性的研究打下了基础。     

顺式氯氰菊酯对蚊幼虫脱氧核糖核酸酶,核糖核酸酶和多酚 …

分别用０．６９７ｎｍｏｌ／Ｌ和１．３９３ｎｍｏｌ／Ｌ顺式氯氰菊酯处理嗜人按蚊、靳氏按蚊和白纹伊蚊３龄幼虫，待生长至４龄，测定其脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶和多酚氧化酶活性。与对照组相比，用药组蚊幼虫三种酶活力均有显著变化，表明顺式氯氰菊酯对蚊幼虫的这三种酶产生了明显的影响。     

可溶性巨噬细胞集落刺激因子受体基因的克隆和原核表达

目的：克隆可溶性巨噬细胞集落刺激因子受体（sMR）基因，在大肠杆菌中表达，经纯化、复性后获得活性蛋白。 方法： 从人骨髓细胞中提取总RNA，在sMR基因引物两端分别加上NdeI和BamHI酶切位点，利用RT-PCR技术扩增sMR基因，经NdeⅠ和BamHⅠ酶切后连接到表达载体pET28a，测序证实克隆基因的正确性，并在大肠杆菌BL21菌株中诱导表达，采用his-tag纯化柱纯化目的蛋白，并经复性处理，配体结合实验证实蛋白活性。 结果： 限制性内切酶切出了预期条带，测序证实了克隆基因的正确性，sMR经诱导后在大肠杆菌中以包涵体形式表达，表达蛋白经纯化和复性处理，获得了具有活性的功能蛋白。 结论： 成功克隆与表达了sMR基因，得到了具有活性的功能蛋白，为进一步研究其生物学功能和应用奠定了基础。     

二硫键稳定的抗肝癌人源化scFv-hTNFα突变体融合基因在大肠杆菌中表达

目的　提高抗肝癌抗体靶向人肿瘤坏死因子(hscFv2 5-hTNFα)的稳定性和杀伤活性 ,并探讨该新型靶向细胞因子在大肠杆菌中的可溶性表达。方法　以引物PCR法和重叠延伸PCR法 ,对人源化抗肝癌hscFv2 5及hTNFα基因进行定点突变 ,构建重组表达载体 pGEX -hFvT ,并以IPTG在大肠杆菌中诱导表达。用免疫组化染色和MTT比色法 ,分别检测重组蛋白的抗体和hTNFα突变体的双重活性。结果　重组基因在大肠杆菌中获得高效可溶性表达。表达产物具有抗体和hTNFα突变体的双重活性 ,重组蛋白的稳定性得到大幅度提高 ,抗体活性于 4℃放置 3个月活性无明显下降 ,抗肿瘤活性较天然hTNFα高 4倍。结论　重组基因在大肠杆菌中获得了高效功能性表达 ;重组蛋白稳定性及抗肿瘤活性得到大幅度提高 ,为进一步的临床应用研究奠定了基础     

以CAT为报告基因的蜡样芽孢杆菌强组成型启动子的筛选及初步鉴定

目的 从蜡样芽孢杆菌基因组中筛选组成型启动子,并对其活性进行鉴定.方法 用Sau3 AⅠ酶切蜡样芽孢杆菌的基因组,回收片段,连接载体pCMR8a,转化DH5α感受态后涂布在氯霉素和卡那霉素的培养基上得到强启动子,并对其进行截短和顺反性实验,并检测其启动蛋白表达情况.结果 成功筛选到一个具有反向启动外源蛋白表达能力的启动子序列,并能够有效表达多种外源蛋白.结论 本实验成功筛选并验证了蜡样芽孢杆菌的一种组成型启动子,能够有效地启动外源蛋白的表达,对实验室中表达某种或某些蛋白和工业生产提供了更多的选择.     

葡萄球菌蛋白A"ZZ"与EGFP的融合表达及活性测定

目的 将EGFP基因与葡萄球菌蛋白A（SPA）基因的龙结构域重组，尝试以融合标记的方式构建一种新型免疫亲和试剂。方法 利用基因工程技术将EGFP基因重组至pEZZ18质粒，构建原核分泌表达载体pEZZ-EGFP，通过竞争ELISA和荧光光谱测定其在大肠杆菌中表达产物ProZZEGFP的生物学活性。结果 pEZZ-EGFP在E．coli HB101中正确表达，所表达融合蛋白具有与哺乳动物IgG抗体结合的生物学活性和EGFP的荧光活性。结论 ProZZ—EGFP融合蛋白有忽结构域（SPA）和EGFP二者生物学特性，在免疫荧光测定中可作为一种通用亲和试剂。     

杀菌/通透性增加蛋白N端片段在原核细胞中的表达及其临床应用的初步探讨

目的：构建编码杀菌，通透性增加蛋白(BPI)N端片段基因原核表达载体，并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法：采用RT-PCR技术，从人外周血中性粒细胞的总RNA中扩增BPI蛋白N端片段cDNA编码区基因，DNA序列分析鉴定；将测序证实的BPI蛋白N端片段编码区基因PCR产物直接克隆于原核表达载体pBAD／Thio-TOPO中，再次测序鉴定；通过在大肠杆菌中以L-阿拉伯糖进行诱导表达，然后以SDS-PAGE、Westerm blot对表达的重组蛋白进行分析。重组蛋白经初步纯化处理后，进行生物学活性检测。结果：RT-PCR扩增出一个835bp的DNA片段，DNA测序表明为所需目的基因。限制性内切酶酶切和DNA序列分析表明，BPI蛋白N端片段正确克隆到大肠杆菌表达载体pBAD／Thio-TDPO中，SDS-PAGE和Wester blot结果表明在大肠杆菌中成功表达了BPI蛋白N端片段。对该蛋白进行初步活性测定显示其可与BPI单克隆抗体结合并具有杀灭耐药铜绿假单胞菌的活性。结论：成功构建了BPI蛋白N端片段编码区基因原核表达载体，并在大肠杆菌中进行了表达，表达的重组蛋白具有一定的生物活性。     

CRISPR系统相关蛋白的纯化与活性分析

目的对CRISPR相关蛋白Cas3、Cas6及Cas9进行表达纯化,并测定其活性。方法在体外构建带有目的基因的质粒,导入大肠杆菌表达系统,通过大肠杆菌的过表达,裂解并提取蛋白,利用His标签,可将目的蛋白纯化出来;通过3种Cas蛋白对不同核酸的切割,分别设计3种核酸底物,再通过聚丙烯酰胺凝胶电泳,最终确定Cas蛋白的活性。结果成功表达并纯化得到Cas3、Cas6及Cas93种蛋白,并根据其蛋白特性,与相应的核酸底物进行孵育,在电泳后通过凝胶成像,可观察到3种蛋白均具有活性。结论表达纯化的Cas3、Cas6及Cas9具有生物学功能,为其功能机制研究奠定了基础。