实时荧光定量RT-PCR技术在手足口病疫情监测中的应用

[目的]对手足口病患者标本进行病毒核酸检测,探讨实时荧光定量RT-PCR方法在手足口病疫情监测中的意义。[方法]采用实时荧光定量RT-PCR方法对2010年3～8月连云港市采集的307份手足口病患者标本进行肠道病毒核酸检测,并对肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CVA16)进行分型。[结果]307份手足口病患者标本中有221份肠道病毒核酸阳性,阳性率71.99%,其中EV71型病毒核酸阳性标本123份,阳性率40.07%,CVA16型病毒核酸阳性标本66份,阳性率21.50%。[结论]实时荧光定量RT-PCR方法耗时短、特异性强、灵敏度高,可作为手足口病疫情监测的诊断方法。     

实时荧光PCR检测EV71病毒核酸的临床应用价值

目的:讨论实时荧光PCR技术检测EV71病毒核酸的临床价值。方法:对128例临床诊断为手足口病患者采用实时荧光RT-PCR技术检测患者粪便中EV71病毒核酸,分析结果与临床诊断相符性。结果:128例临床诊断为手足口病的患儿经实时荧光RT-PCR检测EV71病毒核酸阳性者65例(50.78%)。结论:实时荧光RT-PCR技术是诊断手足口病的主要实验方法,但该方法存在一定的漏检,临床诊断手足口病时应密切结合临床以防漏诊。     

实时荧光RT-PCR快速检测手足口病病原体结果分析

目的建立手足口病的实时荧光RT-PCR检测技术平台,开展手足口病病原学检测工作,为手足口病防控提供实验依据。方法用实时荧光RT-PCR法检测河池市2010—2011年手足口病EV、EV71和CA16病毒核酸。结果共检测578例手足口病临床诊断病例样本,421例EV阳性,阳性率为72.84%;其中EV71阳性109例(25.89%),CA16阳性198例(47.03%),其他肠道病毒阳性114例(27.08%);6岁以下儿童EV阳性占所有感染者的99.05%;2010和2011年儿童EV71、CA16、其他肠道病毒阳性率分别为47.86%、10.00%、18.57%和9.59%、42.01%、20.09%;重症病例EV71阳性率为65.38%。结论实时荧光RT-PCR法,适合于手足口病快速确诊及常规监测,特别是重症病例诊断的重要依据。该市不同年度手足口病感染型别有差异,2010年的主要病原体为EV71,其次是其他肠道病毒;而2011年的主要病原体为CA16,其次其他肠道病毒。6岁以下儿童是EV感染的高危人群;EV71是引起重症病例的主要病原体。     

肠道病毒71型核酸检测在诊断手足口病中的意义

目的 评价肠道病毒71型(EV71)病毒核酸检测在诊断手足口病中的意义.方法 对132例临床诊断为手足口病的患儿和18例非手足口病的患儿同时采用实时荧光RT-PCR技术检测入院时粪便中EV71病毒核酸,分析实时荧光RT-PCR检测结果与临床诊断的相符性.结果 132例手足口病的患儿入院时粪便中检出EV71阳性者有85例,占64.39%;18例非手足口病患儿粪便中未检出EV71,分析显示两组差异有统计学意义(x2=26.75,P＜0.05).结论 引起手足口病的病原体主要为EV71,病毒核酸检测阳性者可确诊为手足口病,但核酸检测阴性者不能排除手足口病感染的可能,应密切结合临床症状进行诊断.     

哈尔滨市2008年手足口病病原学检测结果分析

目的研究2008年哈尔滨市手足口病的病原学情况。方法应用RT-PCR和病毒分离两种方法对疑似手足口病患者标本进行检测。结果 RT-PCR快速检测EV71阳性率为25.64%,CA16阳性率0.64%;病毒分离培养EV71阳性率为37.82%,CA16阳性率为2.56%。156份标本分离出阳性病毒株63份,其中EV71阳性59份(占总阳性数的93.65%),CA16阳性4份(占总阳性数的6.35%)。结论哈尔滨市2008年手足口病的流行株为肠道病毒EV71型。手足口病病毒分离培养法阳性率高于RT-PCR法。粪便(包括肛拭子)和咽拭子标本手足口病病毒分离阳性率较高。     

实时荧光RT-PCR法与常规RT-PCR法检测手足口病病原体的比较

目的对比分析实时荧光RT-PCR法与常规RT-PCR法在手足口病病原体检测中的差别,并评价其优劣。方法采用实时荧光RT-PCR法与常规RT-PCR法,对手足口病患者的咽拭子标本进行检测,并对检测结果作统计学分析。结果实时荧光RT-PCR法与常规RT-PCR法检测EV71结果差异有统计学意义(χ2=21.62,P0.01),EV71阳性率分别为76.53%(75/98)和41.84%(41/98),实时荧光RT-PCR法EV71阳性而常规RT-PCR法EV71阴性的样品有7份。实时荧光RT-PCR法与常规RT-PCR法检测Cox A16结果差异有统计学意义(χ2=34.45,P0.01),Cox A16阳性率分别为13.26%(13/98)和5.10%(5/98),实时荧光RT-PCR法Cox A16阳性而常规RT-PCR法Cox A16阴性的样品有3份。实时荧光RT-PCR法从RNA提取到检测结果需3 h~4 h,常规RT-PCR法需6 h~7 h。结论实时荧光RT-PCR法具有快捷、灵敏、直观等特点,在手足口病病原体检测中具有较大的应用价值。     

一步RT-PCR方法在黑龙江省手足口病病原检测中的应用

目的了解核酸检测方法在黑龙江省手足口病病原谱调查中的应用价值,为疾病防控提供依据。方法在全省范围内收集2009年和2010年疑似手足口病病人疱疹液、咽拭子或肛拭子标本,使用人肠道病毒通用引物、肠道病毒71型(EV71)引物和萨奇病毒A组16型(CVA16)引物,采用一步RT-PCR方法进行病原核酸检测,进而分析病原构成,并对部分核酸检测阳性标本进行病毒分离。结果 2009年检测标本985份,其中EV71阳性226份、CVA16阳性191份、EV71和CVA16合并阳性3份,其他肠道病毒阳性100份。2010年检测标本1696份,其中EV71阳性354份、CVA16阳性356份、其他肠道病毒阳性188份。两年标本肠道病毒阳性率平均为52.87%,其中EV71和CVA16占阳性标本中病原总数的79.69%。选取353份核酸检测阳性标本进行病毒分离,共获得毒株265株。结论一步RT-PCR方法用于手足口病病原检测稳定、特异、快捷、易于分型,EV71和CVA16是黑龙江省近两年手足口病的主要病原体。     

实时荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的应用

目的探讨实时荧光RT-PCR和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测手足口病病毒核酸的应用价值。方法采集2009年5-8月奉贤区幼儿疑似肠道病毒感染者粪便和咽拭子标本,分别用实时荧光RT-PCR和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对肠道病毒EV71、Coxsackie A16(CoXA16)病毒进行检测。结果在对38例疑似病例的粪便和咽拭子标本进行检测时,用实时荧光RT-PCR方法检测到EV71、CoXA16阳性标本为63份,阳性率为82.89%;而用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测到52份阳性标本,阳性率为68.42%。结论实时荧光RT-PCR技术具有特异性强、灵敏度高的特点,且能在采样后数小时内检测到病毒的RNA,从而达到快速诊断的目的。因此,该方法对肠道病毒的流行病学调查及控制起重要作用。     

连云港市2010年手足口病的病原学检测与分析

目的 对连云港市2010年手足口病例标本进行病原学检测,了解手足口病的感染情况,分析检测结果,为手足口病的预防和临床诊断提供科学依据.方法 采用Real Time RT-PCR方法对手足口病患者咽拭子、肛拭子标本进行肠道病毒(EV)、肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒16型(CoxA16)特异性核酸的检测.结果 475例患者标本中EV71阳性率27.8％(132例),CoxA16阳性率20.0％(95例),其他肠道病毒阳性率7.8％(37例);全年的感染高峰是4～6月份,占全年的39.58％;发病年龄以低年龄组为主,0～3岁感染率为77.68％.结论 手足口病发病有明显的时间和年龄差异,连云港市手足口病病原以EV71和CoxA16为主,重症病例的病原以EV71为主,荧光定量RT-PCR可快速诊断手足口病病原.     

肠道病毒EV71和CAV6分离效果影响因素分析

目的探讨肠道病毒EV71、CAV6样本荧光定量RT-PCR的Ct值、接种剂量等因素对病毒分离效果的影响。方法采集确诊手足口病例咽拭子、肛拭子标本,应用荧光定量RT-PCR法检测病毒核酸,选取强阳性、阳性、弱阳性EV71、CAV6标本各30份,按不同剂量梯度(100,200,300,400μL)接种于RD细胞进行病毒培养分离。结果 180份标本的总体分离阳性率为52.2%,其中EV71阳性率60.0%,CAV6阳性率44.4%,差异有统计学意义(P0.05);肛拭子分离阳性率60.9%,咽拭子分离阳性率43.2%,差异有统计学意义(P0.05)。不同接种剂量的病毒分离阳性率差异有统计学意义(P0.05)。结论肠道病毒EV71、CAV6标本荧光定量RT-PCR的Ct值、接种剂量、标本类型、分离细胞株对分离阳性率均有影响。     

多重荧光RT-PCR方法检测手足口肠道病毒方法的研究

目的为了解手足口病的流行和感染情况,并进行快速准确的检测。方法本研究建立了含非竞争性内标的同时检测肠道病毒通用型、肠道病毒EV71型及柯萨奇病毒CA16型的四重荧光RT-PCR方法,对该方法的特异性、灵敏度等进行评价,并对多份临床样本进行了应用检测。结果实验结果表明,该检测方法特异性强,对肠道病毒及其他人类非肠道病毒进行了检测,显示了良好的特异性;该检测方法对EV71型和CA16型的检测灵敏度分别达到31.25 TCID50和1.25×102TCID50;将浓度为1×104TCID50及5×102TCID50的EV71样本进行重复性实验,其变异系数均小于1.5%;将浓度为5×102～5×105TCID50的EV71和CA16样本进行定量范围实验,其相关系数R2值在0.982～0.998之间。采用本研究建立的方法检测40份疑似临床样本,最后检出31份肠道病毒阳性样本,检出率为77.5%,其中8例为EV71型阳性,13例为CA16型阳性。另外,实验数据表明内标对监控PCR抑制物的存在具有重要作用。结论本方法能同时快速检测所有肠道病毒并进行EV71型及CA16型的分型,并且灵敏度高、特异性好、扩增效率高,由于加入了内标,能有效地监控假阴性的出现,适合于手足口病的临床检测。     

一步法三重荧光PCR检测手足口病病毒方法的建立及其运用

目的 建立一种三重荧光PCR检测手足口相关病毒的方法,并对收集的样本进行检测.方法 分别用普通PCR和单荧光PCR进行引物探针的测试,然后将确定的引物和探针混合进行三重荧光PCR测试和标本的检测.结果 建立了一种三重荧光PCR方法,利用该方法对94份标本进行检测,其中肠道病毒71型(EV71) 37.23％,科萨奇病毒A16(COX A16) 35.11％,其他肠道病毒4.26％.结论 本研究建立的三重荧光PCR可以特异地检测出引起手足口病的EV71和COX A16以及其他肠道病毒.     

北京市通州区手足口病病原监测结果分析

目的 监测北京市通州区手足口病病原的情况.方法 2008～2010年采集患儿、健康儿童和患儿家长的咽拭子、肛拭子等标本,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,进行肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(CoxA16)和其他肠道病毒的核酸检测.结果 调查了262例患儿、29名健康儿童和9名患儿家长.患儿中EV71阳性率为25.4％,CoxA16为8.3％,其他肠道病毒为14.9％,各年病毒型别分布差异有统计学意义(P＜0.05).48例重症患儿中EV71阳性率为18.8％,其他肠道病毒为12.5％,未检出CoxA16.8名健康儿童其他肠道病毒阳性率为12.8％.患儿家长未检出病毒.结论 患儿病毒检出率由高到低分别是EV71、其他肠道病毒和CoxA16.重症患儿中以EV71、其他肠道病毒为主.健康儿童也会携带其他肠道病毒.     

实时荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的应用

目的通过对2010年4～8月北京市怀柔区手足口病病原学监测数据的分析,了解北京市怀柔区手足口病流行趋势,为该地区手足口病防治提供科学依据,同时探讨实时荧光RT-PCR在检测手足口病毒核酸中的应用价值。方法采集2010年4～8月怀柔区疑似肠道病毒感染者咽拭子和疱疹液标本,用实时荧光RT-PCR方法对人肠道病毒(包括EV71、CoXA16)进行核酸检测。结果 2010年4～8月共采集121例标本,检出肠道病毒EV71型87例,CoXA16型19例,肠道病毒通用型6例,阴性9例。结论 2010年4～8月怀柔区手足口病毒以肠道病毒EV71型为主。实时荧光RT-PCR技术具有特异性强、灵敏度高的特点,且能在采样后数小时内检测到病毒的RNA,从而达到快速诊断的目的,该方法对手足口病的治疗及疫情的有效控制提供有力的病原学支持。     

2010年广州地区儿童肠道病毒71型感染的分子流行病学研究

目的了解广州地区2010年肠道病毒(EV)71病毒流行状况。方法设计肠道病毒71型实时荧光RT-PCR引物和TaqMan探针,运用TaqMan实时荧光RT-PCR技术,对2010年全年来医院就诊的疑似手口足病患儿送检标本20150份,进行肠道病毒71型荧光RT-PCR检测,同时,设计了扩增EV71病毒全基因组的引物,随机选取了5株病毒进行全基因组进行测定。结果在20150份临床标本中,EV71病毒的阳性为4780份,全年总的检出率为23.72%,每个月均有阳性检出;其中,EV71病毒阳性率较高的为4～7月份,最高检出率为6月份,达32.19%,最低检出率为10月份,为7.91%;扩增了5株广州株EV71病毒全基因组全长序列,提交到GenBank上,将5株广州株EV71病毒与EV71的A、B3、B4、B5、C1、C2、C3、C4型及阜阳株全基因组核苷酸序列进行ClustalW比较,发现与C4a型阜阳株等同源性为98.00%～99.00%,与C4b同源性为91.00%～93.00%,与C1-C3同源性为82.00%～83.00%,与B3、B4、B5同源性为81.00%～83.00%,与A型同源性为80.00%。结论 2010年广州地区手足口病的主要病原是肠道病毒71型,EV71病毒在2010年全年还是较普遍流行,全基因组序列分析表明,2010年分离的5株广州株EV71病毒属于C4a型。     

TaqMan-MGB荧光定量聚合酶链反应检测水痘-带状疱疹病毒

目的利用TaqMan-MGB探针技术,建立水痘-带状疱疹病毒(VZV)的荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测方法,用于临床标本VZV的检测。方法从GenBank上下载几十株VZV基因组序列,在IE62基因的保守区域设计引物与TaqMan-MGB探针,并对反应条件和体系进行优化,同时评价建立检测体系的特异性、敏感性和重复性;利用已知拷贝数的质粒标准品的病毒脱氧核糖核酸(DNA),建立了VZV基因拷贝数定量分析模型。结果该方法与引起相似发病症状的肠道病毒71型,柯萨奇病毒A、B组以及腺病毒均无交叉反应,具有很高的特异性,且灵敏度达到102拷贝,优于常规PCR方法。采用该法对8份疑似水痘、带状疱疹患者疱疹液标本检测均为阳性,较病毒分离、常规PCR法更为简便、快速、敏感。结论该方法适合临床早期感染病例的确认以及水痘、带状疱疹爆发疫情的应急诊断。     

病毒性脑炎病例中肠道病毒的分析

[目的]了解病毒性脑炎病例中肠道病毒感染的比例及流行型别分布,积累病原学诊断经验。[方法]采集2004至2007年监测病例脑脊液标本,细胞培养分离肠道病毒,RT-PCR诊断,组合血清中和试验与EVVP1基因序列分析进行血清型别鉴定。[结果]246例标本肠道病毒分离阳性率19.5%,病毒分离与RT-PCR检测总阳性率34.5%;流行/暴发病例分离阳性率（41.2%）高于一般住院病例（13.8%）;阳性率呈逐年下降趋势（44.7%～2.5%）。分离到的均为埃坷病毒（echovirus,ECV）,其中ECV30型占43.8%。RT-PCR诊断阳性率（49.0%）显著高于病毒分离率（28.9%）。[结论]病毒性脑炎中肠道病毒占比例高,ECV30为常见血清型;RT-PCR诊断敏感、快速,有实际应用价值。