CIAPIN1基因对K562细胞增殖能力的影响

本研究旨在探讨CIAPIN1基因对慢性髓系白血病（CML）细胞系I（562细胞增殖能力的影响。针对C1APIN1基因构建shRNA真核表达载体并稳定转染K562细胞,用real—timePCR和Westernblot技术验证干扰效率,采用MTT法检测K562细胞的增殖活性的改变,利用甲基纤维素集落形成实验观察K562细胞集落形成大小和数量的变化,通过体内实验观察K562细胞在小鼠体内的成瘤能力。结果表明,与对照组相比,K562细胞的CIAPIN1基因表达被有效抑制;干扰CIAPIN1基因后K562细胞的增殖活性明显下降,集落形成数量减少和集落大小显著减小,小鼠体内成瘤能力明显降低。结论：干扰CIAP删基因表达能抑制K562细胞在体内及体外的增殖能力。     

K562细胞nm23-H1基因沉默对其向巨核细胞分化的影响

目的 探讨nm23-H1沉默对K562细胞向巨核细胞分化的影响.方法 采用Lipofectamine2000将靶向nm23-H1基因的RNA干扰质粒pSileneerTM 4.1-CMV-sinm23及空质粒转染K562细胞,经G418筛选建立该基因稳定下调的K562细胞(K562-sinm23细胞)及空质粒转染K562细胞(K562-siNC细胞),实时定量PCR、免疫组织化学、蛋白印迹反应等方法证实了nm23基因沉默细胞构建成功.NBT还原比色试验检测细胞分化能力.流式细胞术检测在诱导剂佛波酯作用下K562-sinm23细胞表面巨核细胞分化抗原GP Ⅱ b-Ⅲa(CD41)的表达.蛋白印迹法检测细胞在佛波酯诱导后ERK1/2磷酸化活性.结果 与K562细胞和K562-siNC细胞比较,pSilencerTM 4.1-CMV-sinm23能够沉默内源性nm23-H1 mRNA的表达,基因水平和蛋白水平的沉默效率分别达到75%和70%.经佛波酯诱导,与K562-siNC细胞比较K562-sinm细胞的分化能力明显增强(NBT还原能力A值分别为0.23±0.05和0.31±0.07).nm23-H1基冈调控K562细胞向巨核细胞分化与ERK1/2磷酸化活性增强有关.结论 成功构建了nm23-H1基因稳定下调表达的K562细胞株,并且证明nm23-H1参与了K562细胞向巨核细胞系的分化.     

shRNA干扰IER3IP1基因表达对K562细胞增殖和红系分化的影响

目的 探讨靶向干扰IER3IP1基因对K562细胞增殖和红系分化的影响.方法 针对IER3IP1基因设计并构建小发夹状(shRNA)真核表达载体,转染K562细胞后用RT-PCR方法鉴定沉默效果.采用MTT实验、联苯胺染色、光镜和电镜观察、流式细胞术以及RT-PCR,观察抑制IER3IP1基因表达后对K562细胞的影响;采用0.2μmoL/L伊屿替尼诱导K562细胞2 d,观察诱导分化过程中IER3IP1基因表达变化情况.抑制IER3IP1基因表达后对红系分化相关基因Gfi-1B、GPA和γ-globin以及细胞表面GPA蛋白表达的影响.结果 成功构建针对IER3IP1基因的shRNA真核表达载体,转染至K562细胞中,该基因mRNA表达水平明显降低,抑制率达76%(P<0.01).与对照组细胞相比,K562-shRNA-IER3IP1组bcr-abl mRNA表达升高(P<0.05);MTT检测结果显示细胞增殖能力增强(P<0.01);流式细胞术检测结果显示S期细胞比例增加,G0/G1期细胞比例减少(P<0.05);电镜可见细胞常染色质增加、异染色质减少,内质网部分扩张,囊泡样结构滞留.0.2μmol/L伊马替尼作用48 h后,K562-shRNA-IER3IP1组联苯胺染色阳性率由作用前的(44.7±2.5)%降低至(22.7±1.5)%(P<0.01),且红系分化相关基因Gfi-1B、GPA和γ-globin的mRNA表达水平明显降低,细胞表面GPA蛋白表达水平降低.同时伊马替尼作用过程中IER3IP1基因在作用3 h时表达明显升高,6 h时降低,12～48 h表达水平基本不变.结论 干扰IER3IP1基因表达后,K562细胞增殖加快,红系分化过程受阻,提示该基因可能在K562细胞增殖和向红系分化过程中发挥作用.     

利用慢病毒载体构建过表达人TCRP1基因的慢性髓系白血病K562细胞系及其生物学功能检测

目的 利用慢病毒载体构建过表达人舌癌耐药相关基因（TCRP1）的慢性髓系白血病（CML K562细胞系并检测其生物学功能。方法 将TCRP1的重组质粒与包装质粒共转染293T细胞,收集病毒液测定滴度后感染K562细胞,使用嘌呤霉素筛选TCRP1过表达的细胞株K562/TCRP1,荧光定量PCR和Western blot方法检测TCRP1的表达,采用连续细胞计数法和CCK-8法分别对K562/TCRP1及其对照细胞株的增殖情况进行检测,并分析2个细胞株对不同浓度的伊马替尼（IM）的药物敏感性。结果 TCRP1慢病毒表达载体成功转染进入K562细胞,荧光定量PCR和Western blot结果显示K562/TCRP1细胞株的TCRP1表达在mRNA水平和蛋白水平均显著高于对照组,连续细胞计数法和CCK-8法结果表明K562/TCRP1细胞的增殖能力和细胞活力增强,IM处理K562/TCRP1细胞的IC50值显著高于其对照细胞（P <0.05）。结论 利用慢病毒载体成功构建了TCRP1过表达的K562细胞株,并且发现TCRP1的过表达可能增强K562细胞的增殖能力和IM耐药能力,为进一...     

DLL4基因对白血病细胞株K562细胞中YY1和c-Myc蛋白表达及细胞增殖的影响

本研究旨在探讨Notch的配体DLL4基因在白血病细胞株K562中对转录因子YY1和原癌基因c-Myc蛋白表达及细胞生长的影响。实验分正常对照组、阴性对照组(转染质粒pBudCE4.1)和实验组(转染质粒pBudCE4.1-DLL4)。转染后48小时,用免疫印迹法和免疫细胞化学法检测外源性DLL4瞬时转染表达水平及YY1和c-Myc蛋白的表达水平;用细胞计数试剂盒-8法检测各组细胞的增殖;转染后48小时用流式细胞仪检测各组细胞的周期分布和凋亡。结果表明,在各组K562细胞中均检测到DLL4、YY1和c-Myc蛋白的表达,实验组的DLL4、YY1和c-Myc蛋白表达量比两个对照组显著增多(p<0.05);实验组K562细胞的生长速度明显低于对照组;实验组较对照组G0/G1期细胞增多(p<0.001),凋亡率增加(p<0.001)。结论:DLL4基因能增加细胞转录因子YY1和原癌基因c-Myc蛋白的表达,诱导细胞生长速度减慢、细胞周期停滞于G0/G1期,并能增高凋亡率增加。     

SCL/TAL-1基因沉默对EPO诱导的K562细胞红系分化的影响

目的 通过RNA干扰技术降低SCL/TAL-1 mRNA的表达,探讨SCL/TAL-1在K562细胞红系分化中的作用.方法 以EPO诱导白血病细胞系K562细胞向红系分化为模型,将靶向SCL/TAL-1基因的特异性短发夹RNA(shRNA)慢病毒质粒pTRIP-dU3- RNAiTALh-EF1a-GFP转染K562细胞,RT-PCR检测其SCL/TAL-1和红系相关基因RhD、血型糖蛋白A(GPA,即CD253a)、CD47 mRNA表达水平变化,流式细胞术分析红系分化抗原CD71、CD253a的表达,并以空载体质粒pTRIP-dU3- RNAiluc-EF1-GFP转染的K652细胞为对照.结果 ①通过慢病毒转染系统将含SCL/TAL-1 shRNA的质粒及空载体质粒转染K562细胞48 h,绿色荧光蛋白(GFP)+细胞占总细胞的95%以上,表明感染率达到95%以上.②RT-PCR结果显示转染特异性shRNA的K562细胞SCL/TAL-1 mRNA表达水平比空载体对照明显下调(P<0.05),红系抗原CD47和RhD mRNA水平也比对照组明显下调(P<0.05),GPA有所下降,但没有CD47和RhD下降程度大.③流式细胞术检测到SCL/TAL-1低表达组红系分化抗原CD71、CD235a表达降低,表达率分别是10.4%、76.5%,而在对照组的表达率分别为94.3%、83.6%.结论 研究结果提示转录因子SCL/ TAL-1参与了红系定向分化.     

转染p21WAF1基因对K562白血病细胞系增殖的抑制作用

为了探讨p21WAF1基因对白血病细胞增殖的影响,构建了p21WAF1的逆转录病毒表达载体,通过FuGENETM6介导体外转染p21WAF1表达缺如的K562细胞。经筛选得到G418抗性K562细胞系,用RT-PCR和Western印迹检测到外源p21WAF1的表达,用活细胞计数观察细胞增殖情况,同时进行流式细胞术和软琼脂集落形成实验,结果表明,K562-p21WAF1的表达,用活细胞计数观察细胞增殖情况,同时进行流式细胞术和软琼脂集落形成实验,结果表明,K562-p21WAF1中可检测到P21WAF1蛋白及mRNA表达,细胞增殖明显减慢,G0G1期细胞数增多,细胞在软琼脂中的集落形成能力下降,以上结果表明,p21WAF1基因可抑制p21WAF1表达阴性的白血病细胞增殖,可能成为白血病基因治疗的靶基因。     

靶向沉默Gli1基因表达对K562细胞增殖的影响及其机制探讨

目的 探讨靶向沉默Sonic hedgehog(Shh)信号通路的转录因子Gli1基因表达对K562细胞增殖的影响及其机制.方法 将针对Gli1的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)通过脂质体(LipofectamineTM 2000)导入K562细胞作为实验组,并以非特异性siRNA为对照组.实时定量PCR和Western blot法检测Gli1 mRNA和蛋白表达,MTT检测细胞增殖,碘化丙锭(PI)检测细胞周期,实时定量PCR检测c-myc、p21基因的表达变化.结果 转染后24 h实验组Gli1 mRNA表达水平为对照组的(52.60±3.57)%(P<0.01),转染后48 h实验组Gli1的蛋白表达水平为对照组的 (79.31±5.58)% (P<0.01).转染后24 h实验组细胞增殖率为对照组的 (94.41±3.58)% (P<0.05),48 h为对照组的(90.22 ±3.34)% (P<0.01).转染后24、48 h 实验组细胞出现G2/M期阻滞且c-myc的表达水平下降,而p21的表达水平升高 (P值均<0.05).结论 靶向沉默Gli1基因表达抑制了K562细胞的增殖,该抑制作用是通过下调c-myc基因、上调p21基因的表达实现的.     

PLK1基因缄默在K562细胞凋亡中的作用

目的观察缄默PLK1基因的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对K562细胞内PLK1表达和细胞凋亡的影响,探讨PLK1在白血病发病中的作用,寻找更为有效的白血病治疗途径。方法设计合成针对PLK1基因1416~1436位点的shRNA片段,并将其克隆于绿色荧光蛋白的表达载体pEGFP-H1中,命名为pEGFP-H1/PLK1。通过电穿孔转染法将其导入K562细胞中,分为对照组、pEGFP-H1空载体转染组和pEGFP-H1/PLK1shRNA重组质粒转染组,转染后24,48h,分别通过RT-PCR和Western blot检测各组细胞PLK1基因和蛋白水平的变化,以MTT方法测各组细胞的增殖活性,比色法检测各组细胞的半胱天冬酶3(caspase-3)蛋白酶活性,并通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡和G2/M期转变情况。结果PLK1mRNA相对水平(与内参的灰度比值)对照组为1.25±0.07,空载体转染24,48h组分别为1.21±0.08和1.23±0.09,shRNA重组质粒转染24,48h组分别为0.52±0.04和0.25±0.02,shRNA重组质粒转染组较其他两组明显降低(P<0.01)。各组细胞PLK1的蛋白水平变化趋势与PLK1mRNA表达相似。相应地,对照组、空载体转染48h组、shRNA重组质粒转染24,48h组的凋亡率分别为(8.3±0.6)%、(8.7±0.7)%、(49.7±3.8)%和(82.3±6.9)%,后两者与前两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。此外,与对照组和空载体转染组相比,shRNA重组质粒转染组的细胞增殖能力明显下降(P<0.05),且位于G2/M期的细胞较对照组和空载体转染组显著增加。以上结果均于转染后48h时较明显(P<0.05)。结论构建的shRNA能明显抑制转染细胞PLK1的表达和增殖,并可促进转染细胞的凋亡,并使停留于G2/M期的细胞显著增加。     

白血病细胞株K562和SHI-1糖基转移酶表达的差异

目的 探讨白血病细胞株K562与SHI-1糖基转移酶表达的差异。方法应用RT-PCR法研究白血病细胞株K562与Sill-1糖基转移酶mRNA表达的差异。结果K562和SHI-1细胞株均表达0GnT、βGnT1、β3GnT5、βGalT2，但表达量不同。K562细胞株主要表达ppGalNacT2、T4、T5、T7，但表达量有差异，而SHI-1细胞株ppGalNacT1、T2、T3、T4均有表达但表达量亦有不同。     

苦参碱对K562细胞Cgi-100基因表达和细胞增殖的影响

本研究了解功能未知的cgi-100基因在苦参碱作用人白血病K562细胞中的表达情况，并探讨其对K562细胞生长的影响。应用RT—PCR检测苦参碱作用前后K562细胞中cgi-100基因的表达情况；构建pIRES2-EGFP／cgi-100真核表达质粒，用脂质体法转染至K562细胞中；RT—PCR检测在重组细胞中目的基因cgi-100的表达状况，并采用台盼蓝染色法观察细胞生长趋势，电镜观察细胞形态学改变，流式细胞术检测细胞周期的变化，观察cgi-100基因过表达对K562细胞增殖的影响。结果表明，在苦参碱作用K562细胞后cgi-100基因表达下调；重组K562细胞中cgi-100基因过表达，且常染色质增加，异染色质减少，细胞增殖旺盛，S期细胞增多，增殖速度高于对照组。结论：不同浓度不同作用时间下苦参碱能使K562细胞中cgi-100基因表达下降；cgi-100基因过表达能使K562细胞增殖加速、细胞幼稚程度增加。     

特异性抑制Aqp1基因对K562细胞生长的抑制作用

本研究探讨靶向aqp1(aquaporin 1)基因的siRNA对K562细胞生长的抑制作用。设计siRNA,转染K562细胞,在相差显微镜观察细胞形态变化;用MTT法观察aqp1-siRNA对K562细胞活力的影响;使用流式细胞仪、DNA片段化分析K562细胞凋亡;用RT-PCR半定量检测转染前后aqp1基因表达。结果表明:苏木素-伊红染色后,细胞呈现明显的凋亡形态;转染24小时后aqp1-siRNAs对K562细胞的活性有显著抑制作用;aqp1-siRNA转染K562细胞后可见明显的凋亡峰,24、48和72小时的细胞凋亡率持续上升,分别为24.2%、36.1%和42.9%;48小时后aqp1-siRNA组出现明显的DNA凋亡"梯形电泳带";aqp1基因的表达水平在aqp1-siRNA转染后24、48和72小时,分别减少了33%、46%和57%。结论:aqp1-siRNA能够抑制K562细胞的增殖,诱导其凋亡,可作为治疗恶性肿瘤的新靶点。     

人骨髓间充质干细胞对K562细胞增殖和化疗敏感性的影响

本研究比较K562细胞与正常人骨髓间充质干细胞（MSC）黏附培养前后细胞增殖、化疗敏感性及MDR1变化，以寻找白血病耐药与造血微环境的关系。对悬浮培养和与MSC黏附培养的K562细胞绘制细胞生长曲线；用流式细胞术测定细胞周期并观察化学药物对细胞存活率和凋亡的影响；用RT-PCR技术检测MDR1基因表达。结果表明：与悬浮培养比较，黏附培养K562细胞增殖受抑，G0／G1期细胞比例增加（P〈0．05），S期细胞比例下降（P〈0．05），G2／M期细胞比例增加（P〈0．01）。在柔红霉素（DNR）诱导的凋亡中，黏附培养组K562细胞凋亡受阻（P〈0．05）。黏附培养未诱导K562细胞MDR1基因表达，也未使K562／ADM细胞的MDR1基因表达发生改变。结论：K562细胞与MSC黏附接触共培养，可导致K562细胞生长抑制，并产生化疗耐药，其机制可能与MDR1无关。     

PLK1基因沉默对K562/A02细胞周期、增殖和耐药性的影响

为了探讨小干扰RNA(siRNA)对K562/A02细胞Polo样激酶1(PLK1)基因的抑制作用及其对细胞周期、细胞增殖和耐药性的影响,将构建的针对PLK1mRNA的siRNA真核质粒,导入K562/A02细胞,用RT-PCR和Western-blot方法分析PLK1基因在转染前后的表达差异;台盼蓝拒染试验检测细胞存活率;流式细胞术(FACS)检测细胞周期和细胞内阿霉素(ADM)的积累量;MTT试验检测细胞对ADM的药物敏感性。结果显示,与对照组相比,转染24和48小时后,siRNA-PLK1质粒转染组的PLK1mRNA下降(34.7±2.1)%和(56.6±1.5)%,蛋白水平下降(49.9±3.2)%和(62.1±1.7)%;转染24和48小时后,细胞存活率下降了30%和59%;转染48小时后,G2/M期细胞比例提高了2.77倍,同时细胞内ADM积累量显著提高;对ADM药物敏感性的相对率为73.8%。结论:PLK1基因沉默能有效抑制K562/A02细胞生长,使细胞周期停滞在G2/M期,同时使得细胞内ADM积累量提高,对ADM敏感性增强。     

整合蛋白β1在藻蓝蛋白抑制白血病细胞系K562细胞增殖中的作用

本研究观察不同浓度藻蓝蛋白（phycocyanin）对K562细胞增殖的影响，并检测藻蓝蛋白处理后细胞表面整合蛋白β1表达和胞内黏着斑激酶（FAK）基因表达的变化，探讨整合蛋白β1在藻蓝蛋白抑制K562细胞增殖中的可能作用机制。用流式细胞术（FCM）检测藻蓝蛋白处理前后K562细胞表面整合蛋白β1表达变化；MTT法测定不同浓度藻蓝蛋白对K562细胞增殖的影响；RT—PCR检测不同浓度藻蓝蛋白对K562细胞内FAK基因表达的作用。结果表明：整合蛋白β1在K562细胞上高表达；藻蓝蛋白不能改变其表达量。不同浓度藻蓝蛋白对K562细胞的增殖均有抑制作用。藻蓝蛋白可上调胞内FAK的基因表达水平，恢复整合蛋白β1介导的细胞增殖抑制信号。结论：藻蓝蛋白可能通过增强细胞基质与K562细胞表面的整合蛋白β1结合，上调K562细胞内FAK基因表达水平，恢复整合蛋白β1介导的细胞增殖抑制信号而发挥抑制K562细胞增殖的作用。     

siRNA对K562细胞株bcr-abl融合基因表达的抑制

为了探索CML的治疗新思路研究了siRNA(small interfering RNA)对K562细胞株bcr-abl融合基因表达的抑制作用。制备特异性对应bcr-abl融合基因的siRNA，转染K562细胞株，采用RT-PCR法测定bcr-abl融合基因mRNA的表达。结果表明：siRNA对bcr-abl基因表达的抑制作用随浓度的增加而增强，0.2ug siRNA能使bcr-abl融合基因mRNA的表达在24和48小时分别降低至对照组的19.9％和26.6％，但72小时时恢复到原水平，同时转染siRNA后细胞生长受到抑制。结论：siRNA可以有效的抑制K562细胞株中bcr-abl融合基因的表达。     

逆转录病毒载体介导PIG—A基因在突变型K562细胞中的表达

目的应用逆转录病毒载体将PIG-A cDNA转导至突变型K562细胞中,观察是否能够逆转K562细胞CD59的表达。方法采用PCR方法从质粒pEBPIG-A中扩增PIG-A基因片断,BamH I及Xho I双胁切后连接至逆转录病毒载体pLEGFP-C1相应位点。脂质体法转染PA317包装细胞,收集病毒上清感染突变型K562细胞,流式细胞仪测定感染前后CD59的表达情况。结果重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后,24～48h荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。G418筛选后,病毒滴度测定达(1．6±0．2)×10~4CFU/mL。感染K562细胞前后测定CD59的表达率分别为4．5％±0．7％及21．3％±0．3％(P＜0．01)。结论成功构建了PIG-A基因逆转录病毒载体,感染突变型K562细胞后可以提高其CD59的表达。