下一代测序技术在分子诊断中的应用

DNA测序是破译人类疾病的一种强大技术,尤其在癌症方面。飞速发展的下一代测序(next-generation sequencing,NGS)极大降低了测序成本,并且实现了高通量,这使我们可以获得整个基因组的序列,以及那些临床上确诊病人的全部基因组信息。然而下一代测序技术带来诸多益处的同时也带来了挑战,那就是怎样使这个技术在临床诊断中成为常规手段。本文就目前NGS的几大技术平台原理,在临床诊断中的应用,以及目前面临的挑战等进行综述。     

DNA测序技术与仪器的发展

由于分子生物学近年来的迅速发展,很多临床实验室开展了分子诊断实验项目。虽然目前由于操作复杂和高昂成本的原因,DNA测序技术尚没有大规模走进临床实验室,但是在众多分子诊断方法中,DNA序列测定和分析无疑是最权威的金标准。DNA测序技术在这几十年来从手工到自动化,从复杂到简单,但是近几年的高通量测序技术使之重新复杂起来,本文将介绍一下DNA测序技术与仪器的历史沿革与最新进展。     

宏基因二代测序技术对厌氧菌感染精准化诊断的临床价值

目的探讨宏基因二代测序技术对厌氧菌感染精准化诊断的临床价值。方法回顾性分析2017年2月-2019年2月复旦大学附属中山医院感染病科收治的16例临床诊断为厌氧菌感染患者的资料。描述其临床特点、比较宏基因二代测序与培养检测外周血、组织匀浆、脓液、灌洗液及无菌体液等标本厌氧菌的阳性率与时间,以阐明宏基因二代基因技术在厌氧菌诊断方面的优势。结果符合入组条件的厌氧菌感染患者共16例。厌氧菌感染部位包括:肺部(8例)、皮肤软组织(2例)、腹腔(1例)、混合部位感染(5例)。同时送厌氧菌培养及宏基因二代测序的微生物标本共29份,标本类型包括:外周血(3份)、组织匀浆(5份)、脓液(11份)、灌洗液(8份)和无菌部位体液(2份)。培养阳性率为20.67%(6/29),宏基因二代测序的阳性率为82.76%(24/29),后者高于前者(P<0.01)。按感染部位分层,肺部感染的标本中宏基因二代测序病原体检出的阳性率为71.43%(10/14)高于培养阳性率7.14%(1/14)(P<0.01);按标本类型分层,发现两种方法检测组织匀浆、脓液和灌洗液时宏基因二代测序的阳性率分别为80.00%(4/5)、100.00%(11/11)和62.50%(5/8),均高于培养阳性率(P<0.05)。二代测序的平均检测时间为(39.66±15.09)h短与培养(81.21±37.94)h(P<0.01)。结论宏基因二代测序技术对厌氧菌感染的病原体评估较培养更敏感、更快捷,在厌氧菌感染的精准化诊断方面具有优势。     

感染性病原体二代测序技术研究进展

感染性疾病是全球人口发病及死亡的主要原因,病原学快速精准鉴定是其控制、预防的基础。传统病原学检测技术成熟、阳性预测价值高,然而却面临着病原谱窄、阳性率低、精确度低、检测周期长等局限性,常导致疾病治疗延误及抗菌药物滥用。二代测序技术(NGS)以其高通量、覆盖度广、精确度高等优势,成功应用于疑难危重感染性疾病诊治以及未知病原体鉴定、耐药基因监测、流行病学追踪调查等方面。NGS作为病原学鉴定的一种新技术,表现出巨大潜力,然而目前临床感染工作者认知及接受程度各异,本文通过综述NGS的基本原理、发展历程以及在感染性疾病病原体鉴定中的典型案例及其优势,反思其技术尚存在的挑战,使广大医疗工作者充分了解NGS作为感染性疾病诊断工具的作用及其局限性;同时提出NGS未来技术的发展方向,以期在感染性疾病的诊治中发挥更大的优势。     

二代测序技术在肺腺癌相关基因突变状态检测中的应用

目的 探讨二代测序技术在肺腺癌相关基因突变状态检测中的应用效果,以期为临床诊断、预后和治疗提供参考价。方法 回顾性分析2019年12月—2021年3月本院收治的45例肺腺癌患者临床资料,45例患者均通过二代测序技术检测肺腺癌9种常见相关驱动基因(EGFR、MET、KRAS、HER2、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1、RET),分析基因检测结果。结果 45例患者中肺腺癌相关基因变异38例,其中组织检测变异占比82.05%(32/39),外周血检测变异占比44.44%(4/9),胸水检测变异占比50.00%(2/4);肺腺癌常见基因改变54个,平均1.20个; 39例初治患者共发现基因改变45个,平均1.15个; 6例治疗后(含放化疗及靶向治疗)患者共发现基因改变9个,平均1.50个; EGFR基因变异阳性率最高(48.15%),其次为MET(16.67%)和KRAS(11.11%)。结论 二代测序技术可作为分析肺腺癌基因突变的检测手段,EGFR突变频率较高,对肺腺癌的临床诊疗具有一定的指导意义。     

二代测序技术在重症社区获得性肺炎诊断中的意义

 

目的 探讨基于宏基因组学的二代测序（mNGS）技术在重症社区获得性肺炎（CAP）病原学诊断中的意义,为合理应用该技术提供依据。方法 回顾某单位成功救治的3例重症CAP患者临床资料,分析mNGS在其病原学诊断中的作用,结合文献和自身经验,总结合理应用该技术的经验和步骤。结果 3例初始治疗失败的急危重症CAP患者留取其支气管肺泡灌洗液行mNGS,结果提示3例患者分别为链球菌、腺病毒7型、鹦鹉热衣原体感染。依据mNGS结果相应调整治疗方案,患者症状迅速改善,治疗效果确切,预后好。结论 mNGS技术在重症 CAP的病原学快速诊断中具有重要意义,但同时也要正确认识其局限性,做到合理应用。

     

基于宏基因二代测序技术检测呼吸道病毒的临床应用

目的探讨基于宏基因二代测序技术检测呼吸道病毒的临床应用价值。方法采用随机扩增法、脱氧核糖核酸纳米球、华大基因公司BGI-500测序平台及BWA算法为基础的比对法等技术进行呼吸道痰液标本病毒核酸提取物的二代测序分析,以痰标本中病毒序列数100为入选标准,分析检出病毒的类型、序列数及丰度值等参数。结果根据入选标准,共收集到9例患者,其中77.78%(7/9)的患者合并存在免疫受损因素,如心外科术后、激素治疗、恶性肿瘤、HIV感染等,分别检测出不同病毒的核酸阳性结果如下:4例爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、2例单纯疱疹病毒1型(HSV1)、1例巨细胞病毒(CMV)、1例人博卡病毒、1例腺病毒D型,另外,部分标本中合并检出细环病毒、猪内源性病毒E。Pearson相关性分析表明,在各项测序参数中,RPKM参数(每100万个序列每100bp碱基对,匹配上的序列数)与患者氧分压指标存在线性相关。结论呼吸道病毒感染多发生在合并免疫抑制因素的宿主,检出病毒类型包括EBV病毒、HSV1病毒、CMV病毒等,且部分患者可同时检出细环病毒、猪内源性病毒E。另外,RPKM可能与肺部病变严重程度有关,提示RPKM可能对于预测肺内病灶严重程度有一定意义。     

感染性疾病病原体二代测序应用进展

感染性疾病是对人类健康危害极大的一类疾病,经典的病原菌培养及分子生物学方法耗时长,准确率低。随着二代测序(NGS)的飞速发展,在感染性疾病病原学诊断方面应用价值逐步体现,尤其对于未知病原体、难于体外培养病原体及新发病原体,与传统方法相比,NGS通量大、精准度高、信息量丰富,可在短时间内对基因进行精准定位,从而使感染性疾病得到进一步诊治。本文通过对NGS在病原体鉴定、毒力分析、耐药性相关基因解读和功能预测、医院感染暴发的调查、防控中的作用进行综述,同时分析了在感染性疾病中的研究进展。希望随着NGS技术的提高,实现精准的抗菌药物靶向治疗。     

全基因组测序技术在结核病分子流行病学中的应用进展

结核病给全球带来了严重的疾病负担,防控结核病具有重要意义.结核病分子流行病学将结核分枝杆菌分型技术与流行病学资料相整合,在研究结核病的传播和流行特点中起到了极其重要的作用.全基因组测序能够构建生物体基因组的完整DNA序列,具有高分辨率、高通量、结果精确等优势,在结核病分子流行病学研究中非常有吸引力和发展潜力.比较全基因...     

测序技术在无创产前筛查中的应用及进展

测序技术是现代分子生物学研究中的重要技术,1977年桑格测序技术（一代测序技术）出现。30年后,二代测序技术也应用于科研及临床;近年国外出现了以单分子测序为特点的第三代测序技术。测序技术促进了无创产前筛查技术的进步。相对于传统的羊膜腔穿刺术和绒毛活检,高通量测序技术通过对妊娠妇女血浆中胎儿游离DNA进行测序而获得胎儿的染色体信息,避免直接接触和伤害生长中的胎儿。研究人员利用大规模并行测序技术发现无创产前筛查技术相对于标准筛查技术拥有较高敏感度和特异度。多国卫生机构相继公布了产前检测的指导意见。2013年,单细胞测序开始应用于产前辅助生殖技术的临床试验。国内外通过对单个卵细胞的测序有望大幅度提高辅助生殖的活产率。高通量测序技术在产前诊断领域具有广阔的应用前景。     

环境内毒素相关新基因的克隆测序及生物信息学分析

目的克隆表达环境内毒素相关新基因--人lrg基因(简称Hlrg),并进行生物信息学分析.方法采用RTPCR扩增Hlrg基因,对扩增产物进行序列的测定,利用Internet和GenBank数据库对测序结果正确的Hlrg基因进行生物信息学分析.结果克隆表达了Hlrg基因,测序结果正确;生物信息学分析表明,该序列编码186个氨基酸,GenBank中不含有同源序列.预测相对分子量为21×103,该序列包含有亮氨酸拉链结构,可能具有重要的功能.结论成功扩增、克隆表达了Hlrg基因,对其功能进行了初步预测,为进一步的功能研究打下基础.     

下一代测序技术在遗传相关性智力障碍诊断中的应用

智力障碍(intellectual disability,ID),是一种严重危害儿童身心健康的综合症,不但影响患者自身的生活质量,也给其家庭和社会带来沉重负担。ID病因十分复杂,既有外在的环境因素又有内在的遗传因素。近年来,下一代测序技术(next-generation sequencing,NGS)从一种新兴技术变成了主流检测技术被逐渐应用于临床诊断,其通量高、快速、高效等优势为遗传性疾病的诊断研究带来重大变革。本文将从智力障碍概述、病因分析、遗传性检测技术以及NGS在遗传性智力障碍诊断中的应用4个方面进行综述,以期为相关性智力障碍病人的临床诊断方法的选择提供帮助。     

萍乡地区一种新型肝炎病毒（TTV）检测及核苷酸序列分析

为了解萍乡地区肝炎病毒在人群中感染分布状况,分析肝病病毒株基因特点,采用ＰＣＲ方法检测血清标本中ＴＴＶ－ＤＮＡ,针对ＴＴＶ－ＤＮＡ阳性标本进行了序列测定。分析其基因变化情况,结果显示在９０例就诊血清标本中,ＴＴＶ－ＤＮＡ阳性率为３３．３％,ＡＬＴ增高３９例病人中,ＴＴＶ－ＤＮＡ阳性率为４３．６％,ＡＬＴ正常４６例中,ＴＴＶ－ＤＮＡ的阳性率为１９．６％,２８例献血员中,ＴＴＶ－ＤＮＡ阳性率为２５％。     

诺如病毒核酸检测及病毒基因序列分析

〔目的〕通过对国境口岸输入性感染性腹泻暴发病例的快速检测、排查和病原基因序列分析,为病人的诊断、治疗和口岸突发疫情的处置提供依据,保障国境口岸的卫生安全。〔方法〕利用分子生物学技术,通过粪便样本的核酸(RNA)提取、聚合酶链反应(RT-PCR)、凝胶电泳分析以及基因序列测定、基因序列分析等过程,对造成群体腹泻的病原种类进行确认。〔结果〕9份送检的腹泻病人粪便样本中均检测到诺如病毒特异性核酸片段。经基因序列分析,确认检测到的诺如病毒基因型属基因组Ⅰ(GⅠ)。确认造成马耳他籍船舶"蓝海探索"号暴发腹泻病例的病原为诺如病毒。〔结论〕通过核酸检测等技术手段,可快速确认传染病病原种类,为疫情控制、保障国境口岸的卫生安全提供技术支持。     

胚胎植入前遗传学筛查的临床应用

随着辅助生殖技术和遗传学分析技术的发展,胚胎植入前遗传学筛查应用于胚胎染色体数目异常（非整倍体）检测,以期改善体外受精-胚胎移植的妊娠结局。新方法、新技术不断出现并应用于胚胎植入前遗传学筛查中,如囊胚期活检、比较基因组杂交技术、微阵列技术、第二代测序技术等,显著增加了诊断准确性,减少误诊风险。同时,胚胎植入前遗传学筛查的广泛应用也面临许多挑战。综述该领域的应用进展和面临的挑战。     

Diagnostic tests for infectious diseases in the developing world: two sides of the coin

Effective and affordable diagnostics are crucial for health improvement in developing countries but are not accessible to those who need them most. Recent interest highlights innovative technological approaches for overcoming the problem, but these must be balanced by the efforts and research needed to ensure effective implementation in the context of often fragile health systems in low-income countries in the developing world.     

基于VP4基因扩增和序列测定快速检测鉴别人肠道病毒的研究

目的建立基于小核糖核酸(RNA)病毒结构蛋白HVP4基因序列测定,对人肠道病毒(HEV)进行快速检测和分型的分子生物学方法。方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对2004年321例急性弛缓性麻痹(AFP)病例粪便标本进行病毒核酸提取和扩增VP4基因,然后对扩增产物测序,通过序列的分析鉴定病毒型别。结果321份AFP病例粪便标本上清液,共检出阳性134份。获得VP4有效序列54条,其中37例RD、L20B细胞培养未检出的样本,检出HEV10例,脊髓灰质炎病毒(PV)5例,柯萨奇病毒(CV)9例,人鼻病毒(HRV)12例,埃可病毒(ECV)1例;9例细胞培养为其它HEV的样本,检出CV5例,EV2例,HRV2例;RD、L20B细胞培养结果6例与VP4测序结果相符。结论应用VP4序列测定对HEV进行快速诊断和分型是一种快速简单的分子生物学方法,可用于HEV感染引起的爆发疫情的病原学诊断。     

上皮性卵巢癌的病理及分子诊断

上皮性卵巢癌(EOC)就其病理学特征而言,可被分为Ⅰ、Ⅱ型EOC,二者在肿瘤来源、恶性表型方面均有所不同。Ⅰ、Ⅱ型EOC在病理学形态、临床特征、分子表型等方面,均体现出极高的异质性特点。随着二代基因测序技术对EOC分子特征数据的积累,深化了临床对EOC生物学行为的认识。综合病理及分子特征进行诊断,可能为EOC提供更加高效、精准的筛查和治疗策略。笔者拟就EOC的病理及分子诊断机制,分子诊断技术的发展现状,以及在EOC筛查和治疗应用中的最新研究进展进行阐述。