柯萨奇B组病毒IgM抗体特性研究

目的 研究柯萨奇B组病毒（CVB）感染后患者急性期CVB－IgM抗体的反应特性。方法 对临床确诊为CVB感染的患者急性期血清用免疫印迹法检测CVB－IgM抗体。结果 患者的急性期血清IgM抗体均仅针对CVB的VP1抗原反应。经ELISA与免疫印迹方法的比较表明：用免疫印迹法检测的CVB－IgM抗体可对CVB各型病毒抗原反应,具有CVB各型病毒之间的交 叉反应性。而同时,在16例ELISA检测反应阴性的健康人血清中未见有CVB的VP1特异性的IgM抗体存在。结论 临床感染CVB的患者急性期,其血清中的特异性的IgM抗体是针对CVB的VP1抗原,而且,此类抗体对各型的CVB抗原具有交叉反应性。     

柯萨奇病毒B 组5 型VP1 蛋白的外源表达及多克隆抗体的制备

目的:原核表达柯萨奇病毒B组5型的VP1蛋白,并制备其多克隆抗体及检测。方法:提取在Vero细胞中柯萨奇病毒B组5型的RNA,通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增获取VP1基因序列,构建原核表达载体,大量诱导表达重组VP1蛋白。用His Trap HP亲和层析柱纯化重组蛋白,以纯化的目的蛋白为抗原,免疫雄性SD大鼠获得VP1蛋白多克隆抗体血清,ELISA测定该抗体的效价,微量中和实验测定抗体的中和活性,Western blot检测抗体的特异性,免疫组化检测抗体对组织中抗原的识别。结果:成功构建了VP1-pET-28a重组载体,并且在BL21细胞中成功诱导表达,亲和层析柱纯化后蛋白纯度大于90%。ELISA测得抗体的效价为1∶128 000,微量中和实验显示抗体没有中和活性,Western blot分析显示抗体能与CVA16和EV71交叉反应,免疫组化实验表明抗体能够识别组织中的CVB5抗原。结论:本研究成功制备了CVB5 VP1蛋白的高效价的多克隆抗体,为CVB5病毒疫苗和病毒诊断的研发提供了有效的工具。     

CVB3-VP1 siRNA对CVB3复制的抑制作用

目的：观察柯萨奇B组病毒3型衣壳蛋白1（CVB3-VP1）特征性小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）对CVB3复制及VP1蛋白表达的抑制作用.方法：根据CVB3VP1基因的序列及其结构特征,设计并用化学方法合成小于扰RNA（siRNA）.以CVB3感染HeLa细胞,通过脂质体介导以siRNA转染HeLa细胞.48 h后,观察细胞病变的程度,用TCID5o法测定病毒滴度,免疫荧光法测定CVB3-VP1蛋白的表达,RT-PCR法检测CVB3-RNA的水平.结果：化学合成的4对针对CVB3-VP1的siRNA,发现其中有两对（VP1-1、VP1-2）对CVB3的复制具有明显的抑制作用,同时VP1蛋白的表达明显减少;细胞病变的程度也明显减轻.结论：CVB3-VP1siRNA可有效地抑制CVB3在HeLa细胞中的复制及表达VP1.     

人IL-2信号肽基因增强柯萨奇病毒B3型VP1 DNA疫苗诱导的中和抗体应答

目的将人白细胞介素2(hIL-2)信号肽基因与柯萨奇病毒B组3型(CWB3)的VP1基因融合，构建分泌型VP1真核表达质粒pcDNA3／sVP1；免疫小鼠后，通过测定血清特异性中和抗体效价及对致死量CVB3攻击的保护作用，评价疫苗的免疫效果。方法采用重叠区基因扩增法，将hIL-2信号肽基因连同其下游11个氨基酸残基的基因与CVB3 VP1基因拼接，获得分泌型VP1(sVP1)的基因；将sVP1基因克隆至真核表达载体pcDNA3，构建分泌型VP1真核表达质粒pcDNA3／sVP1；肌注免疫小鼠，测定血清中CVB3特异性中和抗体的效价；第3次免疫后2周，腹腔内注射1000TCID50的CVB3，观察小鼠生存情况。结果成功构建了分泌型VP1真核表达质粒pcDNA3／sVP1，插入的sVP1基因中含有hIL-2信号肽及其下游11个氨基酸残基的基因以及VP1基因；pcDNA3／sVP1可比对照质粒pcDNA3／VP1诱导小鼠产生更高水平的中和抗体。结论hIL-2信号肽基因增强了柯萨奇病毒B3型VP1 DNA疫苗诱导的中和抗体应答，为进一步研制高效的CVB3 DNA疫苗提供了实验基础。     

柯萨奇B组3型病毒中国分离株VP4、3D基因序列及系统发生树分析

目的研究柯萨奇B组3型病毒（CVB3）中国分离株结构蛋白VP4、非结构蛋白3D基因序列及变异性。方法在HeLa细胞中增殖病毒，用RT-PCR扩增目的基因片段，与pMDl8-T载体连接，PCR初步鉴定后测序，进行序列同源性及系统发生分析。结果CVB3中国分离株VP4基因含207个碱基，编码69个氨基酸，与Nancy株氨基酸同源性为97．10％；3D基因含1386个碱基，编码462个氨基酸，与Nancy株氨基酸同源性为97．62％。在系统发生中，CVB3中国株VP4基因、3D基因均与Nancy株聚簇。结论CVB3中国分离株VP4和3D基因长度与Nancy株一致，进化上属同一分支。     

CVB3腺病毒载体疫苗Ad/VP1的构建及免疫效果研究

 目的 构建柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3,CVB3)VP1基因重组腺病毒疫苗Ad/VP1,并观察其对小鼠的免疫效果。方法 利用AdEasy-1系统构建、包装重组腺病毒Ad/VP1,并检测目的蛋白的表达。BALB/c小鼠随机分为Ad/VP1、Ad和PBS 3组,肌肉注射免疫,共免疫2次,每次间隔16d。用ELISA法和微量中和试验法分别检测血清CVB3 VP1 IgG和中和抗体滴度;CCK-8法检测特异性CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击小鼠后,检测血中病毒滴度并观察小鼠的存活率。结果 成功构建、包装了重组腺病毒Ad/VP1,并在293细胞中检测到VP1蛋白的表达。免疫小鼠后,Ad/VP1组血清CVB3 VP1 IgG滴度、中和抗体水平明显高于PBS和Ad对照组(P<0.01),CTL杀伤活性和对小鼠的保护率也高于对照组(P<0.05),血清病毒滴度低于两对照组(P<0.05)。结论 重组腺病毒疫苗Ad/VP1能显著提高小鼠的细胞和体液免疫应答及免疫保护作用。     

应用合成肽研究柯萨奇B病毒衣壳蛋白VP1的共同抗原表位

对柯萨奇B4病毒(CVB4)衣壳蛋白VPl保守区的亲水性和二级结构进行分析和预测,选择可能代表优势抗原表位的肽段进行合成(VPl-l肽,RIYF KPKHVK AYV),并截取了该肽段的前12个残基(VPI-2肽)用同样方法进行合成.用VP1-1肽免疫家兔制备出高效价抗体,应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测,这些抗体与CVBI-6病毒均有结合反应,VP1-1肽与型特异性CVB1-6抗体均有良好的结合反应,表明VP1-1肽是CVB的共同抗原表位.用VP1-1肽检测心肌炎患者血清CVBIgM抗体,阳性率在40%左右.     

免疫途径和佐剂对CVB3VP1蛋白免疫效果的影响

目的:观察不同免疫途径和佐剂类型对柯萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus group B type 3,CVB3)衣壳蛋白VP1免疫效果的影响.方法:将原核表达质粒pET-his/VP1转入E.coli BL21 (DE3) pLysS中,用异丙基-1-硫代-β呋喃半乳糖苷(IPTG)诱导CVB3VP1蛋白的表达并进行纯化.首先采用不同的免疫途径(皮下,腹腔,肌肉)用VP1蛋白免疫小鼠,每组12只.然后另取小鼠分为PBS组和不同佐剂组(氢氧化铝、弗氏佐剂、Montanide ISA720),每组18只,采用肌肉注射途径免疫.每次每只小鼠注射50μg,共免疫3次,间隔3周.用ELISA和微量中和试验检测血清特异性IgG抗体和中和抗体.用CCK-8法检测淋巴细胞增殖活性和CTL杀伤活性.用致死量的CVB3攻击后,检测血中病毒的滴度并观察小鼠的存活状况.结果:在大肠杆菌中成功表达CVB3VP1蛋白.三种免疫途径比较,肌肉注射组血清中和抗体和特异性IgG抗体的水平明显高于其他组(P＜0.01).采用肌肉注射免疫时,弗氏佐剂组Montanide ISA 720佐剂组的体液免疫和细胞免疫应答的水平明显高于氢氧化铝组(P＜0.05);但血中病毒的滴度低于氢氧化铝组(P＜0.05).弗氏佐剂组小鼠的生存率好于氢氧化铝组(P＜0.05).结论:采用肌肉注射途径,并联合弗氏佐剂或Montanide ISA 720佐剂可以使CVB3VP1免疫获得较好的免疫效果.     

柯萨奇B3病毒结构和非结构蛋白DNA 疫苗诱导小鼠产生免疫应答的研究

目的 制备4种柯萨奇B3病毒（CVB3）结构和非结构蛋白重组质粒DNA疫苗,并探讨其诱导机体产生体液和细胞免疫应答的效果。方法 用基因重组技术构建4种CVB3结构和非结构蛋白重组质粒,将各重组质粒体外转染真核细胞,用Western blot检测表达产物;于BALB／c小鼠后腿胫骨前肌注射免疫,于0、4、8周共免疫3次,100μg/次。免疫后不同时间检测体液和细胞免疫应答指标。结果 4种重组质粒酶切出相应大小的片段,经测序证实为CVB3序列,Western blot证实能够在体外真核细胞中表达。pcDNA3/vp2、pcDNA3/VP1、pcDNA3/2A和pcDNA3/3D均可诱导小鼠产生相应的特异性抗体、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和淋巴细胞增殖反应、迟发型超敏反应（DTH）,并对致死量的CVB3m、CVB5和CVB2攻击具有保护作用,表现为病毒攻击后第3天血中病毒滴度降低,第10天心肌病理变化比对照组明显减轻,且小鼠生存率显著提高。其中以pcDNA/VP1和pcDNA3／3D组保护作用最明显。结论 CVB3结构蛋白VP1和非结构蛋白3D质粒DNA有可能用作CVB DNA疫苗的候选基因,值得进一步深入研究。     

CVB3-VP1基因免疫诱导特异性抗病毒免疫应答及保护作用

目的 :构建表达柯萨奇病毒B3(CVB3)主要包膜蛋白VP1的基因疫苗 ,并研究该疫苗诱导CVB3特异性免疫应答及免疫保护的作用。方法 :抽提CVB3RNA ,以RT PCR扩增VP1基因 ,克隆于真核表达载体 pcDNA3中 ,构建质粒pcDNA3 VP1。将该质粒转染Hela细胞 ,观察其表达情况 ;以 5 0 μgpcDNA3 VP1质粒DNA肌注免疫BALB/c小鼠 3次 ,检测CVB3特异性体液和细胞免疫应答。间隔 4wk以 5×LD50 的CVB3攻击小鼠 ,观察攻击后小鼠的存活情况。结果 :构建了重组质粒 pcDNA3 VP1,并在体外获得有效表达。以该质粒肌肉免疫BALB/c小鼠 ,可诱生高水平的IgM和IgG ,VP1多肽特异性淋巴细胞增殖反应及CTL活性均显著高于 pcDNA3免疫的对照组。病毒攻击试验表明 ,pcDNA3 VP1免疫组33.3%小鼠可长期存活 ,其心肌组织未见明显的病理学改变 ;而对照小鼠平均仅存活 6 .7d ,心肌显示大量的局灶性坏死和炎性细胞浸润。结论 :pcDNA3 VP1免疫可诱生CVB3特异性体液及细胞免疫应答 ,保护免疫小鼠抵抗CVB3的致死性攻击