急性冠状动脉综合征患者血浆组织因子及组织因子途径抑制物变化及意义

急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)是严重威胁人类健康的心血管急症,包括不稳定型心绞痛(UAP)、急性心肌梗死(AMI)和心源性猝死。目前认为在冠状动脉破裂基础上血栓形成是引起ACS的主要原因。组织因子(tissue factor,TF)是脂质核心内促血栓形成最重要的活性因子     

丹参提取物单体对肿瘤坏死因子诱导内皮细胞组织因子表达的干预作用

背景：目前认为肿瘤坏死因子—α(TNF—α)可诱导人内皮细胞(HUVECs)组织因子基因的表达，而丹参提取物单体(764—3)对其干预作用如何?其机制有待于进一步探讨。目的：研究764-3对TNF—α诱导HUVEs组织因子基因表达的干预作用，及单个内皮细胞内游离钙([Ca^2+]i)水平的影响，以探讨764—3对防止心血管血栓栓塞性疾病的可能机制。设计：随机对照的实验研究。单位：协和医科大学基础医学研究所病理生理学系的实验室。材料：实验于1998-05／1999-09在中国医学科学院，中国协和医科大学基础医学研究所病理生理学系实验室完成。脐带取自北京妇产医院。干预：进行体外培养ECV304细胞株和人脐静脉内皮细胞．采用限制性内切酶法构建含有人TF基因不同上游调控序列的荧光素酶报告基因质粒，经脂质体法转染内皮细胞，用TNF—α(100U／mL)及764-3(30mg／L)处理细胞。主要观察指标：测定细胞裂解物中荧光素酶及β半乳糖苷酶的活性。以Fluo-3／AM为荧光指示剂，用激光共聚焦显像系统观测[Ca^2+]i的改变。结果：在TF基因上游序列-244／+121bp存在下，TNF—α可使转染内皮细胞荧光素酶表达量较对照组明显增加，764-3使这种增加有所降低(P&;lt;0．05)。而-111／+121bp存在时，TNF-α组较对照组荧光素酶表达量无明显差异，均比-244／+121bp存在时明显降低，此时，764-3并未引起荧光素酶表达量明显改变。激光扫描共聚焦显像，TNF-α可引起人内皮细胞[Ca^2+]i持续缓慢升高，加入764-3后[Ca^2+]i迅速大幅度降低，逐渐恢复到基线水平。结论：764-3可抑制TNF-α诱导的HUVECs TF基因表达的增强，这种作用依赖于该基因上游序列-244／+121bp的存在，推测胞内游离钙离子可能参与此抑制作用。     

组织因子途径抑制物活性变化在肝硬化患者中的意义

组织因子途径抑制物 (ＴＦＰＩ)是一种新发现的、在正常生理条件下血液中存在的天然抗凝物质 ,主要作用于依赖组织因子 (ＴＦ)的外源性凝血途径 ,对体内凝血系统有重要调节作用 ,是近年来凝血途径抑制物研究中较为活跃的一个领域。目前国内外研究日益增多 ,有关肝脏疾病ＴＦＰＩ变化的报道存在着不同看法。本文检测一组肝硬化患者血中ＴＦＰＩ活性 ,以探讨其临床意义。1　对象与方法1.1　对象及分组　肝硬化患者 5 1例 ,均为本院住院病人 ,男 33例 ,女 18例 ,平均年龄 5 1.7岁 ,诊断符合 1995年 5月北京第五次全国传染病寄生虫病学术会议讨…     

丹参提取物单体对肿瘤坏死因子诱导内皮细胞组织因子表达的干预作用

背景目前认为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)可诱导人内皮细胞(HUVECs)组织因子基因的表达,而丹参提取物单体(764-3)对其干预作用如何?其机制有待于进一步探讨.目的研究764-3对TNF-α诱导HUVECs组织因子基因表达的干预作用,及单个内皮细胞内游离钙([Ca2+]1)水平的影响,以探讨764-3对防止心血管血栓栓塞性疾病的可能机制.设计随机对照的实验研究.单位协和医科大学基础医学研究所病理生理学系的实验室.材料实验于1998-05/1999-09在中国医学科学院,中国协和医科大学基础医学研究所病理生理学系实验室完成.脐带取自北京妇产医院.干预进行体外培养ECV304细胞株和人脐静脉内皮细胞,采用限制性内切酶法构建含有人TF基因不同上游调控序列的荧光素酶报告基因质粒,经脂质体法转染内皮细胞,用TNF-α(100 U/mL)及764-3(30 mg/L)处理细胞.主要观察指标测定细胞裂解物中荧光素酶及β半乳糖苷酶的活性.以Fluo-3/AM为荧光指示剂,用激光共聚焦显像系统观测[Ca2+]i的改变.结果在TF基因上游序列-244/+121 bp存在下,TNF-α可使转染内皮细胞荧光素酶表达量较对照组明显增加,764-3使这种增加有所降低(P＜0.05).而-111/+121 bp存在时,TNF-α组较对照组荧光素酶表达量无明显差异,均比-244/+121 bp存在时明显降低,此时,764-3并未引起荧光素酶表达量明显改变.激光扫描共聚焦显像,TNF-α可引起人内皮细胞[Ca2+]i持续缓慢升高,加入764-3后[Ca2+]i迅速大幅度降低,逐渐恢复到基线水平.结论764-3可抑制TNF-α诱导的HUVECs TF基因表达的增强,这种作用依赖于该基因上游序列-244/+121 bp的存在,推测胞内游离钙离子可能参与此抑制作用.     

凝血酶对牛主动脉内皮细胞组织因子活性的影响及其与PKC传导途径的关系

目的探讨凝血酶对内皮细胞组织因子（ＴＦ）活性的刺激作用及其与细胞内蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）传导系统的关系。方法传代培养新生牛主动脉血管内皮细胞,取刺激或未受刺激的第４～８代细胞冻融液测定其ＴＦ活性。结果体外培养的血管内皮细胞在静息状态下ＴＦ活性极低（４．２０±１．１９）。与对照组相比,凝血酶的刺激使内皮细胞ＴＦ活性明显升高（ｎ＝８,Ｐ＜０．００１）,且呈剂量依赖性关系（ｒ＝０．７８,Ｐ＜０．０５）和时间依赖性关系（ｒ＝０．８８,Ｐ＜０．０５）。ＰＫＣ抑制剂Ｈ７抑制凝血酶对内皮细胞ＴＦ活性的刺激作用（ｎ＝８,Ｐ＜０．０１）,且抑制作用呈剂量依赖性。ＰＫＣ激动剂佛波酯也可刺激内皮细胞ＴＦ活性增高（３０．５９±３．７９,ｎ＝８,Ｐ＜０．００１）,并可被Ｈ７阻断,ＰＭＡ对凝血酶的刺激作用没有显著影响。结论在凝血酶的刺激下,血管内皮细胞可产生较大量的ＴＦ;凝血酶对内皮细胞的这种刺激作用依赖于细胞内ＰＫＣ系统传导途径。     

人血管性血友病因子裂解蛋白酶pEGFP-N1真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

摘要本研究旨在构建人血管性血友病因子裂解蛋白酶（ADAMTSl3）的pEGFP-N1真核表达载体,为进一步研究ADAMTSl3在细胞内合成及其分泌提供有力工具。通过PCR方法获取目的基因片段,并在目的基因两端加上限制性酶切位点。限制性内切酶酶切后,连接至pEGPF-N1真核表达载体。连接后获得质粒进行酶切鉴定及DNA测序验证,并转染HeLa细胞。通过荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达,Western blot方法鉴定所得蛋白。结果表明,酶切鉴定及DNA测序确认目的基因与载体正确连接,在荧光显微镜下观察到绿色荧光。Western blot显示,转染后HeLa细胞表达ADAMTS13蛋白。结论：成功构建了ADAMTS13-pEGFP-N1真核表达载体,为进一步研究ADAMTS13合成、分泌及其代谢的生理学机制提供了研究工具。     

IK6过表达慢病毒载体的构建及其在THP1细胞系中的表达和生物学特征

本研究旨在构建人IK6基因过表达的慢病毒载体,观察其在THP1细胞株中的表达及对其生物学特征的影响,为研究该基因在白血病中的作用提供基础.采用RT-PCR方法获得目的基因,并与线性化慢病毒载体pGC-FU重组构建慢病毒载体pGC-FU-IK6-GFP,通过菌落PCR鉴定、测序比对分析,确定克隆的正确性.使用Lipofectamine 2000,将慢病毒载体pGC-FU-IK6-GFP转染293T细胞,测定病毒滴度后转染THP1细胞株,用流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR检测靶细胞内IK6 mRNA表达,Western blot检测IK6-GFP融合蛋白,进一步观察THP1生物学特征的改变.结果表明,利用RT-PCR方法获得IK6目的基因并连接到线性化的慢病毒载体上,成功构建具有Amp抗性的pGC-FU-IK6-GFP质粒并转染293T细胞,获得滴度为2.0×109TU/ml的病毒.用目的质粒转染THP1细胞,转染效率可达90％.在靶细胞中检测到IK6 mRNA表达和IK6-GFP融合蛋白表达.IK6能够促进靶细胞克隆形成并且具有抑制凋亡的作用,而对细胞周期无显著影响.结论：成功构建IK6过表达的慢病毒载体,使IK6在THP1细胞株中稳定表达.对靶细胞生物学研究发现IK6极为可能干扰了正常Ikaros蛋白的抑癌作用,并存在潜在的抗凋亡作用,进而在一定程度上促进白血病细胞生长,但对细胞周期无明显影响.该研究为进一步探讨IK6在急性髓系白血病的作用奠定了基础.     

热疗联合组织因子靶向治疗对人大肠癌细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨热疗联合组织因子(TF)靶向治疗在体内和体外对人大肠癌细胞增殖及凋亡的影响.方法 用RNA干扰的方法 敲低大肠癌LOVO细胞系中TF的表达,MTT法、流式细胞术、Western blot方法 测定热疗联合TF敲低对LOVO细胞体外增殖抑制及细胞凋亡的影响.将人大肠癌细胞注射到裸鼠腹股沟皮下建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察不同治疗方法 对肿瘤生长的影响.结果 用RNA干扰的方法 可以有效降低大肠癌LOVO细胞系中TF的表达.与单独热疗和单独TF敲低相比,联合治疗能够明显抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的发生(P<0.05).热疗联合TF敲低能够有效抑制裸鼠体内的肿瘤生长.结论 热疗和TF敲低联合应用能够抑制大肠癌细胞增殖并且诱导其凋亡,热疗联合TF靶向治疗是一个潜在的治疗大肠癌的新策略.     

组织因子、白介素-6和血管内皮生长因子对CHF患者预后的判断价值

目的:研究组织因子(tissuefactor,TF)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在充血性心力衰竭(CHF)患者预后中的地位。方法:选择59例CHF患者和20例健康者,应用酶联免疫吸附法(ELASA)检测血浆中各细胞因子的含量。结果:与对照组相比,CHF患者血浆中TF、IL-6与VEGF含量明显升高(P<0.05);1年内发生心脏事件的TF、IL-6和VEGF含量分别为(267±32)pg/mL、(412±27)pg/mL和(148±12)pg/mL,与未发生心脏事件患者血浆中细胞因子含量相比,差异有显著性(P<0.05);线性相关分析IL-6、VEGF含量与TF含量成正相关(r=0.589、r=0.232,P<0.0001);Logistic多因素回归中年龄、糖尿病、甘油三酯、左心室射血分数(≤30%)、IL-6和TF与CHF患者预后成正相关,VEGF未进入回归模型,TF和IL-6与CHF患者的预后密切相关(r=5.12、r=6.34,P<0.012、P<0.011)。结论:血浆中I...     

葛根素对急性冠状动脉综合征患者外周血组织因子和组织因子途径抑制物含量的影响

目的观察葛根素对急性冠状动脉综合征（ACS）患者外周血组织因子（TF）、组织因子途径抑制物（TFPI）的影响,从临床角度探讨葛根素在ACS防治中的作用。方法临床入选52例ACS患者随机分为两组：常规治疗组[n=22,男13例,女9例,平均年龄（63.45±5.23）岁]和常规治疗加葛根素组[n=30,男18例,女12例,平均年龄（65.82±8.16）岁],两组患者均治疗10d。采用酶联免疫吸附法测定两组患者治疗前后外周血TF、TFPI水平。结果 （1）常规治疗组和葛根素组患者治疗前外周血TF、TFPI含量分别为（57.91±9.92）pg/ml和（56.22±8.71）pg/ml、（158.32±19.71）ng/ml和（156.86±20.50）ng/ml,组间差异无统计学意义（P〉0.05）。（2）治疗后常规治疗组和葛根素组患者外周血TF、TFPI含量分别为（47.19±10.20）pg/ml和（39.81±6.93）pg/ml、（191.85±21.82）ng/ml和（207.92±23.36）ng/ml,与治疗前相比及组间比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论葛根素可以降低ACS患者外周血TF的水平,促进TFPI的表达,可能具有稳定斑块,减少血栓形成的作用。     

C6胶质细胞及其肿瘤模型细胞DNA含量和细胞周期

目的用流式细胞仪对Ｃ６胶质细胞株及其动物模型肿瘤细胞的ＤＮＡ含量及细胞周期进行分析。方法将对数生长期Ｃ６细胞悬液及７例Ｗｉｓｔａｒ大鼠肿瘤模型单细胞悬液用碘化丙啶染色后,用流式细胞仪（ＦＣＭ）进行ＤＮＡ含量和细胞周期测定,所得结果进行统计学分析。结果（１）Ｃ６细胞ＤＮＡ含量呈超二倍体,Ｃ６肿瘤模型细胞７份中２份为二倍体,３份为超二倍体,２份为异倍体,统计学检查验二者有极显著差异（Ｐ＜０００１）。（２）细胞周期各时相细胞百分比示Ｃ６细胞增殖指数（ＰＩ）值为４６０％,Ｃ６肿瘤模型细胞ＰＩ值为４０７％,二者经统计学处理无显著差异（Ｐ＞００５）。结论流式细胞仪分析脑胶质瘤细胞对判定脑胶质瘤恶性程度和预后提供了客观线索和依据。     

pcDNA3.1-flag-pygo2真核表达载体的构建及在C6细胞中的表达

目的构建pcDNA3．1-flag-pygo2真核表达载体并在C6细胞中进行表达。方法从小鼠脑胶质细胞中提取总RNA，RT-PCR法反转录合成CDNA，设计引物，调取目的片段，与pcDNA3．1-flag载体连接后转化大肠杆菌DH5α，LB平板筛选菌落，提取质粒。重组质粒pcDNA3．1-flag-pygo2经过酶切鉴定及测序后，阳离子脂质体法转染C6细胞并经免疫细胞化学染色及蛋白印迹检测重组体的表达。结果重构质粒pcDNA3．1-flag-pygo2经限制性核酸内切酶EcoRⅠ，HindⅢ酶切分析及测序检查，表明真核表达载体构建正确；瞬时转染C6细胞后，免疫细胞荧光染色及蛋白印迹检测表明转染细胞能够表达外源Pygo2基因。结论成功构建了pcDNA3．1-flag-pygo2真核表达载体并能够在真核细胞中进行表达，这为今后研究pygo2基因在胶质瘤中的作用机制奠定了基础。     

抑癌基因PTEN对人神经母细胞瘤细胞组织因子表达调控的研究

目的 研究10号染色体同源缺失的磷酸酶-张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN）对人神经母细胞瘤细胞组织因子（tissue factor，TF）表达的调控。方法 以人神经母细胞瘤细胞系SK—N-SH和SK-N—MC为对象，用Westernb lot法检测PTEN、TF的表达，用RT—PCR方法检测TF转录水平，以脂质体Lipofectamine2000介导进行PTEN基因表达载体pCMV—PTEN的转染；以特异性抑制剂Ly294002阻断磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）／AKT的磷酸化；并以Western blot法检测磷酸化水平。结果 SK—N—SH细胞PTEN强表达而TF弱表达，SK—N-MC细胞PTEN基因表达阴性而TF强表达。以PTEN基因表达载体pCMV—PTEN转染SK-N—MC细胞，PTEN表达增强，而TF表达水平降低，并伴有AKT磷酸化的减弱。用PI3K／AKT信号途径特异性抑制剂Ly294002处理后，TF的表达可呈剂量依赖性降低。结论 PTEN基因的表达可能通过抑制PI3K／AKT信号途径而下调人神经母细胞瘤细胞中TF的表达，PTEN基因的缺失可能是TF异常高表达的原因。     

海洛因对大鼠C6胶质瘤细胞的双向电泳图谱比较

目的 比较海洛因对大鼠C6胶质瘤细胞的双向电泳图谱差异,从蛋白质水平初步探索阿片类毒物-海洛因的作用机制。方法 提取对照组与海洛因组C6胶质瘤细胞的蛋白质,以固相pH梯度等电聚焦为第一向,SDS-PAGE垂直电泳为第二向进行2-DE。以图像分析软件ImageMaster V 5.0分析电泳图谱。结果 将对照组与海洛因组C6胶质瘤细胞的2-DE图谱匹配后,检测到570个蛋白点,差异大于1.5倍的斑点有29个,其中20个下调,9个上调。结论 初步建立了大鼠C6胶质瘤细胞的蛋白质组学分析方法;差异点的发现为深入理解海洛因的分子机制提供了线索。     

弥漫大B细胞性淋巴瘤中bcl-6基因异常及其临床应用价值

目的：观察中国人弥漫大B细胞性淋巴瘤（DLBCL）中bel-6基因突变、基因重排及蛋白表达的特征，探讨其在DLBCL发生中的作用及其临床应用价值。方法：应用聚合酶链反应（PCR）、直接测序和免疫组织化学法分析51例淋巴结内外DLBCL和10例淋巴结反应性增生（RLH）石蜡切片组织中bel-6基因5’非编码区突变高频区段E1．7、E1．8、E1．10、E1．11、E1．12的突变和蛋白表达；应用荧光原位杂交（FISH）技术检测32例淋巴结内DLBCL和5例RLH中bcl-6基因的重排。结果：①12／51（23．5％）DLBCL存在bel-6基因5’非编码区突变，主要集中于E1．11、E1．12和E1．10．2／10（20．0％）RLH的生发中心细胞亦可见有bcl-6突变；②9／32（28．1％）DLBCL有bel-6基因重排，而RLH中均未检测到bcl-6基因重排；③38／51（74．5％）DLBCL中可见bcl-6蛋白细胞核表达，表达形式有滤泡样型、中间型、散在型，RLH中可见生发中心细胞均呈bcl-6阳性表达；④bel-6基因5’非编码区突变、重排和蛋白表达之间均无显著性相关（P〉0．05）。结论：①bel-6基因突变和蛋白表达均可同时发生于DLBCL和RLH的生发中心，表明两者是生发中心和生发中心细胞起源DLBCL的标志，可用于诊断和鉴别诊断；②bcl-6蛋白在不同病例中的不同表达形式不仅反映了DLBCL的异质性，还可能与DLBCL的分子亚型和预后有关；③bcl-6基因重排仅发生于DLBCL而不发生于RLH，表明其可能参与了部分DLBCL的发生，并可作为DLBCL诊断的参考指标。     

人WAF1基因的克隆及其生物调控作用

目的 克隆人WAF1基因,构建成WAF1－pcDNA3真核表达质粒,探索WAF1基因的生物调控功能。方法 采用RT－PCR和DNA直接测序方法从Hela细胞中扩增人WAF1基因,通过克隆到pcDNA3真核克隆载体上,用脂质体法转染Hct-8细胞;经免疫荧光和免疫组化方法鉴定WAF1外源基因的表达活性和对Rb基因,cyclinD1基因的调控作用。结果 从Hela细胞扩增的从WAF1基因克隆至真核克隆表达载体pcDNA3中,获得了人WAF1－pcDNA3重组质粒和高效表达P21WAF1／CIP1的Hcl-8细胞株;证实了WAF1具有促进Rb,抑制cyclinD1蛋白表达的调控作用。结论 成功地构建了人WAF1表达质粒WAF1－pcDNA3,外源基因WAF1的表达对下游基因具有生物调控效应。     

人OVCA1基因的克隆及其对卵巢癌细胞生长的抑制作用

目的克隆人的OVCA1基因并探讨其对卵巢癌细胞生长的影响。方法从健康人卵巢组织中提取总RNA,采用逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增OVCA1基因并克隆。脂质体法将含有OVCA1质粒和空载体分别转染入A2780细胞,G418筛选稳定转染细胞。MTT法检测OVCA1对A2780细胞生长的影响。结果测序证实获得了OVCA1基因;过表达OVCA1的细胞与对照组相比,生长速度明显减慢(P<0.05)。结论得到了OVCA1基因克隆;OVCA1在体外明显抑制卵巢癌细胞系A2780的生长。     

弥漫大 B 细胞性淋巴瘤中 bc1-6基因异常及其临床应用价值

目的:观察中国人弥漫大 B 细胞性淋巴瘤(DLBCL)中 bcl-6基因突变、基因重排及蛋白表达的特征,探讨其存 DLBCL 发生中的作用及其临床应用价值。方法:应用聚合酶链反应(PCR)、直接测序和免疫组织化学法分析51例淋巴结内外 DLBCL 和10例淋巴结反应性增生(RLH)石蜡切片组织中 bcl-6基因5’非编码区突变高频区段E1.7、E1.8、E1.10、E1.11、E1.12的突变和蛋白表达;应用荧光原位杂交(FISH)技术检测32例淋巴结内 DLBCL 和5例 RLH 中 bcl-6基因的重排。结果:①12/51(23.5%)DLBCL 存在 bcl-6基因5’非编码区突变.主要集中于 E1.11、E1.12和 E1.10,2/10(20.0%)RLH 的生发中心细胞亦可见有 bcl-6突变;②9/32(28.1%)DLBCL 有 bcl-6基因重排,而 RLH 中均未检测到 bcl-6基因重排;③38/51 (74.5%)DLBCL 中可见 bcl-6蛋白细胞核表达,表达形式有滤泡样型、中间型、散在型,RLH 中可见生发中心细胞均呈 bcl-6阳性表达;④bcl-6基因5’非编码区突变、重排和蛋白表达之间均无显著性相关(P>0.05)。结论:①bcl-6基因突变和蛋白表达均可同时发生于 DLBCL 和 RLH 的生发中心,表明两者是生发中心和生发中心细胞起源 DLBCL 的标志,可用于诊断和鉴别诊断:②bcl-6蛋白在不同病例中的不同表达形式不仅反映了 DLBCL 的异质性,还可能与 DLBCL 的分子亚型和预后有关:③bcl-6基因重排仅发生于 DLBCL而不发生于 RLH,表明其可能参与了部分 DLBCL 的发生,并可作为 DLBCL 诊断的参考指标。