纤维连接蛋白对原发性开角型青光眼小梁网细胞增殖、黏附和迁移的影响

目的通过研究纤维连接蛋白（FN）对体外培养的原发性开角型青光眼（POAG）患者小梁网细胞增殖、黏附、迁移的影响,探讨FN与POAG发病机制的关系。方法取临床确诊的POAG患者小梁网切除术中的深层巩膜组织块,进行小梁网细胞体外原代和传代培养．并对其进行免疫细胞化学和电镜鉴定。取第3代小梁网细胞,实验组分别加入浓度为5、10、20、40、100μg／ml的FN（含无血清DMEM／F12培养液）培养,对照组不加FN。培养24h后,采用CCK-8比色法和Transwell试剂盒检测各组光密度值,分析FN对POAG小梁网细胞增殖、黏附、迁移的影响。采用SPSS17．0统计软件,组间比较采用One-Way ANOVA分析,两两比较采用SNK检验。结果经过免疫细胞化学和电镜鉴定后,确定培养的细胞为POAG小梁网细胞。不同浓度FN对小梁网细胞均有影响。FN对POAG小梁网细胞有促增殖作用,在FN为5～10μg／ml浓度范围,小梁网细胞增殖相对缓慢,10μg／ml以后呈现上调趋势,在40μg／ml时达到增殖高峰,100μg／ml仍促进增殖,但是相对缓慢。各实验组光密度值分别与阴性对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）;各实验组不同浓度组间比较,差异有统计学意义（F=81．778,P〈0．05）。FN浓度为5、10、20、40、100μg／ml时．小梁网细胞的增殖率分别为18．6％、54．7％、67．9％、98．7％和121．5％。同样,FN对POAG小梁网细胞有明显的促黏附、迁移作用。小梁网细胞的黏附、迁移能力随FN浓度的增加而增强,基本呈现曲线上升趋势,与阴性对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论FN能促进POAG患者小梁网细胞增殖、黏附和迁移,其在POAG发病机制中的作用可能为通过影响POAG小梁网细胞的增殖、黏附、迁移功能参与房水流出的调节过程。     

miR-181a靶向沉默信息调节因子相关酶1在过氧化氢诱导的人小梁网细胞氧化应激中的调节作用

目的　探讨miR-181a对过氧化氢（H₂O₂）诱导的人小梁网细胞（HTMCs)氧化应激的调节作用及其机制。方法　HTMCs随机分为空白组（0 μmol·L^-1 H₂O₂）、200 μmol·L^-1 H₂O₂组、400 μmol·L^-1 H₂O₂组、600 μmol·L^-1 H₂O₂组,分别使用相应浓度H₂O₂处理HTMCs,24 h后MTT法检测各组细胞存活率,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测各组细胞miR-181a mRNA表达,Western blot检测各组细胞中沉默信息调节因子相关酶1（SIRT1）蛋白表达。根据转染物的不同分为miR-181a inhibitor组、miR-181a NC组、miR-181a mimics组、miR-181a inhibitor+si-SIRT1组和miR-181a inhibitor+si-NC组,使用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针检测各组细胞内活性氧（ROS）含量,使用超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）ELISA试剂盒检测各组细胞SOD和MDA活性,使用Annexin V FITC/PI联合流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western blot检测各组细胞中SIRT1蛋白表达,双荧光素酶报告基因实验对靶点进行验证。结果　与空白组比较,200 μmol·L^-1 H₂O₂组、400 μmol·L^-1 H₂O₂组、600 μmol·L^-1 H₂O₂组细胞存活率均降低（均为P<0.05）。细胞miR-181a mRNA的表达随着H₂O₂浓度的增加而增加,SIRT1蛋白的表达随着H₂O₂浓度的增加而降低（均为P<0.05）。与miR-181a NC组比较,miR-181a mimics组细胞凋亡率、MDA活性和ROS含量均升高,细胞SOD活性、SIRT1蛋白表达均降低,miR-181a inhibitor组细胞凋亡率、MDA活性和ROS含量均降低,细胞SOD活性、SIRT1蛋白表达均升高（均为P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-181a靶向抑制SIRT1蛋白的表达。与miR-181a inhibitor+si-NC组比较,miR-181a inhibitor+si-SIRT1组细胞凋亡率、MDA活性和ROS含量均升高,SOD活性降低（均为P<0.05）。结论　miR-181a可能通过靶向SIRT1调节H₂O₂诱导的HTMCs氧化应激作用。     

MicroRNA-96对人视网膜色素上皮细胞增殖与迁移的影响

目的：探讨MicroRNA-96（miR-96）对人视网膜色素上皮（RPE）细胞增殖和迁移的影响。方法：实验研究。通过RNA原位杂交检测人胚胎眼（20周）石蜡切片中RPE层miR-96的表达情况。将miR-96和阴性对照（NC）通过阳离子脂质体介导转染人眼RPE细胞,采用细胞增殖实验（MTS）、流式细胞术和Transwell实验分别检测细胞增殖、细胞周期以及细胞迁移能力。通过生物信息学及Western blot法确定miR-96作用的靶基因。应用Western blot检测miR-96对细胞增殖迁移相关信号通路蛋白（Akt、ERK）及细胞周期相关蛋白（p-Cdc2、CyclinD2、p-Rb）表达的影响。组间数据比较采用独立样本t检 验。结果：MiR-96在人眼RPE细胞中有表达。MTS结果显示,转染NC、miR-96后,人眼RPE细胞的相对增殖速率分别为100%、74%±2%,差异有统计学意义（t=42.174,P=0.002）。流式细胞术检测结果显示,转染miR-96后阻滞在G1期的RPE细胞显著多于转染NC后,且差异有统计学意义（t= -18.444,P=0.003）。Transwell实验结果显示,与转染NC相比,转染miR-96能显著抑制RPE细胞的迁移,差异具有统计学意义（t=6.754,P=0.002）。进而,明确了MITF是miR-96作用的靶基因。Western blot检测结果显示,转染miR-96后细胞中细胞周期相关蛋白p-Rb（t=11.211,P=0.002）、p-Cdc2（t=9.133, P=0.003）、CyclinD2（t=7.542,P=0.005）以及迁移相关信号通路蛋白p-ERK（t=16.699,P<0.001）,p-Akt （t=23.552,P<0.001）的表达水平均降低。结论：miR-96通过作用于靶基因MITF,并调控细胞周期和迁移相关蛋白的表达从而抑制人RPE细胞的增殖和迁移。     

上调microRNA-27b对血小板衍生因子诱导下的人视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用

目的　观察过表达的microRNA-27b(miR-27b)对血小板衍生因子（platelet-derived growth factor,PDGF）诱导下的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）增殖的抑制作用，探讨miR-27b在ARPE细胞生物学行为中的作用及其调控机制。方法　将miR-27b过表达质粒或空载体转入ARPE-19细胞36 h后，用终浓度为20 μg·L^-1的PDGF预处理ARPE-19细胞5 h。根据转染物不同，将实验分为空白对照组（control组）、miR-27b阴性对照组（miR-27b NC组）、miR-27b模拟物转染组（PDGF+mimics组）和空载体转染组（PDGF+NC组）。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测转染后各组ARPE-19细胞中miR-27b的表达水平；MTT法测定各组细胞活性；通过流式细胞术评估各组细胞周期的分布变化；Western blot检测各组细胞周期的正向调控因子cyclinD1、CDK4和负向调控因子p21^CIP1和p27^KIP1的表达水平。结果　qRT-PCR检测结果显示:经PDGF处理5 h，与miR-27b NC组相比，PDGF+NC组miR-27b的表达显著降低（P<0.01）；与PDGF+NC组相比，PDGF+mimics组miR-27b的表达增加（P<0.01）。MTT检测结果显示:与miR-27b NC组相比，PDGF+NC组ARPE-19细胞的光密度（D）值增加(P<0.01)；而与PDGF+NC组相比，PDGF+mimics组可明显抑制ARPE-19细胞的D值(P<0.01)。流式细胞术检测结果显示:与空白对照组和miR-27b NC组相比，PDGF+NC组G0/G1期细胞的百分比显著降低，S期细胞的百分比增加（P<0.05）；而与PDGF+NC组相比，PDGF+mimics组miR-27b的过表达显著增加了G0/G1期细胞的百分比，并抑制了细胞增殖（均为P<0.05）。Western blot检测结果显示:与PDGF-NC组相比，PDGF+mimics组miR-27b的过表达可显著降低cyclinD1蛋白和CDK4蛋白的表达，同时增强了p21^CIP1蛋白和p27^KIP1蛋白的表达（均为P<0.05）。结论　上调miR-27b表达可抑制PDGF诱导的ARPE细胞增殖。     

miR-22-3p对蓝光暴露下大鼠视网膜神经节细胞的保护作用及其机制

目的　探讨miR-22-3p对蓝光暴露下的大鼠视网膜神经节细胞（RGC）的保护作用及机制。方法　取36只清洁级SD大鼠, 将12只SD大鼠随机分为2组:对照组与蓝光暴露组,每组6只。对照组采用正常的12 h明暗循环饲养;蓝光暴露组大鼠先进行暗适应24 h,随后采用复方托吡卡胺散瞳,将大鼠暴露在蓝光（光照强度1500 lux）下2 h;另取24只大鼠随机分为4组:对照组、蓝光暴露组、AAV-miR22组、AAV-miR22&PTEN组,每组6只。对照组采用正常的12 h明暗循环饲养,其余3组均接受蓝光暴露处理,AAV-miR22组注射1 μL含 2.5×10⁹ vg(基因组拷贝数)的AAV-7m8-miR-22-3p,AAV-miR22&PTEN组注射1 μL含2.5×10⁹ vg的AAV-7m8-miR-22-3p&PTEN,对照组与蓝光暴露组向大鼠玻璃体内注射1 μL生理盐水,注射结束使用氧氟沙星眼膏预防感染。取大鼠眼球组织行HE染色,在光学显微镜下观察检测神经节细胞层（GCL）、GCL至外核层 (ONL)的厚度,其中包含有内丛状层（IPL）、内核层(INL)、外丛状层（OPL）;采用NeuN免疫荧光组织化学染色标记RGC,计数视网膜上NeuN标记的阳性细胞数;TUNEL染色检测细胞凋亡;采用Lipofectamine 2000转染试剂盒转染阴性对照、miR-22-3p mimic、miR-22-3p inhibitor至RGC-5细胞,转染48 h后测定miR-22-3p表达量,转染成功即可采用Western blot检测PTEN蛋白表达情况;采用实时荧光定量PCR检测miR-22-3p表达,Western blot检测PTEN、p-Akt、Akt与Nrf2蛋白表达情况;双荧光素酶报告实验在酶标仪上测定荧光素酶活性。结果　HE染色结果证实:与对照组相比,蓝光暴露组大鼠视网膜组织萎缩,视网膜GCL、GCL至ONL厚度变薄（P<0.05）。另外,NeuN免疫荧光组织化学染色发现:与对照组相比,蓝光暴露组大鼠视网膜组织RGC数减少（P<0.05）。实时荧光定量PCR实验结果显示:与对照组相比,蓝光暴露组大鼠视网膜组织内miR-22-3p相对表达量降低（P<0.05）。Western blot检测结果显示:与对照组相比,蓝光暴露组大鼠视网膜组织内PTEN蛋白的表达水平升高,Nrf2蛋白的表达水平和p-Akt/Akt蛋白表达比值均降低（均为P<0.05）;miR-22-3p能够负向调控PTEN蛋白在RGC内的表达水平（P<0.05）。HE染色结果显示:过表达miR-22-3p能够缓解蓝光诱导的大鼠视网膜萎缩,并且能够提高大鼠视网膜GCL、GCL至ONL厚度。NeuN免疫荧光组织化学染色结果证实:过表达miR-22-3p能够通过靶向抑制PTEN表达提高蓝光暴露大鼠视网膜上RGC数。TUNEL实验结果证实:miR-22-3p能够通过抑制PTEN表达缓解蓝光诱导的大鼠视网膜RGC凋亡。结论　miR-22-3p能够通过靶向抑制PTEN的表达,激活PI3K/Akt/Nrf2通路,缓解蓝光诱导的大鼠RGC凋亡。     

白细胞介素-1α对猪小梁细胞基质金属蛋白酶／基质金属蛋白酶抑制剂表达的影响

背景房水外流通路的阻塞或小梁网细胞外基质（ECM）的异常堆积导致房水流畅系数降低是引起眼压升高的原因之一,基质金属蛋白酶（MMPs）和组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）的平衡对ECM的代谢至关重要,白细胞介素-1α（IL-1α）可以通过调节MMPs的表达而调节房水的外流。目的研究猪重组IL-1α对体外培养的猪眼小梁细胞MMP-2、MMP-3及TIMP-1表达的影响。方法从猪眼取出带有小梁组织的巩膜,用组织块培养法培养小梁细胞并进行传代,第3代的猪小梁细胞应用纤维连接蛋白（FN）和层黏连蛋白（LM）进行鉴定。第3代小梁细胞血清饥饿培养24h后分为2组,对照组加入无血清培养基,IL组加入10m／L IL-1α,分别培养30min。采用细胞免疫化学法分析IL组MMP-2、MMP-3及TIMP-1蛋白在培养小梁细胞中的表达;采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测小梁细胞中MMP-2mRNA、MMP-3mRNA及TIMP-1 mRNA的表达,并与对照组的检测结果进行比较。结果传3代的细胞对FN和LM呈现阳性反应。与对照组比较,IL组小梁细胞中MMP-3和TIMP-1蛋白的表达量（A值）明显升高,差异均有统计学意义（t=-7．694、t=-5．199,P〈0．05）,但2组间小梁细胞中MMP-2表达的差异无统计学意义（t=-2．365,P〉0．05）。IL组小梁细胞中MMP-3mRNA和TIMP-1mRNA的表达量（A值）明显高于对照组,差异均有统计学意义（t=-3．025、t=-1．921,P〈0．05）,而2组间小梁细胞中MMP-2mRNA的表达差异无统计学意义（t=-1．173,P〉0．05）。结论外源性IL-1α能增加猪眼小梁细胞中MMP-3、TIMP-1的表达,引起MMP-3／TIMP-1平衡改变,促进小梁网ECM的分解,增加房水外流,而对MMP-2的表达无影响。     

MicroRNA-199a-3p对脉络膜黑色素瘤细胞增殖的抑制作用

目的：探讨MicroRNA-199a-3p（miR-199a-3p）对脉络膜黑色素瘤细胞OCM290增殖的影响及机制。 方法：实验研究。首先采用Real-time PCR技术检测miR-199a-3p在正常的脉络膜黑色素细胞UM96和肿瘤细胞OCM290中的表达情况;其次采用阳离子脂质体Lipofectamine介导的转染方法,将miR- 199a-3p转染入体外培养的人脉络膜黑色素瘤细胞OCM290中过表达作为实验组,将随机序列寡核苷酸链转染入OCM290细胞作为阴性对照组;然后在转染的基础上运用细胞增殖实验法（MTS法）、克隆形成实验检测细胞增殖和生长能力。流式细胞术检测细胞周期。Western blot法检测与细胞周期相关的信号蛋白如CDK2、CDK4、E2F1等的表达。组间数据比较采用独立样本t检验。结果：miR-199a-3p在UM96中高表达,而在OCM290中表达明显下调（t=13.2,P<0.001）。OCM290细胞转染 miR-199a-3p后,MTS结果显示实验组细胞数为对照组的（23.8±1.7）%,细胞增殖明显被抑制（t=78.1,P<0.001);细胞克隆数减少;细胞周期滞留在G1期（t=-8.5,P=0.001）;Western blot法检测发现miR-199a-3p能下调OCM290中CDK2、CDK4、E2F1等的表达水平（t=10.3,P=0.001;t=9.9,P=0.001; t=10.4,P<0.001）。结论：miR-199a-3p通过下调调控细胞周期进程的关键蛋白,影响细胞周期的进程,从而抑制脉络膜黑色素瘤细胞的增殖。     

miR-29b通过靶向调节特异性蛋白1调控糖尿病性白内障晶状体上皮细胞间质转化的作用

目的　探究miR-29b通过靶向调节特异性蛋白1（SP-1）调控糖尿病性白内障晶状体上皮细胞间质转化（EMT）的作用机制。方法　体外培养人晶状体上皮细胞（HLE-B3）,分为正常组、高糖组、阴性组、miR-29b mimics组和miR-29b mimics+SP-1组。除正常组细胞外,其余各组细胞于35.5 mmol·L^-1 D-葡萄糖环境中培养。阴性组、miR-29b mimics组和miR-29b mimics+SP-1组分别共转染miRNA模拟物scramble和阴性siRNA序列、转染miR-29b模拟物、共转染miR-29b模拟物和SP-1基因序列。采用实时荧光定量PCR检测各组细胞miR-29b和SP-1 mRNA表达,采用Transwell法和细胞划痕实验检测各组细胞迁移活性。采用免疫荧光染色和Western blot检测和各组细胞钙黏蛋白（E-Cadherin、N-Cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、SP-1蛋白表达情况。根据生物信息学数据库和双荧光素酶报告基因验证miR-29b和SP-1基因的靶向关系。结果　35.5 mmol·L^-1 D-葡萄糖组处理HLE-B3 24 h,细胞中miR-29b mRNA相对表达量较正常组降低,SP-1 mRNA和蛋白相对表达量均升高（均为P＜0.05）。与正常组相比,高糖组细胞Transwell小室迁移数量和划痕愈合率增加,E-Cadherin蛋白表达降低,N-Cadherin和Vimentin蛋白表达升高（均为P＜0.05）。而与高糖组和阴性组相比,miR-29b mimics组细胞miR-29b mRNA相对表达量和E-Cadherin蛋白表达增加,SP-1、N-Cadherin 和Vimentin蛋白表达降低,细胞Transwell小室迁移数量和划痕愈合率均减少（均为P＜0.05）。miR-29b mimics+SP-1组较miR-29b mimics组细胞中E-Cadherin蛋白表达降低,N-Cadherin和Vimentin蛋白表达增加,细胞Transwell小室迁移数量和划痕愈合率增加（均为P＜0.05）。经双荧光素酶报告基因验证,转染miR-29b mimics质粒可降低SP1-3’UTR-WT荧光素酶活性（P＜0.05）,但不降低SP1-3’UTR-MUT荧光素酶活性（P＞0.05）。结论　miR-29b在糖尿病性白内障体外细胞模型中表达下调。上调miR-29b表达可通过靶向SP-1基因参与抑制高糖诱导晶状体上皮细胞EMT的进程。     

miR-34a-5p对ARPE-19细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白表达及细胞增殖、迁移和上皮-间质转化的影响

目的 探讨miR-34a-5p对ARPE-19细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白表达及细胞增殖、迁移和上皮-间质转化(EMT)的影响。方法 将ARPE-19细胞分为4组：对照组、转化生长因子(TGF)-β1组、miR-34a-5p过表达组与复合干预组,对照组与TGF-β1组采用Lipofectamine 2000转染试剂转染对照模拟物,miR-34a-5p过表达组与复合干预组转染miR-34a-5p模拟物,培养24 h后采用无血清培养基饥饿培养12 h, TGF-β1组与miR-34a-5p过表达组均添加10 mg·L^-1的TGF-β1,复合干预组添加10 mg·L^-1的TGF-β1与10μmol·L^-1的TGF-β通路激活剂SRI-011381,各组细胞继续培养24 h,测定细胞增殖、迁移与EMT。采用Western blot检测细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白的表达水平,Ki67荧光染色检测细胞增殖情况,免疫荧光染色测定细胞EMT相关蛋白表达情况,划痕实验和Transwell实验测定细胞的迁移和侵袭能力。结果 ...     

老年性白内障患者circKMT2E表达变化及其对晶状体上皮细胞凋亡的影响

目的　探讨circKMT2E在老年性白内障（ARC）患者中的表达变化及其对晶状体上皮细胞凋亡的影响。方法　取10例在我院接受白内障手术的ARC患者晶状体前囊膜,另选取4例健康捐献者透明晶状体前囊膜作为对照。使用Trizol试剂从人晶状体前囊膜组织中提取总RNA。依次使用cutadapt软件、DCC软件(v0.4.4)、STAR软件 (v2.51 b)、CircBase数据库和circ2Trait数据库对所测得的环状RNA（circRNA）进行注释,筛选circRNA差异表达。将体外培养的SRA01-04细胞随机分组,其中,空白对照组:用正常培养液培养,不作特殊处理;miR-control组:转染miR-control无序序列;miR-34a组:转染miR-34a-5p mimics序列;miR-34a+control组:共转染miR-34a-5p mimics序列和pcDNA3.1-control空载体;miR-34a+HMGB1组:共转染miR-34a-5p mimics序列和pcDNA3.1-HMGB1质粒。采用实时荧光定量PCR与双荧光素酶报告基因检测基因表达情况。 通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测蛋白表达。结果　经生物信息学分析显示,circKMT2E在ARC患者晶状体前囊膜组织中表达上调最为显著。双荧光素酶报告基因检测结果显示,转染miR-34a-5p后circKMT2E-WT报告基因的荧光素酶活性由1.000±0.023降低至0.502±0.057（P<0.05）;而circKMT2E-MUT报告基因的荧光素酶活性由1.005±0.018降低至0.989±0.053（P>0.05）。miR-34a组SRA01-04细胞凋亡率（23.59%±3.47%）较miR-control组（3.82%±0.41%）增高（P<0.05）,而miR-34a-HMGB1组SRA01-04细胞凋亡率（8.97%±1.20%）较miR-34a-control组（24.59%±4.33 %）降低（P<0.05）。miR-34a组SRA01-04细胞Cyt-C蛋白、Bax蛋白相对表达量较miR-control组均升高,同时Bcl-2蛋白相对表达量则降低（均为P<0.05）;miR-34a-HMGB1组SRA01-04细胞Cyt-C蛋白和Bax蛋白相对表达量较miR-34a-control组均降低,同时Bcl-2蛋白相对表达量较miR-34a-control组增加（均为P<0.05）。结论　circKMT2E可通过海绵吸附miR-34a-5p减弱其对下游靶点HMGB1的抑制作用,进而有效地阻止SRA01-04细胞凋亡,在一定程度起到延缓ARC发展的作用。     

原发性开角型青光眼小梁细胞的体外培养及其生物学特性

背景原发性开角型青光眼（POAG）是一种常见致盲性眼病,其特点是房水外流阻力增加导致眼压增高。位于房水外流通道的小梁网调节房水的外流,因此研究小梁网细胞的生物学特性有着重要的意义。目的探讨POAG小梁细胞体外培养的方法及其生物学特性。方法经小梁切除术收集8例开角型青光眼患者患眼的带小梁网的深层巩膜组织块进行体外原代和传代培养,用鼠抗人层黏连蛋白（LM）单克隆抗体、兔抗人纤维连结蛋白（FN）单克隆抗体、鼠抗人神经元特异性烯醇化酶（NSE）单克隆抗体进行免疫组织化学检测以对传代细胞进行鉴定,在透射电子显微镜下对传代细胞的超微结构进行观察,并将传代小梁细胞的生物学特性与本研究组前期培养的正常小梁细胞进行比较。结果组织块培养10d左右,可见细胞从其边缘向外生长。传代细胞在4d内处于对数生长期,其后进入平台期,第7天细胞基本融合。第3代POAG小梁细胞及正常人眼小梁细胞中可见FN、LM和NSE均呈阳性表达,证实传代细胞为小梁细胞,而空白对照组细胞未见FN、LM和NSE表达。第3代POAG小梁细胞和正常小梁细胞中FN的A450值分别为0．354±0．06和0．26±0．01,LM的A450值分别为0．34±0．03和0．25±0．02,差异均有统计学意义（FN：t=14．446,P=0．001;LM：t=9．346,P=0．001）。与正常小梁细胞比较,第3代POAG小梁细胞表面的微绒毛、细胞质的溶酶体及吞噬小泡含量减少。结论采用组织块培养法可成功在体外培养POAG小梁细胞,该研究结果为研究青光眼的发病机制提供了细胞学基础。     

SIRT1、PGC-1α在原发性开角型青光眼患者小梁网组织中的表达及意义

目的　检测原发性开角型青光眼（primary open-angle glaucoma，POAG）患者小梁网组织中沉默信息调节因子2相关酶1（silent information regulator factor 2 related enzyme 1，SIRT1）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）表达水平，探讨其与POAG小梁网组织功能损伤的关系。方法　收集2017年1月至2018年4月在海南医学院第一附属医院手术切除确诊为POAG 40例（40眼）患者的小梁网组织为POAG组样本，另取30例眼球供体的小梁网组织为对照组样本，采用RT-PCR法检测2组小梁网组织中SIRT1、PGC-1α mRNA表达，免疫组织化学染色法检测SIRT1、PGC-1α蛋白表达，同时检测过氧化物酶（peroxidase dismutase，POD）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平。结果　POAG组小梁网组织中SIRT1、PGC-1α mRNA表达水平（0.11±0.03、0.32±0.10）均低于对照组（0.24±0.07、0.67±0.21）（均为P＜0.05）；POAG组小梁组织中SIRT1表达与PGC-1α表达呈正相关关系（r=0.759，P＜0.05）；POAG组小梁网组织中POD水平［（102.59±22.37）×10³ U·L^-1］高于对照组［（73.46±15.81）×10³U·L^-1］（P＜0.05），SOD水平［（347.62±50.73）U·L^-1］低于对照组［（412.57±61.25）U·L^-1］（P＜0.05）；POAG组小梁网组织中SIRT1、PGC-1α表达与POD水平均呈负相关关系（r=-0.636、-0.737，均为P＜0.05），与SOD水平均呈正相关关系（r=0.662、0.614，均为P＜0.05）。结论　POAG患者小梁网组织中SIRT1和PGC-1α表达水平降低，可能在线粒体功能失调和氧化应激对小梁网的损伤中发挥重要调控作用。     

IL-6对体外培养的牛眼小梁细胞中纤维连接蛋白的影响

目的：探讨不同浓度白细胞介素-6(IL-6)刺激下体外培养的牛眼小梁细胞中纤维连接蛋白的表达变化。

方法：采用组织块培养法取新鲜牛眼的小梁网组织,提取并培养第3代牛眼小梁细胞,采用细胞形态学对细胞进行鉴定。经终浓度为0、0.1、0.5、1ng/mL的IL-6药物刺激24h后,采用荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法检测各浓度IL-6刺激下牛眼小梁细胞中FN mRNA和蛋白的表达。

结果：培养出的牛眼小梁细胞符合第3代牛眼小梁细胞形态特征。实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法显示,不同浓度IL-6刺激下的牛眼小梁细胞所产生的FN mRNA量分别为1.000±0.000、0.213±0.004、0.056±0.001、0.019±0.002,FN蛋白表达量分别为1.167±0.012、0.662±0.009、0.238±0.011、0.061±0.011,均呈下调趋势(r_s=-0.713、-0.901,均P<0.05),4组间FN mRNA和蛋白表达均有差异(P<0.05)。

结论：体外培养的牛眼小梁细胞在外源性IL-6刺激下影响FN mRNA和蛋白的表达,且IL-6浓度与蛋白表达呈负相关性,推测IL-6可能通过影响FN基因与蛋白的表达,进而改变小梁网组织结构。     

Modulation of extracellular matrix turnover in the trabecular meshwork

Intraocular pressure (IOP) is the most critical risk factor for primary open angle glaucoma (POAG). In most cases of POAG, IOP is increased because of an abnormally high aqueous humor outflow resistance in the juxtacanalicular region of the trabecular meshwork. A distinct structural change in the trabecular meshwork of patients with POAG is the increase in fibrillar extracellular matrix in the juxtacanalicular region of the trabecular meshwork. Our knowledge on the molecular factors that govern turnover of the extracellular matrix in the trabecular meshwork has increased considerably in recent years. It has become clear that quality and quantity of the extracellular matrix in the trabecular meshwork are regulated by several signaling molecules that interact with each other to promote its synthesis, degradation, or extracellular modification. Transforming growth factor-β1 and β2 (TGF-β1 and TGF-β2) which derive from the aqueous humor or may be locally expressed induce in cultured trabecular meshwork cells the expression of a variety of extracellular matrix molecules. The action of TGF-βs very likely requires local activation by thrombospondin-1 and is partly mediated by its downstream mediator connective tissue growth factor, both of which are constitutively expressed in the trabecular meshwork. Bone morphogenetic proteins (BMP)-7 and -4 effectively antagonize the effects of TGF-β2 on matrix deposition. The antagonizing effects of BMP-7 are mediated in trabecular meshwork cells through Smad7. Smad7 is a key molecular switch to inhibit TGF-β2 signaling in the trabecular meshwork.     

Expression profile of the matricellular protein osteopontin in primary open-angle glaucoma and the normal human eye

PURPOSE. To characterize the role of osteopontin (OPN) in primary open-angle glaucoma (POAG) and normal eyes. METHODS. OPN quantification was performed by enzyme-linked immunosorbent assay in aqueous humor (AH) obtained from human donor eyes (POAG and normal) and surgical samples (POAG and elective cataract removal). OPN expression and localization in whole eye tissue sections and primary normal human trabecular meshwork (NTM) cells were studied by Western blot and immunohistochemistry. Latanoprost-free acid (LFA)-treated NTM cells were analyzed for OPN gene and protein expression. Intraocular pressure was measured by tonometry, and central corneal thickness was measured by optical coherence tomography in young OPN(-/-) and wild-type mice. RESULTS. OPN levels were significantly reduced in donor POAG AH compared with normal AH (0.54 ± 0.18 ng/μg [n = 8] vs. 0.77 ± 0.23 ng/μg [n = 9]; P = 0.039). A similar trend was observed in surgical AH (1.05 ± 0.31 ng/μg [n = 20] vs. 1.43 ± 0.88 ng/μg [n = 20]; P = 0.083). OPN was present in the trabecular meshwork, corneal epithelium and endothelium, iris, ciliary body, retina, vitreous humor, and optic nerve. LFA increased OPN gene expression, but minimal change in OPN protein expression was observed. No difference in intraocular pressure (17.5 ± 2.0 mm Hg [n = 56] vs. 17.3 ± 1.9 mm Hg [n = 68]) but thinner central corneal thickness (91.7 ± 3.6 μm [n = 50] vs. 99.2 ± 5.5 μm [n = 70]) was noted between OPN(-/-) and wild-type mice. CONCLUSIONS. OPN is widely distributed in the human eye and was found in lower concentrations in POAG AH. Reduction of OPN in young mice does not affect IOP.     

miR-124-3p靶向调控KLF6基因表达对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞增殖和凋亡的影响

目的　探讨微小RNA-124-3p（miR-124-3p）对H₂O₂诱导的人晶状体上皮细胞增殖及凋亡的影响及其靶向调控 Krüppel样因子6(Krüppel like factor 6,KLF6)的机制。方法　按HLE-B3细胞处理方式的不同,将其分为HLE-B3组、HLE-B3+ H₂O₂组、HLE-B3+H₂O₂+miR-NC组、HLE-B3+H₂O₂+miR-124-3p组、HLE-B3+H₂O₂+si-NC组、HLE-B3+H₂O₂+si-KLF6组、miR-124-3p+pcDNA3.1组、miR-124-3p+pcDNA3.1-KLF6组。利用MTT实验检测各组HLE-B3细胞增殖活性,流式细胞仪检测各组HLE-B3细胞凋亡。双荧光素酶报告基因实验验证miR-124-3p与KLF6的靶向关系。Western blot检测各组HLE-B3细胞中Cyclin D1、P21、Bax、Bcl-2蛋白表达。结果　H₂O₂可抑制人晶状体上皮HLE-B3细胞中miR-124-3p的表达（HLE-B3组0.79±0.07、HLE-B3+H₂O₂组0.31±0.03）（P＜0.05）,而明显促进KLF6 的表达;miR-124-3p过表达或抑制KLF6表达可促进HLE-B3细胞增殖,抑制HLE-B3细胞凋亡（19.34±1.27、7.66±0.38;19.29±1.33、11.46±1.02）,促进Cyclin D1（0.39±0.04、0.89±0.08;0.39±0.04、0.74±0.07）、Bcl-2表达（0.29±0.03、0.74±0.07;0.29±0.03、0.60±0.06）,抑制P21（0.73±0.07、0.26±0.03;0.79±0.07、0.33±0.03）、Bax表达（0.86±0.08、0.37±0.03;0.86±0.08、0.51±0.05）。共转染miR-124-3p mimics与WT-KLF6可明显降低HLE-B3细胞的荧光素酶活性（0.27±0.03、0.98±0.08）（P＜0.05）;过表达KLF6可逆转miR-124-3p对H₂O₂诱导的人晶状体上皮细胞HLE-B3细胞增殖及凋亡的作用。结论　miR-124-3p可通过靶向调控 KLF6表达进而促进H₂O₂诱导的人晶状体上皮细胞HLE-B3细胞增殖并抑制其凋亡。     

Effect of high glucose on fibronectin expression and cell proliferation in trabecular meshwork cells.

PURPOSE: Increased fibronectin accumulation in the trabecular meshwork of glaucomatous eyes may contribute to the resistance of aqueous outflow and the development of primary open-angle glaucoma (POAG). Because the glucose level is increased in the aqueous humor of patients with diabetes, this study was conducted to determine whether a high-glucose condition alters fibronectin expression and contributes to cell loss in trabecular meshwork. METHODS: The fibronectin mRNA level was determined using RT-PCR in bovine trabecular meshwork cells grown in normal (5 mM) or high (30 mM)-glucose medium for 7 days, and cell counts were measured during this period. Distribution and the relative amount of fibronectin protein were determined in these cells by immunofluorescence microscopy and Western blot analysis. RESULTS: Fibronectin mRNA level in cells grown in high-glucose medium was significantly upregulated two- to threefold compared with cells grown in normal medium (P < 0.05). In cells grown in high-glucose medium, fibronectin immunofluorescence was more intense, and the relative amount of fibronectin protein was significantly increased (131% +/- 15% of control, P < 0.05) compared with the amount in cells grown in normal medium. A moderate decrease in cell number was observed in cells grown in high-glucose medium (78% +/- 7% of control, P < 0.05) CONCLUSIONS: These findings indicate that a high glucose level in aqueous humor of patients with diabetes may increase fibronectin syntheses and accumulation in trabecular meshwork and accelerate the depletion of trabecular meshwork cells, a characteristic feature of the outflow system in POAG. The striking similarity between high glucose-induced alterations in trabecular meshwork cells and those of vascular endothelial cells may represent a common biochemical link in the pathogenesis of POAG and diabetic microangiopathy.