羧甲基壳聚糖对兔骨关节炎软骨一氧化氮合酶表达的影响

目的探讨关节腔注射羧甲基壳聚糖(CMCTS)对骨关节炎(OA)软骨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响。方法大耳白兔32只,每只兔单侧膝关节行前交叉韧带切断术,术后5周将兔随机分为4组,每组8只,A组：关节腔注射2%高相对分子质量的CMCTS 0．3ml,每2周重复1次；B组：同等条件下注射2%低相对分子质量的CMCTS 0．3ml；C组：关节腔注射1%透明质酸钠(Na-HA)0．3ml,每周重复1次；D组：关节腔不注射任何药物。术后11周处死动物。采用免疫组织化学、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测软骨iNOS的表达。结果免疫组织化学及RT-PCR显示CMCTS注射组软骨iNOS的表达水平显著低于Na-HA注射组和不用药组,不同相对分子质量CMCTS注射组之间、Na-HA注射组和不用药组之间比较,iNOS的表达差异无统计学意义。结论CMCTS能够明显抑制OA软骨i NOS的表达,Na-HA对OA软骨iNOS的表达没有显著下调作用。     

明胶、丝素-壳聚糖微载体培养肝细胞的比较研究

目的自制丝素-壳聚糖多孔微载体,在模拟微重力条件下接种培养肝细胞,并与多孔微载体Cultispher S上的细胞生长状况进行比较。方法油包水乳化后以冻干法制作丝素-壳聚糖多孔微载体。培养体积50ml,以旋转培养系统分别对接种至丝素-壳聚糖多孔微载体和Cuhispher S的CL-1细胞进行培养,并动态观察形态学、细胞计数,检测人源性白蛋白分泌和尿素合成功能。结果CL-1细胞在Cuhispher S上呈单层生长,在丝素-壳聚糖多孔微载体上呈现多层生长。第9天细胞计数结果达到峰值,丝素-壳聚糖多孔微载体的细胞密度可达到5．7×10^6个／ml,明显高于Cuhispher S组（P〈0．01）。自培养第10天起,丝素-壳聚糖多孔微载体组上清中的人源性白蛋白和尿素水平均明显高于Cuhispher S组（P〈0．01）。结论相对Cuhispher S,丝素-壳聚糖多孔微载体更适合在微重力条件下培养CL-1细胞。     

高脱乙酰度羧甲基壳聚糖对兔膝骨关节炎软骨诱导型一氧化氮合酶表达的影响

目的观察高脱乙酰度羧甲基壳聚糖(HD-CMC)经关节腔注射后对兔膝骨关节炎(OA)软骨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA和蛋白表达的影响,探讨其用于OA防治的机制及可能性。方法36只日本大耳白兔,行右侧膝关节前交叉韧带切断术(ACLT),术后随机分为2组,实验组于术后当天开始关节腔内注射2%HD-CMC 0．15mg/kg,每2周给药1次,对照组同一时间点关节腔内注射0．9%生理盐水0．15mg/kg。实验组与对照组于第6周分别随机处死大白兔各9只,剩余大白兔于第12周处死,对比两组大白兔股骨髁关节软骨的大体改变,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组织化学的方法检测iNOS在软骨中的mRNA和蛋白的表达。结果实验组退变软骨的大体评分轻于对照组,NOS的mRNA和蛋白表达水平均低于对照组。结论HD-CMC能够降低OA退变软骨iNOS的表达,并延缓软骨的退行性变,对OA退变软骨具有修复保护作用。     

壳聚糖支架上猪肝细胞的内源性逆转录病毒分泌

由于肝移植受供体短缺的限制,基于功能肝细胞的生物人工肝(BAL)有望成为等待肝移植患者的过渡性治疗手段,但已有的BAL临床试验结果并不理想.如何通过合适的支架材料提高肝细胞体外功能一直是该领域的研究热点[1].     

重型肝炎患者血浆对体外培养猪肝细胞的影响

有研究证实肝衰竭患者血浆或血清对体外培养的HepG2、HHY41细胞有毒性作用。现阶段生物人工肝临床研究的主要细胞材料为猪肝细胞，肝衰竭患者血浆对其毒性作用研究鲜见报道，因此研究旨在采用猪肝细胞，观察我国数量众多的慢性乙型病毒性重型肝炎患者血浆对其体外影响。     

羧甲基壳聚糖生物胶液负压滴灌治疗糖尿病足溃疡的疗效

目的:探讨羧甲基壳聚糖生物胶液负压滴灌治疗糖尿病足溃疡的临床疗效。方法:为前瞻性研究。收集2019年2月至2020年3月北京中医药大学东直门医院的60例糖尿病足患者,采用随机数字表法将患者分为试验组和对照组,各30例。对照组在基础治疗的同时采用生理盐水滴灌负压治疗,试验组采用羧甲基壳聚糖生物胶液进行滴灌负压治疗。治疗1...     

原代猪肝细胞无血清培养

目的研究原代猪肝细胞无血清培养及肝细胞的功能。方法采用EGTA和胶原酶P两步法经肝静脉逆行灌注分离乳猪肝细胞,在无血清培养基中培养,并对不同培养时间的肝细胞生化合成及生物转化功能进行检测。结果肝细胞产量为（1．5±0．1）×10^10／肝,活率为（90．3±1．5）％,接种培养后肝细胞增生旺盛,LDH漏出第2天达到高峰,然后逐渐下降并稳定于一定水平。随着时间的延长及肝细胞数量的增加,自蛋白合成及利多卡因转化率逐渐增加,呈时间及肝细胞数量的依赖关系。结论采用本法分离获取的猪肝细胞产率高、活性强、具有良好的生物合成及生物转化功能,可作为生物人工肝较理想的肝细胞来源。     

小干扰RNA特异性沉默CD44基因对羧甲基壳聚糖保护大鼠软骨细胞凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)沉默大鼠软骨细胞的CD44基因后对细胞CD44基因表达的抑制作用及对软骨细胞在羧甲基壳聚糖(CMCS)作用下细胞生物学特性变化及其作用机制.方法 构建针对CD44基因特异性的siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3),LipofectamineTM 2000转染软骨细胞.通过免疫荧光鉴定CD44基因特异性siRNA(CD44-siRNA)的转染情况,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法检测CD44-siRNA转染细胞中CD44基因及蛋白的表达情况;通过硝普钠诱导软骨细胞凋亡并通过流式细胞技术检测CMCS对硝普钠诱导正常及经CD44-siRNA转染软骨细胞凋亡的影响.采用单因素方差分析及SNK-q检验对结果进行统计学分析.结果 免疫荧光检测发现CD44-siRNA成功转染进入软骨细胞,转染率在60％左右.RT-PCR检测结果表明,转染siRNA-1后的24、48及72 h,与空白对照组(0.429±0.053,0.501±0.037,0.341±0.009)相比,CD44的mRNA表达明显减弱(分别为0.198±0.007,0.211±0.016,0.153±0.005;q=5.93,7.01,11.23; P＜0.01).蛋白印迹法检测表明转染siRNA-1后24 h,与空白对照组相比,CD44的蛋白表达明显减弱(0.231±0.064与0.675±0.113,q=13.09,P＜0.01).流式细胞检测结果表明3 mmol/L硝普钠可以成功诱导软骨细胞发生早期凋亡[(70±6)％];50、100、200μg/ml CMCS对硝普钠诱导的凋亡有一定的抑制作用[凋亡率分别为(51±7)％,(30±4)％,(15±4)％;q=5.08,6.97,9.73;P＜0.01];但CMCS对硝普钠诱导的CD44-siRNA-1转染的软骨细胞的凋亡抑制作用比未转染组明显减弱[凋亡率分别为(34±6)％和(15±4)％,q=6.95,P＜0.01 ].结论 CD44特异性siRNA-1转染体外培养的大鼠软骨细胞能显著下调CD44基因的表达;CD44基因在CMCS保护硝普钠诱导软骨细胞凋亡中发挥重要的作用.     

原代猪肝细胞的分离获取及培养

目的研究猪肝细胞的获取率、活率．观测普通培养过程中肝细胞形态变化过程．方法取用本地杂种小猪作为肝细胞供体．用Ｓｅｇｌｅｎ胶原酶二步灌注法,原位灌注分离获取肝细胞悬液,ＴＢ染色法计算细胞数及细胞活率．在含１００ｍＬ／Ｌ胎牛血清及其他附助因子的ＤＭＥＭ培养基中培养,光镜下观察培养过程中肝细胞形态变化过程,检测不同时期培养上清中清蛋白、尿素的浓度．结果平均猪肝重４３４ｇ,每只猪肝平均可获取２１８×１０１０个肝细胞,平均活力为９４６％．在ＤＭＥＭ培养基中普通培养可存活４ｗｋ～５ｗｋ,并具有生物活性．结论本方法分离获取肝细胞产率高、活性高,可作为人工肝较好的生物材料．     

树肝细胞的分离培养及其意义

本文采用体外简易两步灌流法和激素限定RPMI1640培养液对树鼯肝细胞进行分离与培养。结果显示：分离所获肝细胞总数约为1．8×108个,细胞存活率达94％,肝细胞贴壁伸展能力强,培养时间较长,2周内保持良好的形态特征。认为分离培养的树鼯肝细胞可用作肝病研究的体外细胞模型,有助于人肝炎病毒感染的进一步研究。     

微载体粘附培养的肝细胞腹腔内移植治疗急性肝功能衰竭大鼠的实验研究

目的　评价微载体粘附培养的肝细胞腹腔内移植对D 氨基半乳糖盐酸盐诱导的大鼠急性肝功能衰竭的治疗作用。方法　胶原酶灌注分离大鼠肝细胞 ,行Cytodex 3粘附培养 ,移植 1× 10 7个微载体粘附肝细胞至D 氨基半乳糖盐酸盐诱导的急性肝功能衰竭大鼠腹腔内 ,比较各组间生存率、肝功能及肝脏病理改变情况以评估疗效。结果　微载体移植组大鼠存活率明显高于空载体组 ,移植 5d后两组比较差异显著 (P <0 .0 5 ) ;空载体组大鼠肝功能及肝脏修复明显迟于微载体组。结论　微载体粘附培养的肝细胞腹腔内移植可对急性肝衰竭大鼠提供代谢支持作用 ,提高急性肝衰竭大鼠存活率。     

Uptake of albumin nanoparticle surface modified with glycyrrhizin by primary cultured rat hepatocytes

AIM: To investigate the uptake difference between bovine serum albumin nanoparticle (BSA-NP) and bovine serum albumin nanoparticles with their surface modified by glycyrrhizin (BSA-NP-GL) and to develop a novel hepatocyte targeting BSA-NP-GL based on active targeting technology mediated by specific binding site of GL on rat cellular membrane. METHODS: Calcein loaded bovine serum albumin nanoparticles (Cal-BSA-NP) were prepared by desolvation process. Glycyrrhizin was conjugated to the surface reactive amino groups (SRAG) of Cal-BSA-NP by sodium periodate oxidization, which resulted in calcein-loaded bovine serum albumin nanoparticles with their surface modified by glycyrrhizin (Cal-BSA-NP-GL). The morphology of the two types of prepared nanoparticles (NP) was observed by transmission electron microscopy. The diameter of NP was measured with a laser particle size analyzer. The interaction between Cal-BSA-NP-GL and primary cultured hepatocytes was studied through cellular uptake experiments. The uptake amount of Cal-BSA-NP-GL and Cal-BSA-NP by rat hepatocytes was determined by fluorospectrophotometry. Uptake characteristics were investigated through experiments of competitive inhibition of specific binding site of GL. RESULTS: Both Cal-BSA-NP-GL and Cal-BSA-NP had regular spherical surfaces. The average diameter of Cal-BSA-NP-GL and Cal-BSA-NP was 77 and 79 nm respectively. The uptake amount of the two NP by hepatocytes reached its maximum at 2 h after incubation. The uptake amount of Cal-BSA-NP-GL by rat hepatocytes was 4.43-fold higher than that of Cal-BSA-NP. There was a significant difference in the uptake of Cal-BSA-NP-GL and Cal-BSA-NP by hepatocytes (P<0.01). The uptake of Cal-BSA-NP-GL was inhibited when GL was added previously to isolated rat hepatocytes, and the uptake of Cal-BSA-NP was not affected by GL. CONCLUSION: A binding site of GL is present on the surface of rat hepatocytes, BSA-NP-GL may be internalized via this site by hepatocytes and can be used as a drug carrier for active targeting of delivery drugs to hepatocytes.     

库普弗细胞条件培养基对原代培养肝细胞的细胞毒性

目的 探讨内毒素血症时库普弗细胞激活对肝细胞损伤的作用机制.方法 用链霉蛋白酶和胶原酶原位灌流,Percoll密度梯度离心分离、纯化SD大鼠肝细胞和库普弗细胞,制备内毒素(LPS)刺激的库普弗细胞的条件培养基(KCCM)并作用于肝细胞,检测肝细胞培养基丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)的含量,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测KCCM对大鼠原代肝细胞活性的影响.结果 KCCM作用于肝细胞2 h后,肝细胞培养基中ALT、AST及LDH含量均明显升高(P＜0.05),在2～4 h内随时间延长ALT、AST及LDH含量均逐渐增加,呈明显的时间-效应关系;MTT结果显示,KCCM作用后12 h、24 h时间点对肝细胞具有明显损伤作用(P＜0.05).结论 内毒素诱导库普弗细胞释放的可溶性因子作用一定时间后可直接对肝细胞造成损伤.     

聚乳酸防粘连凝胶和透明质酸钠在预防术后肠粘连效果中的对比观察

目的：对比观察聚乳酸防粘连凝胶和透明质酸钠在预防腹部手术后肠粘连的效果,以指导临床用药。方法根据患者选择抗粘连药物的不同,将患者分为聚乳酸防粘连凝胶组（427例）和透明质酸钠组（429例）,于手术结束关腹前,分别涂以聚乳酸防粘连凝胶或透明质酸钠,观察患者术后体温恢复正常所需时间、肠管通气时间以及术后6个月内肠粘连的表现。结果所有患者中,术后均无药物过敏现象出现,无脓肿、肠瘘及其他不良反应发生,术后改善情况良好。观察术后1周患者发热时间、肠鸣音恢复时间、肛门排气时间,聚乳酸防粘连凝胶组均短于透明质酸钠组（ P＜0.01）。聚乳酸防粘连凝胶组在术后3个月和术后6个月发生肠粘连表现的例数也少于透明质酸钠组（ P＜0.05）。结论聚乳酸防粘连凝胶和透明质酸钠对腹部手术后预防肠粘连均有明显作用,聚乳酸防粘连凝胶预防粘连效果优于透明质酸钠。     

罗格列酮对环孢素A所致肝细胞毒性的保护作用

本实验拟用罗格列酮（RGZ）ZP预环孢素A（CsA）刺激下的大鼠肝细胞，观察其过氧化物酶体增殖物受体γ（PPARγ）、转化生长因子β1（TGFβ1）和纤维连接蛋白（FN）及丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）的表达，探讨RGZ对CsA肝毒性的保护作用。     

Effect of naphthalene acetic acid on proliferation and apoptosis of mice hepatocytes

ObjectiveTo investigate the effect of naphthalene acetic acid (NAA) on proliferation and apoptosis of mice hepatocytes.MethodsFifty mice were randomly divided into five groups: positive control, normal control, low, middle and high dose of NAA groups.Mice in low, middle and high dose of naphthalene acetic acid groups were fed with 200 mg/kg, 1 000 mg/kg and 5 000 mg/kg NAA animal food, respectively.Mice in positive control, normal control groups were fed with usual animal food.After 4 weeks, mice were sacrificed and liver was separated.Three days before scarification, mice in positive control group were given 20 mg/kg ascyclophosphami daily by intraperitoneal injection.The proliferative activity of hepatocytes was detected by MTT assay.The expressions of PCNA protein and Caspase-3 were measured by immunohistochemistry method.ResultsThe proliferative activities of mice hepatocytes in high dose group and normal control group were 0.794±0.019 and 1.055±0.019, respectively.The expressions of PCNA protein and Caspase-3 in high dose group were 11.2% and 37.9%, and those in the normal group were 33.1% and 6.3%, respectively.All differences were significant (P＜0.01).ConclusionHigh dose of NAA acid could significantly inhibit proliferation and increase apoptosis of hepatocytes in mice.     

白介素1受体拮抗剂壳聚糖纳米颗粒联合骨髓间充质干细胞移植治疗急性肝衰竭的实验研究

目的 探讨炎症因子白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)与骨髓间充质干细胞(MSCs)移植联合治疗肝功能衰竭的协同效应及其机制. 方法 采用静电喷射法制备IL-1Ra壳聚糖纳米颗粒,酶联免疫吸附法测定IL-1Ra纳米颗粒体外缓释作用,荧光显微镜和流式细胞术观察纳米颗粒肝细胞靶向性.将IL-1Ra纳米颗粒与MSCs联合治疗急性肝衰竭(ALF)幼猪,具体方法为:D-氨基半乳糖诱导建立猪ALF模型,34头中华实验小型猪随机分为5组,造模对照组经门静脉注射等渗盐水;IL-1Ra组经门静脉注射等渗盐水6h前耳背大静脉推注IL-1Ra;MSCs组经门静脉移植MSCs;IL-1Ra联合MSCs组和IL-1Ra纳米颗粒联合MSCs组先由耳背大静脉分别推注IL-1Ra或IL-1Ra纳米缓释颗粒,再经门静脉移植异体MSCs.移植后4周内定期检测肝功能、炎症因子变化和病理改变,并监测移植细胞体内存活、转化和分泌情况.组间数据比较用独立样本t检验.结果 IL-1Ra纳米颗粒在磷酸盐缓冲液中呈现缓慢释放过程;绿色荧光显示乳糖酰基化的纳米颗粒能特异性地靶向到肝细胞.IL-1Ra纳米颗粒联合MSCs组具有显著炎症环境改善作用,与对照组相比,肿瘤坏死因子α在术后1周即明显下降,而IL-6水平在各时间点均明显降低;且IL-1Ra纳米颗粒联合MSCs有促进肝功能恢复和肝脏细胞增殖的作用[术后第3周,每个200倍视野下的细胞数为(68.8±9.1)个,与对照组的(21.2±2.5)个相比,t=5.173,P＜0.01];免疫组织化学及荧光显微镜显示该组MSCs存活数量明显增多;Western blot结果显示该组分泌肝细胞生长因子及血管内皮生长因子较其余各组明显增多.结论 IL-1Ra乳糖酰基壳聚糖纳米颗粒具有良好的肝脏靶向和药物缓释作用,联合MSCs移植具有明显协同作用,通过改善炎症环境和分泌多种细胞因子显著改善D-氨基半乳糖诱导的ALF动物的肝功能指标,促进肝组织再生.     

表皮生长因子、神经降压素对四氯化碳损伤肝细胞钙离子及膜流动性的影响

目的 研究表皮生长因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ;ＥＧＦ）,神经降压素（ｎｅｕｒｏｔｅｒｓｉｎ,ＮＴ）对四氯化碳损伤的原代培养肝细胞Ｃａ＾２＋及膜流动性的影响。方法 以Ｆｕｒａ－２／ＡＭ和ＤＰＨ荧光探针测定肝细胞内游离钙和膜流动性,观察ＥＧＦ、ＮＴ对四氯化碳损伤后肝细胞这两个指标的影响。结果 ＥＧＦ、ＮＴ明显对抗肝细胞离钙和膜流动性、观察ＥＧＦ、ＮＴ对四氯化碳损伤后肝细胞这个