流式细胞分析技术在中医药研究中的应用

综述了流式细胞仪在中医疾病辨证分型中的作用及在中药研究领域中利用流式细胞仪检测中药对细胞周期、细胞 DNA含量及细胞增殖情况的影响和监测中药的临床疗效及相应细胞表型的变化 ,从多方面阐述了目前流式细胞分析技术在中医药研究中的地位和作用     

补肾、健脾、益气、活血法对衰老细胞周期基因表达的调控作用

目的：比较补肾、健脾、益气、活血法对衰老细胞周期基因表达的调控作用。方法：采用上述4种不同的含药血清对衰老的人胚肺二倍体成纤维细胞2Bs细胞株进行处理,通过细胞寿命实验、流式细胞仪、RT—PCR、Westemblot方法研究不同中药对衰老细胞周期及其相关基因(P16^INK4、Cyclin D1及PCNA)的mRNA转录和蛋白表达的影响。结果：补肾、益气中药对衰老细胞周期有一定的促进作用,并可下调衰老细胞增殖抑制基因P16和周期蛋白Cyclin D1的mRNA／蛋白表达;上调细胞周期促进增殖基因PCNAmRNA／蛋白的表达。而健脾、活血中药对细胞周期及其相关基因和蛋白表达的作用不明显。结论：补肾、益气方药对细胞周期有促进作用,其中的作用可能是通过促进P16途径的基因表达来实现。     

癌宁诱导体外人胃腺癌细胞SGC—7901凋亡及细胞周期分析

目的：探讨中药复方－－癌宁诱导人胃腺癌细胞凋亡的作用。方法：采用DNA电泳和流式细胞术,对中药复方－－癌宁诱导人胃腺癌细胞凋亡进行了研究。结果：经癌宁处理后的人胃腺癌细胞出现DNA梯状图谱,流式细胞术检测其凋亡是分数高达43．5％,而对照组既无DNA梯状图谱,又无凋亡峰。细胞周期分析表明,经癌宁处理后,细胞的增殖指数为33．7％,无细胞周期特异性。结论：癌宁在体外对人胃腺癌细胞具有诱导凋亡作用。     

柴胡皂苷-D抑制宫颈癌Hela细胞的分子机制研究

目的:宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一,严重影响女性健康。柴胡皂苷是中药柴胡抗炎、抗肿瘤等作用的主要成分,其中柴胡皂苷D效果尤为明显。研究探讨柴胡皂苷D对宫颈癌细胞的作用的分子机制。方法:采用CCK-8法检测柴胡皂苷D对Hela细胞增殖的影响,利用流式细胞仪检测柴胡皂苷影响Hela细胞凋亡和细胞周期,同时利用定量PCR法检测细胞周期及凋亡相关基因的表达水平。结果:与对照相比,柴胡皂苷D能够显著抑制Hela细胞的增殖(P0.01),通过流式细胞检测,发现柴胡皂苷D能够增加细胞凋亡比例(P0.05),将Hela细胞阻滞在细胞周期G1期。进一步实验发现,柴胡皂苷D能够降低周期素Cyclin D1和Cyclin E,进而影响细胞周期;同时增加凋亡促进基因Bax表达,降低凋亡抑制基因Bcl-2基因表达,从而影响细胞凋亡。结论:柴胡皂苷D通过周期蛋白阻滞Hela细胞周期停滞在G1期,通过影响凋亡相关蛋白诱导Hela细胞凋亡。     

子宫颈癌关键生物标记物的生物信息学探索及对中药抗肿瘤治疗的启示

目的:从生物信息学角度探索与子宫颈癌(CC)相关的生物标记物,为早期诊断提供依据;同时为中医药治疗提供生物信息学证据并为中药治疗的靶点探索提供方向。方法:从基因表达综合数据库(GEO)中检索和下载CC微阵列数据集,鉴定差异表达基因(DEGs)。采用STRING数据库构建宫颈癌DEGs蛋白-蛋白相互作用网络图(PPI网络)。利用Cytoscape中的MCODE识别PPI网络中最显著模块获得hub基因,并使用DAVID数据库对其进行GO分析和KEGG分析。此外,复习当今中医药治疗CC的机制研究,与生物信息学预测的生物标记物进行对比分析,从生物信息学角度验证其有效性。结果:共得到3个微阵列数据集(GSE63514、GSE7410、GSE7803),与非癌组织比较,CC组织中有65个DEGs,其中hub基因15个(degree>10)。GO分析和KEGG分析显示,这些基因的生物学功能主要富集于细胞分裂、细胞周期和DNA复制等。复习当今文献发现许多中药能作用于上述标记物,可从细胞周期阻滞、干扰DNA复制等途径干预肿瘤的发展,与生信分析结果相一致。此外还有一些生物标记物缺少动物、细胞或人体实验的验证,是未来中药抗肿瘤药物的研究方向。结论:微阵列分析可预测早期诊断CC的标记物,为中药的抗肿瘤功效提供生信依据,并为未来中药抗肿瘤的研发提供方向。     

含中药血清对血管内皮细胞生长因子诱导的人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的：探讨含中药血清对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。方法：通过在4代人脐静脉内皮细胞的培养液中加入血管内皮细胞生长因子和含中药血清，应用流式细胞仪分析其细胞周期，结果。含中药血清可以降低细胞周期中S期细胞的数目，抑制细胞的DNA合成，尤以高剂量含中药血清作用明显，结论：含高剂量中药的大鼠血清有抑制血管内皮细胞生长因子诱导内皮细胞增殖的作用。     

多球壳菌素诱导系膜细胞凋亡及对细胞周期调节蛋白基因表达谱的影响

目的观察多球壳菌素(ISP-1)对体外培养的正常大鼠肾小球系膜细胞(GMC)的促凋亡作用,研究ISP-1对细胞周期调节蛋白基因表达谱和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达的影响。方法体外培养大鼠GMC,加入100μmol/L ISP-1干预,分别于作用6、12、24、48 h后以流式细胞术检测GMC凋亡,Hoechst33258/PI染色观察凋亡细胞形态变化,琼脂糖DNA凝胶电泳法观察凋亡细胞核小体DNA的断裂现象,并通过SuperArray Real-Time PCR细胞周期基因芯片测定ISP-1对细胞周期调节蛋白基因表达谱的影响,Western blotting法观察Bax和Bcl-2蛋白的表达。结果ISP-1可显著诱导GMC凋亡,并呈一定的时间依赖性,作用48 h后细胞凋亡最显著,Hoechst33258/PI荧光染色法可见亮蓝色的凋亡小体,琼脂糖凝胶电泳可见凋亡梯度的出现;PCR细胞周期基因芯片检测结果发现ISP-1可显著上调GMC Rad51、Atm、Brcal、Caspase3、cyclinA2、cyclinC、chek1、cyclinB1、cyclinB2、cyclinD2、cyclinF、Cdc25a和P27等一些与DNA损伤、凋亡和细胞周期调节蛋白相关的基因的表达;Western blotting发现ISP-1可显著上调GMC Bax蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达。结论ISP-1可时间依赖性诱导体外培养的正常大鼠GMC凋亡,其机制与影响细胞周期调节蛋白及凋亡相关基因的表达有关。     

雷氏大疣蛛毒素对人肝癌细胞SMMC-7721细胞增殖及细胞周期的影响

目的 探讨雷氏大疣蛛Macrothele raveni毒素对人肝癌细胞SMMC-7721增殖及细胞周期的抑制作用，进一步探讨其作用的分子机制。方法 采用MTT法测定雷氏大疣蛛毒素对SMMC一7721细胞增殖作用的影响；采用[^3H]TdR掺入法检测雷氏大疣蛛毒素作用前后SMMC7721细胞DNA合成的变化；采用流式细胞术（FCM）探讨雷氏大疣蛛毒素对SMMC-7721细胞凋亡率和细胞周期的影响；采用Western Blot方法研究雷氏大疣蛛毒素对细胞周期相关c-myc蛋白表达的影响。结果 MTT方法表明雷氏大疣蛛毒素对SMMC-7721细胞增殖有较强的抑制作用（P〈0．05），时效和量效关系良好。雷氏大疣蛛毒素可以抑制SMMC-7721细胞DNA的合成。流式细胞仪检测结果发现雷氏大疣蛛毒素作用后SMMC-7721细胞凋亡率增加，细胞周期阻滞在G2／M期。Western Blot方法进一步检测到雷氏大疣蛛毒素作用SMMC7721细胞72h后，c-myc蛋白表达减弱。结论 雷氏大疣蛛毒素可以抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖和DNA的合成，其机制可能是诱导细胞凋亡，使细胞周期相关c-myc蛋白表达减弱，导致细胞周期的变化。     

葛根素对人小细胞肺癌H446细胞周期和相关周期蛋白表达的影响

目的观察葛根素诱导人小细胞肺癌H446细胞周期的阻滞作用,进一步探讨其作用机制。方法采用MTT法测定葛根素对H446细胞生长的影响;采用流式细胞术检测处理后H446细胞周期分布和周期蛋白cyclinD1、CDK4和P27表达水平。结果MTT法表明葛根素对H446细胞生长有较强的抑制作用;流式细胞仪检测结果发现细胞周期阻滞在G0/G1期,量效关系良好,并检测到细胞周期蛋白cyclin D1、CDK4表达减弱,P27表达增强。结论葛根素可通过诱导细胞周期阻滞而发挥体外抗肺癌作用,其机制可能涉及细胞周期相关蛋白cyclin D1、CDK4和P27表达的调控。     

复方中药对辐射小鼠细胞周期及免疫功能的影响

目的 :研究复方中药对辐射小鼠细胞周期及免疫功能的影响。方法 :应用流式细胞仪 (FCM)检测脾脏细胞周期和免疫参数 (NK,CD+4 ,CD+8)。结果 :该复方中药能使受照小鼠脾细胞 S,G2 + M期的比例升高 ,促进脾细胞增殖 ,并能提高N K细胞活性和 CD+4 百分率及 CD+4 / CD+8比值。结论 :复方中药对辐射损伤细胞具有一定的保护作用     

Induction of apoptosis in human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells in vitro by flavonoids from Astragalus complanatus

Aim of the study

Flavonoids extracted from the seeds of Astragalus complanatus R.Br. reduce the proliferation of many cancer cells. The present study was carried out to evaluate the effects of these flavonoids from Astragalus complanatus (FAC) on human hepatocarcinoma cell viability and apoptosis and to investigate its mechanisms of action in SMMC-7721 cells.

Materials and methods

Cell viability was measured using the MTT assay. To detect apoptotic cells, SMMC-7721 cells treated with FAC were stained with Hoechst 33258 and subjected to agarose gel electrophoresis. Quantitative detection of apoptotic cells was performed by flow cytometry. The effects of FAC on apoptosis and cell cycle regulatory genes and proteins in SMMC-7721 cells were examined using an S series apoptosis and cell cycle gene array and Western blot analysis.

Results

The growth of SMMC-7721 and HepG2 cells was inhibited by treatment with FAC. Cell death induced by FAC was characterized by nuclear condensation and DNA fragmentation. Moreover, the cell cycle was arrested in the G0/G1 and S phases in FAC-treated SMMC-7721 cells. A sub-G1 peak with reduced DNA content was also formed. The activity of caspase-3 was significantly increased following FAC treatment. Microarray data indicated that the expression levels of 76 genes were changed in SMMC-7721 cells treated with FAC: 35 genes were up-regulated and 41 were down-regulated. Western blot analysis showed that caspase-3, caspase-8, Bax, P21, and P27 protein levels in SMMC-7721 cells were increased after 48 h of FAC treatment, while cyclinB1, cyclinD1, CDK1, and CDK4 protein levels were decreased.

Conclusions

These results suggest that FAC may play an important role in tumor growth suppression by inducing apoptosis in human hepatocarcinoma cells via mitochondria-dependent and death receptor-dependent apoptotic pathways.     

槲皮素对SMMC-7721肝癌细胞PI3K/AKT信号通路影响的探讨

目的:观察槲皮素( quercetin)对人肝癌细胞SMMC-7721增殖与细胞凋亡的影响,探讨其对SMMC-7721细胞PI3K/AKT信号通路的影响.方法:采用MTT法检测槲皮素对SMMC-7721细胞生长的抑制,流式细胞术检测细胞周期变化,Western blot检测槲皮素对SMMC-7721细胞PI3K/AKT信号通路凋亡相关蛋白表达的影响.结果:槲皮素抑制SMMC-7721肝癌细胞增殖作用明显,且呈浓度和时间依赖性.顺铂和槲皮素40,80,160,320 μmol·L-148 h抑制率分别为62.19％,25.47％,27.18％,36.96％,51.28％.流式细胞术结果提示,槲皮素80,160,320μmol ·L -可使SMMC-7721肝癌细胞周期阻滞于G0/G1期.Western blot凋亡相关蛋白表达检测表明,药物组AKT的表达受抑制,PTEN,Caspase-9蛋白的表达率随着药物浓度的增加而增加.结论:槲皮素能诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡,其机制可能是使肝癌细胞SMMC-7721周期阻滞于G0/G1期,PTEN的过表达抑制AKT活化,激活Caspase-9从而促进细胞凋亡.     

红豆杉细胞提取物对癌细胞的抑制作用研究

目的：了解红豆杉细胞提取物对肝癌细胞系SMMC—7721生长的影响。方法：运用MTT比色法测定癌细胞的存活率和流式细胞仪分析细胞周期。结果：红豆杉细胞二氯甲烷提取物对癌细胞SMMC—7721的抑制作用远大于甲醇提取物，IC50值分别为0．0834mgDCWW．m1^-1和0．8002mgDCW．m1^-1；流式细胞仪分析发现外加红豆杉细胞二氯甲烷提取物后肝癌细胞G2／M期含量增加。结论：红豆杉细胞提取物在体外对肝癌细胞SMMC—7721的生长通过诱导凋亡而具有抑制作用。     

β-谷甾醇、豆甾醇诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡

目的研究β-谷甾醇、豆甾醇诱导人肝癌细胞SMMC-7721的凋亡作用。方法 MTT法观察β-谷甾醇、豆甾醇对细胞增殖的抑制作用;激光共聚焦显微镜观察细胞形态变化;用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率、细胞内活性氧ROS、钙离子Ca2+含量、线粒体膜电位ΔΨm变化。结果β-谷甾醇、豆甾醇均明显抑制SMMC-7721细胞增殖,使细胞形态发生典型凋亡变化,凋亡率和细胞内Ca2+、ROS的含量均显著增加,线粒体膜电位降低。β-谷甾醇使细胞周期阻滞在G2/M期,而豆甾醇则同时阻滞在S期和G2/M期。结论β-谷甾醇、豆甾醇具有抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖和诱导细胞凋亡的作用。     

抗癌扶正方对人肝癌细胞SMMC-7721的Bcl-2基因表达的调控作用

目的:研究与分析抗癌扶正方对人肝癌细胞SMMC-7721的Bcl-2基因表达的调控作用.方法:首先培养人肝癌细胞SMMC-7721,然后使用噻唑蓝比色法(MTT比色法)检测抗癌扶正方对人肝癌细胞SMMC-7721增殖能力,使用流式细胞仪检测人肝癌细胞SMMC-7721抑制能力和Bcl-2基因表达水平.结果:通过检测发现...     

镰形棘豆诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡及初步的机制研究

目的:观察镰形棘豆总黄酮对人肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响及初步的机制探讨.方法:不同剂量的镰形棘豆总黄酮处理SMMC-7721细胞24 h后,MTT法观察总黄酮对细胞增殖的抑制作用;应用光学和荧光显微镜观察总黄酮对SMMC-7721细胞形态的影响;应用流式细胞仪检测SMMC-7721细胞周期的变化;Annexin V-FITC/PI双染法检测总黄酮对SMMC-7721细胞凋亡的影响.结果:MTT实验结果表明,镰形棘豆总黄酮抑制SMMC-7721细胞的增殖,并呈现出一定的浓度依赖性.Hoechst33258染色结果显示,经镰形棘豆总黄酮处理的细胞出现了多种凋亡特征和超微结构的变化.镰形棘豆总黄酮作用SMMC-7721细胞后可观察到G1期细胞明显增多,凋亡细胞的比例升高,并且呈浓度依赖性.结论:镰形棘豆总黄酮抑制SMMC-7721细胞的增殖,与其诱导细胞周期阻滞和使细胞形态发生变化而引起细胞凋亡的活性有关.值得进一步深入研究和阐述镰形棘豆抗肿瘤的作用机制.     

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??OBJECTIVE To investigate the apoptosis effect of human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 induced by dihydroartemisinin in vitro and the possible mechanism. METHODS After treatment with 25, 50, 100, 200, and 400 ??mol??L^-1 dihydroartemisinin for 24 h. The proliferation inhibitory effect of dihydroartemisinin on SMMC-7721 cell was detected by MTT assay. Cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry. The change of apoptotic morphology was detected by confocal laser scanning microscopy. Rho 123 staining method was used to detect the changes of mitochondrial membrane potential. Western blot was used to detect expression of Bcl-2, Bax, Cleaved Caspase-3, Cleaved Caspase-9 and Cyto C. RESULTS MTT results showed that 25-400 ??mol??L^-1 dihydroartemisinin can inhibit the proliferation of SMMC-7721 cells obviously. The cell cycle detection results of flow cytometry showed that dihydroartemisinin could block SMMC-7721 cell cycle in G₂/M phase. The results of Hochest 333258 staining showed that the nuclei were heterogeneous, condensed and fragmented in the DHA treatment group. The cell apoptosis detection results of flow cytometry showed that the apoptosis rate of dihydroartemisinin treated groups were increased obviously (P<0.01). The results of Rho 123 staining showed that the mitochondrial membrane potential was decreased significantly (P<0.01). Western blot results showed that the expression of Bcl-2 was down-regulated, expression of Bax was up-regulated, the ration of Bax/Bcl-2 was increased and the expression of Cleaved Caspase-3, Cleaved Caspase-9 and Cyto C were up-regulated. CONCLUSION Dihydroartemisinin can induce apoptosis of SMMC-7721 cells, on the mechanism of apoptosis may be related to mitochondrial pathway.     

镰形棘豆提取物抗肝癌的体内外活性研究

目的：探讨镰形棘豆提取物的体内外抗肝癌活性,并探讨其可能的机制。方法：采用MTT法检测镰形棘豆提取物对SMMC-7721细胞的增殖抑制,采用PI单染法和AnnexinV-FITC／PI双染法进行流式细胞仪检测,测定细胞周期和凋亡率,观察H22荷瘤小鼠的体内肿瘤抑制作用。结果：MTT实验表明,镰形棘豆提取物EOOF和FOF有效抑制肿瘤细胞SMMC-7721的增殖,并呈一定的剂量依赖性,其IC50值分别为0．115和0．097mg·mL^-1。TFOF作用SMMC-7721细胞后可使细胞周期停滞于G1期,凋亡细胞的比例升高,并且呈浓度依赖性。镰形棘豆提取物FOF能明显抑制H22荷瘤小鼠肿瘤的生长,低、高剂量组的抑制率分别为56．1％和70．8％（P〈0．01）。结论：镰形棘豆提取物FOF能抑制SMMC-7721细胞的增殖,诱导其凋亡,并对H22荷瘤小鼠有肿瘤生长抑制作用。显示镰形棘豆具有较好的发展为抗肝癌药物的前景。     

牛樟芝提取物对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响

目的:研究牛樟芝提取物(ANCA-E-D)抑制人肝癌细胞SMMC-7721增殖的作用,揭示其可能机制。方法:取对数生长期人肝癌细胞SMMC-7721,以6×104/m L接种于96孔板,每孔100μL,随机分为调零组、空白对照组、溶剂对照组以及20,40,60 mg·L-1ANCA-E-D药物组,每组设5个复孔,分别作用24,48,72 h,采用MTT比色法检测ANCA-E-D对SMMC-7721细胞增殖的影响;通过瑞氏染色观察以上浓度的ANCA-E-D对肝癌细胞SMMC-7721形态学的影响;通过流式细胞仪检测以上浓度的ANCA-E-D对SMMC-7721细胞周期和早期凋亡的影响。结果:MTT实验结果表明,20,40,60 mg·L-1的ANCA-E-D对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖具有显著的抑制作用(P0.05),呈时间和剂量依赖性,其半数致死率(IC50)分别为31.21,24.12,21.48 mg·L-1;形态学观测结果提示,ANCA-E-D药物组的细胞核碎裂、凋亡小体形成;流式细胞仪检测发现,不同浓度的ANCA-E-D作用后,SMMC-7721细胞凋亡以晚期凋亡为主,并呈剂量依赖性。结论:ANCA-E-D可抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖,可能与其诱导SMMC-7721细胞凋亡有关。