长白山白眉蝮蛇毒类凝血酶的分离纯化

目的 建立一种分离纯化长白山白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的方法.方法 将长白山白眉蝮蛇蛇毒溶解后离心,取上清进行阴离子交换层析,所得蛋白进行分子筛层析.提纯的蛋白用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定及相对分子量测定.测定酶的N-末端氨基酸序列.结果 经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳呈单一区带,相对分子量为35.5kDa.N-末端氨基酸序列分析表明其N-末端氨基酸序列与立止血中巴曲酶N-末端氨基酸序列基本一致.提取率约为5mg类凝血酶/g蛇毒.结论 用上述方法可制得高纯度的类凝血酶.     

A novel peptides, like nerve growth factor, inducing pheochromocytoma PC12 cell differentiation

目的:根据NGF的氨基酸序列及其晶体构象资料,对NGF-β进行限制性酶解,从而获得关键的功能区域片段.方法:选择CNBr在9位Met处, Trypsin在Arg或Lys处裂解NGF-β,用 Sephadex G50层析、DE52离子交换层析和反相高压液相层析进行分离纯化.所得肽片段用PC12细胞测定活性,对活性片段进行氨基酸组成分析及氨基酸序列分析.结果:从NGF-β裂解片段中获得一可诱导PC12细胞分化的活性片段,氨基酸组成分析及氨基酸序列分析此片段由16肽GEFSVCDSVSVWVGDK与14肽HWNSYCTTTHTFVK通过一对二硫键连接而成,与NGF-β肽链的10～25和75～88氨基酸残基序列相对应.生物活性分析表明其最佳作用浓度为0.001～0.1 μg*L-1.结论:本实验获得了NGF-β关键的功能区域片段.虽然其空间结构和其功能的关系尚需研究探讨,但它的成功分离和鉴定为合成或表达高活性小分子神经营养物质奠定了关键的基础.     

大鼠肝脏再生增强因子cDNA的克隆及其序列分析

目的：克隆大鼠肝脏再生增强因子（ALR）cDNA,并对其序列进行分析。方法：建立大鼠2/3肝切除模型,从再生肝组织中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增出大鼠ALRcDNA,亚克隆于pGEM-T载体,并将DNA序列及其推测的氨基酸序列与Genebank作同源性比较。结果和结论：克隆到大鼠ALRcDNA,经核苷酸序列测定证实序列完全正确,其核苷酸序列没有任何突变,它与酵母ERV1cDNA有较高的同源性,核苷酸序列同源性达54.99％,氨基酸序列同源性达47.01％,并发现氨基酸序列中含有锌指蛋白结合区域。     

用噬菌体展示技术分析G-CSF受体的配体结合位点

目的：分析粒细胞集落刺激因子（G－CSF）受体中参与配体结合的关键性氨基酸残基。方法：以G－CSF为靶分子，对随机噬菌体文库进行筛选，阳性噬菌体克隆进行序列测定并与G－CSF受体进行同源性比较和分析。结果：得到一个保守性的序列模式SXXRVX，其中第4位氨基酸是高度保守的Arg，表明Arg在与G－CSF的结合中可能起重要作用。将此模式与G－CSF受体进行同源性比较和序列分析，发现G－CSF受体中第288位的Arg也是参与配体结合的关键性氨基酸。结论：模拟小肽和G－CSF 体中高度保守的Arg的存在，说明Arg在G－CSF受体与其配体的结合中起重要作用。     

心肌生长刺激因子的分离、纯化及生化鉴定

目的：从人胚胎心室肌细胞中提出了一种在体外可刺激Wistar小鼠原代心肌细胞DNA合成并具有生物活性的纯化物质，称之为心肌生长刺激因子(Myocardium Growth timulating Factor，MGSF)。方法采用硫酸铵分级离法、阴离子纤维素交换层析、高压液相色谱洗脱、SDS-PAGE、毛细管电泳、高压液相色谱分离及生化鉴定。结果：该物质分子量为3．7KDa，含有17种氨基酸，同最新的蛋白质氨基酸序列文库扫描进行同源性分析，并确定此序列可能为一种新的氨基酸序列；并对其进行了生化鉴定，其临床意义正在进一步研究这中。结论：该研究结果初步表明，MGSF可能为急性缺血性心脏病提供有效的药物治疗开辟了一条新的思路。     

致倦库蚊防御素基因的克隆与生物信息学分析

目的:获取致倦库蚊(贵阳株)防御素基因CxDefensin全长编码序列.方法:采用RT-PCR方法扩增致倦库蚊(贵阳株)CxDefensin开放阅读框(ORF)序列,并通过生物信息学方法分析其核苷酸和蛋白质序列.结果:CxDefensin ORF序列全长300 bp,编码99个氨基酸,包含1个内含子,蛋白质分子量是10.58 kDa,等电点为6.52.CxDefensi蛋白与其他昆虫的defensin蛋白具有同源性.结论:所获致倦库蚊(贵阳株)防御素基因CxDefensin归属昆虫防御素基因家族,为昆虫β型防御素.     

广西眼镜蛇毒中Natrin蛋白的分离及纯化

目的:从广西眼镜蛇毒中分离出Natrin蛋白.方法:广西眼镜蛇毒经SephadexG75凝胶、CM Sepharose CL-6B离子交换层析及FPLC mono-S柱层析分离纯化出Natrin蛋白.结果:从广西眼镜蛇蛇毒中分离纯化得到的Natrin蛋白,经SDS-PAGE电泳测定其分子量为25 ku,质谱测定其分子量...     

蛋白印迹法人血清DNA结合蛋白的测定

利用蛋白印迹法(Western blot)原理建立了检测人血清DNA结合蛋白的一种较特异性方法,发现在成人血清中有7 种Lambda DNA结合蛋白,分子量为:90kDa、67kDa、43kDa、30kDa、24kDa、22kDa和17kDa。在婴儿血清中没有30kDa、24kDa和22kDa这3种LambdaDNA结合蛋白。在人的血清中有二种小牛胸腺DNA结合蛋白,分子量为:43kDa和17kDa。血清中有四种与正常成人血浆DNA结合的蛋白质,分子量分别为:67kDa、43kDa、30kDa和24kDa,其中30kDa的这种蛋白质与正常成人血浆DNA的结合力较弱,并在一些正常个体中未见到此带。     

孕血清中早孕因子的分离纯化

目的:通过离子交换层析和亲和层析的分离方法从孕血清中得到纯化的早孕因子(EPF),为进一步制备单克隆抗体做准备。方法:采用依次经过DEAE52阴离子交换层析,SP Sepharose F.F阳离子交换层析,Con ASepharose4B亲和层析和Heparin Sepharose Cl6B亲和层析分离纯化方案,最终得到具有早孕因子活性的Hepa-rin-Ⅱ成分,早孕因子活性采用活性玫瑰花环抑制实验检测,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯化物。结果:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示两条带,相对分子量分别为46.30kDa和10.71kDa。结论:经过四步层析得到较纯的EPF样品,并认为EPF在血清中可以以单体和多聚体形式存在。     

兔源内毒素结合蛋白的提取纯化及体外生物学活性研究

目的　从烧伤合并内毒素血症损伤兔的血清中分离纯化出内毒素结合蛋白 (Lipopolysaccharide BindingProteinLBP) ,以研究LBP在烧伤复合内毒素血症中的作用。方法　兔血清中蛋白质通过二步离子交换层析 (Bio Rex 70Resin、Mono Q)及凝胶过滤来分离纯化 ,并经流式细胞分析实验、绵羊红细胞凝聚实验、氨基末端氨基酸残基测序等方法鉴定 ,再将LBP作用于体外培养的人单核细胞 (U93 7) ,观测其分泌TNFα等细胞因子的状况。结果　获得一种分子量为 60× 10 3蛋白质 ,其N端 10个氨基酸序列为TNPGLITRIT ,与NCBI蛋白质库中有关兔的氨基酸序列进行比较 ,发现其与LBP的序列相同 ,它能促进脂多糖 (LipopolysaccharideLPS)与外周血单核细胞 (PBMC)结合 ,并能促进U93 7在极低浓度的LPS用下分泌TNFα。结论　从血清中分离纯化带有生物活性、全长LBP是可行的 ,LBP能促进极低浓度的LPS与单核细胞结合 ,介导炎性因子的分泌 ,从而促进炎症反应的发生。     

Identification and partial purification of an Entamoeba histolytica membrane protein that binds fibronectin.

A 37 kDa protein has been described as a putative receptor for fibronectin (Fn) on E. histolytica trophozoites (1). We have now identified a membrane protein that binds biotinylated fibronectin (BFn) with an apparent molecular weight of 140 kDa. Using BFn we were able to follow this protein during partial purification through DEAE-cellulose and Fn-Sepharose chromatography. Antisera prepared against a peptide corresponding to the deduced amino acid sequence for the putative receptor binding site for human Fn (2) recognized a protein with the same molecular weight. The purified protein was also recognized by this sera. We propose that this protein may function as a Fn receptor and will explore the possibility for it being an integrin.     

Purification and partial characterization of an hemolytic activity from Entamoeba histolytica.

It is generally accepted that hydrolytic and cytolytic amebic components are involved in the pathogenic mechanisms of E. histolytica. We have now identified a lytic activity in two membrane proteins of 23.5 kDa and 25 kDa, which are able to lyse rat erythrocytes. The activity was purified from total homogenates of the virulent strains HM1:IMSS and HM38:IMSS, and the erythrocyte lysis was directly related to protein concentration. The hemolytic activity was heat-sensitive and resistant to reduction by 2-mercaptoethanol. Total amino acid analysis of pure proteins showed a high hydrophobic amino acid content: 36% for 23.5 kDa and 50% for 25 kDa. This hemolytic activity could be related, along with other amebic factors, to tissue damage.     

Carbonic anhydrase III in liver and muscle of male rats purification and properties

Cytosolic carbonic anhydrases CAI, CAII, and CAIII from liver, and CAII, and CAIII from muscle of adult male Sprague-Dawley rats were purified to homogeneity. CAIII from liver and muscle had the same amino acid composition and were immunochemically similar. Their kinetic properties at 0 degrees C were also similar. Km(CO2) was 4 mM and kcat 3x105 s(-1). Ki was 0.4 and 0.2 M for acetazolamide and NaCl, respectively. Both CAIIIs ran as single bands on SDS-electrophoresis and high-speed centrifugation, with a mol wt of 29.3 kDa. Their hydrodynamic properties suggest that CAIII is a compact, nearly spherical molecule. It contained 0.9 M zinc per M protein. In both tissues isoelectric focusing identified neutral and acidic isoforms with pIs near 7.0 and 6.3, respectively. These forms were immunologically identical and had the same amino acid composition and mol wts. The acidic forms probably represent subspecies of CAIII in different states of oxidation. CAIII is the major soluble protein in rat liver and muscle. Its function is probably to protect proteins of these tissues from oxidation catalyzed by iron-containing degradation products of haemoglobin and myoglobin. Liver CAI and CAII and muscle CAII were identical to CAI and CAII of rat erythrocytes.     

慢病毒介导ATP7B基因转染对骨髓间充质干细胞在高铜环境中生存能力的影响

目的:探讨慢病毒转染ATP7B基因能否提高骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,MSCs)在高铜环境中的生存能力?方法:全骨髓贴壁法培养Wilson病模型LEC大鼠的MSCs;构建含有ATP7B基因的慢病毒载体pWPT-ATP7B及对照慢病毒载体pWPT-GFP并转染MSCs,获得表达ATP7B基因的MSCsATP7B 细胞及对照组MSCsGFP细胞?利用细胞免疫荧光?Real-time PCR?Western blot长期监测ATP7B基因表达;并以HepG2细胞系作为阳性对照,利用SRB法监测给予不同浓度铜离子处理的干细胞增殖情况?结果:MSCs CD90?CD29表达阳性,CD45?CD11b表达阴性;细胞免疫荧光?Western blot及RT-PCR显示MSCsATP7B细胞的ATP7B基因能够长期稳定表达;SRB结果显示,高铜环境中MSCsATP7B细胞的生存能力显著高于MSCsGFP细胞及HepG2(P < 0.05)?结论:ATP7B基因修正的LEC大鼠MSCs可有效对抗铜蓄积损害,为Wilson 病的治疗提供可能的新方法?     

树鼩载脂蛋白AI cDNA的克隆及其组织表达

目的克隆不易感动脉粥样硬化动物树（ｔｒｅｅｓｈｒｅｗ,ＴＳ）载脂蛋白ＡＩ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＡＩ,ａｐｏＡＩ）的基因,比较分析其结构特点。方法以提取的肝组织ｍＲＮＡ为模板,反转录构建了ＴＳ肝组织ｃＤＮＡ文库。利用制备的兔抗ＴＳ载脂蛋白ＡＩ多抗血清为探针筛选该文库,对阳性克隆进行测序、序列分析及组织表达实验。结果克隆获得了ＴＳａｐｏＡＩｃＤＮＡ序列,全长序列由９００个核苷酸构成,包括２８ｂｐ组成的５′非翻译区;７９５ｂｐ组成的一个完整开放阅读框架,编码翻译２６５个氨基酸的ＴＳａｐｏＡＩ前体（含１８个氨基酸构成的信号肽、６个氨基酸的原肽片段及２４１肽的成熟蛋白）;两个终止密码ＴＧＡ、ＴＡＡ和随后７２ｂｐ的３′非翻译区。新基因已被ＧｅｎＢａｎｋ接受。对编码蛋白质的亲疏水性分析表明ＴＳａｐｏＡＩ的疏水性强于人的相应蛋白。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ显示ＴＳａｐｏＡＩ基因主要在肝脏和小肠组织表达。结论获得了不易感动脉粥样硬化动物ＴＳａｐｏＡＩ的新基因,编码的蛋白质结合胆固醇及胆固醇酯的能力可能大于人的ａｐｏＡＩ。     

北京鸭载脂蛋白AI cDNA的克隆及其组织表达

目的:克隆不易感动脉粥样硬化动物北京鸭载脂蛋白AI的基因。方法:分离提取北京鸭肝组织mRNA,以此为模板,反转录构建了鸭肝组织cDNA文库。利用制备的兔抗鸭载脂蛋白AI(apoAI)多抗血清为探针筛选该文库,获得10个阳性克隆,测序及序列分析。结果:包括18bp、240bp组成的5’和3’非翻译区,792bp组成的一个完整开放阅读框架,编码264个氨基酸的鸭apoAI前体,含18个氨基酸构成的信号肽、6个氨基酸的原肽片段和240肽的成熟蛋白。推译出的成熟肽与鸭apoAI氨基酸的直接测序结果完全一致。该新基因已被GenBank接受。Northern blot显示鸭apoAI mRNA不仅主要在肝和小肠组织表达;而且不同于人和哺乳类动物,亦可少量在脑、肾、肌肉组织分布。结论:结果为进一步研究不易感动脉粥样硬化动物北京鸭apoAI基因组结构、功能及其抗动脉硬化机制奠定了基础。     

大鼠肝非实质细胞载脂蛋白CⅢ结合位点（受...

Binding sites of apolipoprotein (apo) C III on non-parenchymal cells (NPC) isolated from rat liver were found. Apo C III was purified from delipided human plasma very low density lipoproteins. 125I-labeled-apo C III was prepared by chloramine-T method. Non-parenchymal cells were isolated from rat liver by collagenase method. Freshly isolated rat liver NPC bound 125I-labeled apo C III in a saturable way with Kd 0.1-0.55 mumol/L and Bmax 18.1-42.0 ng/ml cell protein. There were about 1.0-4.5 x 10(5) specific binding sites of apo C III on each NPC. Unlabeled apo C III, but not apo AI and B100, could inhibit these binding activities. The results demonstrate the presence of saturable and specific apo C III receptors (binding sites) on rat liver NPC, but their nature and biologic properties remain to be investigated.     

大豆饼粕制备复合氨基酸铜螯合物

目的：制备复合氨基酸铜螯合物。方法：以大豆饼粕为原料，采用硫酸水解制备复合氨基酸。再与微量元素Cu络合。结果与结论：红外光谱数据证实了复合氨基酸铜螯合物的生成。废物充分利用，工艺简单易行。     

肠上皮细胞中大肠杆菌侵袭素IbeA结合蛋白的分离

目的分离肠上皮Caco-2细胞中与IbeA相互作用的蛋白。方法表达并纯化重组IbeA,将1、5、10μg/ml的His-IbeA及牛血清白蛋白与Caco-2单层细胞4℃孵育30min后,在37℃利用庆大霉素保护实验测定各组大肠杆菌K1致病株E44侵袭率的变化。裂解Caco-2得全细胞蛋白,上样至结合有His-IbeA的金属离子螯和柱,His pull down纯化特异性结合蛋白,电泳分析,Far-Western blotting进行两者结合特异性的验证,并分析结合蛋白N末端氨基酸序列。结果重组IbeA阻断E44侵袭Caco-2,并呈一定剂量依赖关系,对照组BSA对侵袭没有显著影响。His pull down的方法纯化出两个结合条带,Far-Western blotting验证了结合的特异性。并测定强结合条带pI约5.0,N端序列为MASITKLP。结论分离得到两个与IbeA相互作用的蛋白,为研究IbeA分子致病机制奠定了基础。