mRNA差异显示技术对环境诱发系统性红斑狼疮基因表达谱改变的研究

目的 比较环境因素诱发系统性红斑狼疮患者(SLE)与健康人外周血单个核细胞基因表达水平的差异.方法 选择5例无家族发病案例的SLE患者与5例健康人外周血单个核细胞,提取总RNA进行扩增、Cy3染色后,与Agilcnt 4X44K人全基因组芯片杂交,筛选差异表达基因进行基因实体(GO)分析和信息通路(pathway)分析.以qRT-PCR验证芯片结果.结果 5例SLE患者共同有2435个相对于健康人的差异基因表达(判断值=2.0).GO分析结果表明,生物过程中差异表达基因占32.08%(512/1596),其他比例较高的有细胞过程、生物调控、细胞代谢等;分子功能中差异表达基因占34.09%(544/1596),其较高比例依次为结合、催化活性、传感活性和转录调节活性;细胞组分方面差异表达基因33.83%(540/1596),主要涉及细胞与细胞部分两方面,其次为细胞器.Pathway分析显示免疫系统信号及B细胞受体通道中各有12个基因的表达发生了差异性改变,而T细胞受体、表皮生长因子受体1、IL-12介导的信号等通道均有10个基因表达明显差异.分析发现SLE患者在炎性反应与自身免疫相关基因方面有45个基因发生明显改变,其中11个上调,34个下调;细胞外基质和黏附分子方面有5个相关基因改变其中5个上调,1个下凋.qRT-PCR结果与芯片结果比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 5例无家族发病案例的SLE患者与健康人外周血单个核细胞基因表达水平存在明显的差异.     

FcγR Ⅱ a基因多态性、中性粒细胞胞浆抗体、循环免疫复合物在系统性红斑狼疮发病肿饔玫难芯靠

目的 通过检测系统性红斑狼疮(SLE)病人FcγR Ⅱ a受体的基因型及其分布情况,检测了血清中的中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)、循环免疫复合物(CIC).分析三者之间的关系和其与SLE的关系,从基因表达、转录及表达产物的作用三个层次探讨了SLE的发病机制.方法 收集69例SLE病人与48例健康人的标本,采用巢式PCR对FcγRⅡa基因进行分型,RT-PCR检测该基因的转录,采用ELISA方法对血清中的ANCA和CIC进行检测.结果 FcγR Ⅱ a-R131纯和子的分布在SLE患者组与正常对照组之间有统计学意义(P<0.02).三种基因型在狼疮病人中(分别为45%Fcγ/RⅡa-R/R131、30%H/R 131和25%H/H131)与正常对照组(21%FcγR Ⅱ a-R/R131、52%H/R131和27%H/H131)之间不同.FcγRⅡ a-R/R131基因型转录产物在SLE患者组与正常对照组之间有有统计学意义(P<0.02),此结果与分型结果一致.在FcγR Ⅱ a-R/R131基因型中抗ANCA阳性率为67.9%,CIC阳性率67.4%,与FcγRⅡ a-H/R131和FcγRⅡ a-H/H131两个基因型(ANCA:21.4%H/R131和10.7%H/H131;CIC:18.4%H/R131;14.0%H/H131)之间有统计学意义(P<0.05).ANCA与CIC的阳性率在H/R131与H/H131基因型之间无统计学意义(P0.2).结论 FcγR Ⅱ a-R/R基因型可能是云南汉族SLE病人的遗传易感因素,其在体内的过度表达可能是造成SLE患者血清中ANCA和CIC含量增高进而导致SLE发生的一个重要原因.     

CCAAT/增强子结合蛋白β在系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中的表达及意义

目的探讨系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding proteinsβ,C/EBPβ)的表达及其意义。方法从SLE患者血液中分离血浆和PBMC。通过定量PCR(quantitative PCR,q PCR)和Western blot方法检测SLE患者和健康对照PBMC中C/EBPβm RNA及其功能活性形式LAP(liver-enriched activating protein)蛋白表达水平。诱导THP-1细胞成为单核巨噬细胞,再分别用SLE患者血浆和健康对照血浆刺激24 h后,通过q PCR和Western blot方法检测C/EBPβm RNA和LAP蛋白表达水平。结果 SLE患者外周血PBMC中C/EBPβm RNA及LAP蛋白水平高于正常对照(P0.05)。SLE患者外周血PBMC中C/EBPβm RNA表达水平及LAP蛋白灰度值与SLE疾病严重程度评分(SLEDAI评分)正相关(P0.05,r0)。与正常对照血浆相比,SLE患者血浆刺激THP-1细胞诱导成的单核巨噬细胞24 h后C/EBPβm RNA和LAP蛋白水平显著升高(P0.05)。结论 SLE患者外周血PBMC中C/EBPβ表达显著升高,尤其是在单核巨噬细胞中,提示C/EBPβ表达升高参与SLE炎症发生的过程。     

系统性红斑狼疮患者外周血miR-7的表达及其意义

目的研究microRNA-7(miR-7)在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血的表达及其意义。方法 20例SLE患者和20例性别年龄匹配的健康对照者,荧光定量PCR检测PBMC、B细胞、T细胞和单核细胞中miR-7的表达以及靶基因PTEN的mRNA水平,通过电转染方法将miR-7的前体Pre-miRTM-miR-7 Precursor/抑制剂antimiRTM-miR-7抑制剂转染至SLE患者B细胞中,流式细胞检测B细胞增值功能。应用生物信息学方法及双荧光素酶报告基因系统预测并验证miR-7的靶基因。结果 SLE患者PBMC及B细胞中miR-7的表达显著高于健康对照(P0.01)。PTEN是miR-7的一个靶基因,转染miR-7的前体至SLE患者B细胞可抑制PTEN表达(P0.05),促进B细胞增殖(P0.05),转染miR-7抑制体则可以促进PTEN表达(P0.05),抑制B细胞增值(P0.05)。结论 miR-7参与了SLE的发病机制,调控PTEN的表达,并介导了SLE患者B细胞的增殖,是SLE潜在的治疗靶点。     

干扰素及其诱导蛋白在系统性红斑狼疮患者中的表达

应用寡核苷酸表达基因芯片技术检测了10例系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血白细胞的基因表达谱,与正常对照外周血的基因表达谱作了比较分析。研究中所取血液标本来自符合1982年美国风湿病协会修订的SLE诊断标准的患者共10例(其中包括1个SLE家系中2个SLE患者姐妹) ,男1例,女9例。另选取与患者性别、年龄相匹配的健康人,男5例,女5例,做正常对照。为验证基因芯片结果的可靠性,我们采用TaqMan荧光定量RT PCR方法进行复核分析。我们使用的是MERGEN公司的hu manH0 4包含336 0个点的寡核苷酸基因芯片。在确保基因芯片技术可靠性和重复性的…     

NP9对鼻咽癌细胞系CNE1基因表达谱的影响

目的： 确定NP9表达对鼻咽癌CNE1细胞基因表达谱的影响。方法: 稳定表达NP9基因和稳定转染空载体的CNE1细胞分别作为基因芯片分析的实验组和对照组，用高通量的基因芯片筛选实验组细胞的差异表达基因，荧光定量逆转录PCR验证部分基因表达差异。结果: 所分析的14 500个基因中，266个检测出有表达差异，其中82个基因呈现表达上调（RA＞1），184个基因显示表达下调（RA＜1）。显著上调和下调的基因分别为34个（RA＞1.5）和75个（RA＜1.5）。结论: NP9基因的表达导致了CNE1细胞中与细胞周期调控、细胞增殖和分化、细胞信号转导、细胞黏附相关基因表达的改变，为NP9的功能及分子机制研究提供了新的线索。     

系统性红斑狼疮患者3'不翻译区长度多态性研究

目的 研究系统性红斑狼疮(SLE)患者3'不翻译区(3'UTR)长度多态性,分析其在发病机制中的作用.方法 利用mRNA3'端单端特异测序获得选择性多聚腺苷酸化位点使用频率,判断3'UTR长度变化情况,并检测SLE患者外周血单核细胞中基因表达差异,结合生物信息学分析3'UTR长度多态性与SLE临床病症间的联系.结果 与正常健康对照组相比,SLE组样品有904个基因倾向使用显著缩短或延长的3'UTR,基因明显富集于SLE发病相关的26条功能通路;1 597个基因呈现明显表达差异,富集在22条SLE发病相关的功能通路上.结论 SLE是一种复杂的多基因疾病,3'UTR长度多态性对SLE相关基因功能有重要影响,3'UTR可能通过表观遗传学调控方式参与SLE发病.     

阻断4-1BB/4-1BBL通路在系统性红斑狼疮患者T淋巴细胞活化中的作用

目的 探讨协同刺激分子4-1BB/4-1BBL在系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)T淋巴细胞活化中的作用机制.方法 应用RT-PCR和Western blot方法检测体外培养20例SLE患者和20例正常对照者T淋巴细胞活化前后及应用抗4-1BB单抗阻断后p38 MAPK和NF-kB表达的变化.结果 SLE患者T淋巴细胞NF-kB mRNA和p38 MAPK mRNA表达及其蛋白水平明显高于正常对照组(P均＜0.01),活化后的表达进一步升高(P均＜0.01).阻断4-1BB/4-1BBL通路后SLE患者T淋巴细胞p38 MAPK mRNA及蛋白水平的表达均明显下降(P均＜0.01),但是NF-kB mRNA及蛋白水平的表达无明显变化(P＞0.05).结论 协同刺激分子4-1BB可能通过p38MAPK信号转导通路促使SLE患者T淋巴细胞的活化与增殖.     

卵巢癌PTEN基因失活机制的探讨

目的　旨在从DNA、mRNA及蛋白水平,探讨卵巢癌PTEN基因的失活机制。方法　48例卵巢癌标本,应用位于染色体10q23 3的4个多态性标记(D10s541、D10s583、D10s1687和D10s2491),采用聚合酶链反应(PCR)及杂合性缺失分析法,检测了PTEN杂合性缺失(LOH);采用聚合酶链反应单链构象多态性分析法(PCR SSCP)检测了PTEN第5、第6、第7和第8外显子的突变;采用逆转录(RT) PCR及免疫组织化学技术检测了PTENmRNA及蛋白的表达。结果　39 6%(19 /48)的卵巢癌存在PTEN基因的LOH, PTEN突变率仅为4 2% (2 /48),PTENmRNA表达缺失率为18 8% (9 /48),蛋白表达缺失率达27 1% (13 /48)。PTEN蛋白表达缺失的病例,LOH的发生率69 2% (9 /13)高于表达阳性者的28 6% (10 /35),差异有统计学意义(P<0 05 )。13例PTEN蛋白表达缺失的病例中,仅有2例( 15 4% )同时有突变和LOH,即存在双等位基因的结构异常; 7例(53 8% )有LOH,其中5例PTENmRNA表达缺失,另2例表达正常; 4例( 30 8% )既无突变也无LOH,其中2例PTENmRNA表达缺失,另2例表达正常。结论　PTEN基因失活在卵巢癌的发病中可能起一定的作用,其失活可能存在多种机制,蛋白表达缺失可能是重要的失活机制。     

人流感病毒核蛋白的重组表达及其抗原性分析

目的 探索用原核表达的人甲3型流感病毒核蛋白(NP)免疫小鼠所获得的抗重组蛋白抗体检测甲型流感病毒的可行性.方法 用Clustal X, Antheprot等软件,对IFV-A3 NP进行分析,确定保守区并分析其抗原性.RT-PCR获得NP基因,分3段克隆NP基因到PET-28(c),并在B121中诱导表达.经Ni-Agarose亲和层析柱纯化后,免疫BALB/c鼠制备抗重组蛋白抗体.用Western Blot和免疫组化法检测抗重组蛋白抗体与病毒抗原的反应性.结果 重组质粒在BL21中高效表达,表达量为15-20 m9/L菌液.Western Blot检测显示,抗NP1、NP2、NP3多克隆抗体(1:2000)均对流感病毒NP具有反应性.免疫组化检测也显示,抗NP1、NP2、NP3多克隆抗体对IFV-A3、-Al感染的MDCK细胞有特异性染色,抗体滴度从1:640到1:1280.结论 重组表达的NP能够诱导产生高效价多克隆抗体,所产生的抗体与IFV-A3、A1具有交叉免疫反应性.通过生物信息学分析预测抗原性并制备多克隆抗体是可行的,并可望用于流感病毒感染的早期快速诊断的研究中.     

系统性红斑狼疮患者脱氧核糖核酸酶1基因表达研究

目的　研究脱氧核糖核酸酶 1(deoxyribonuclease ,DNASE1)基因表达及 m RNA剪接形式与系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus,SL E)的关联性。　方法　以实时荧光定量聚合酶链反应 (real- time PCR)方法检测 DNASE1的 m RNA表达水平 ,以毛细管电泳技术分析 m RNA编码区替代剪接体 ,结合单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphisms,SNPs)单倍型了解基因结构对表达的影响。　结果　SL E患者 DNASE1基因表达水平显著高于正常对照 (P<0 .0 0 1) ,未发现 SL E疾病活动性指数积分与基因表达水平存在相关性 ,但性别分析显示女性患者 DNASE1基因表达水平高于男性患者 (P<0 .0 1)。 8名正常人与 18例患者的毛细管电泳结果显示 ,患者与正常人替代剪接谱系不同 ,且 380 bp处存在明显条带 ,具有不同单倍型的 SL E患者替代剪接谱系亦有差异。　结论　 SL E患者 DNASE1基因表达异常 ,并存在与正常人不同的 m RNA剪接体。 DNASE1基因与 SL E发病相关     

Gene expression profiles in human nasal polyp tissues studied by means of DNA microarray

BACKGROUND: Nasal polyposis (NP) is a chronic inflammatory disease of the sinuses. Its pathogenesis is unknown. DNA microarray analysis allows simultaneous measurement of expression of thousands of genes in the same tissue sample and might help to identify gene alterations in various disorders. OBJECTIVE: We sought to screen for disease-related genes in NP by using DNA microarrays and to validate the altered expression of selected genes at the mRNA and protein level. METHODS: Expression microarrays containing approximately 10,500 genes were used to compare individual gene profiles of NP samples (n=10) and normal mucosal samples obtained from sphenoid sinuses in patients undergoing pituitary surgery (n=4). Four of the 5 most upregulated, and the single most downregulated, genes were retested by means of quantitative RT-PCR and immunohistochemistry in a different set of NP and normal mucosal samples obtained from the ethmoid and sphenoid sinuses. RESULTS: Compared with normal sinus tissue, 192 genes were upregulated at least 2-fold, and 156 genes were downregulated by at least 50% in NP samples (approximately 3% of genes evaluated). Four of the top 5 overexpressed genes (statherin, 48.0-fold; prolactin-induced protein [PIP] , 24.9-fold; lactoferrin, 26.6-fold; and deleted in malignant brain tumor 1 [DMBT1] , 30.3-fold) and the most underexpressed gene (Clara cell 10-kd protein [CC10] , -20.1-fold) were selected and retested by means of quantitative RT-PCR and immunohistochemical staining. Quantitative RT-PCR and immunohistochemical staining confirmed the differential expression of all except statherin in NP tissue. CONCLUSION: DNA microarrays can provide new insight into the possible pathophysiologic processes involved in NP.     

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞TRAF1 mRNA的表达及其意义

目的：研究肿瘤坏死因子受体相关因子1(TRAF1)mRNA表达在SLE患者的外周血单个核细胞中的表达是否异常，以及该基因mRNA表达与SLE活动指数是否相关。方法：TRAF1 mRNA表达采用RT-PCR半定量法；SLE活动指数以SLEDAI为判断标准。结果：TRAF1 mRNA在SLE患者的外周血单个核细胞中的表达较正常人为高，但与SLEDAI指数无相关。结论：TRAF1基因可能在SLE的发病机制中起重要作用。     

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞RECK的表达及其与基质金属蛋白酶-9的关系

目的 探讨系统性红斑狼疮(SEE)患者PBMC RECK(reversion-inducing cysteine-richprotein with kazal motif)的表达及其与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的关系.方法 分别用Western blot及RT-PCR检测SLE患者及健康对照组PBMC上RECK的蛋白及mRNA水平,同时检测MMP-9mRNA的水平.加入植物血凝素(PHA)刺激后检测3者的表达变化及刺激后MMP-9的分泌情况并与空白对照组比较.结果 与健康对照组相比,患者组RECK蛋白及mRNA水平降低,MMP-9 mRNA水平增高,分泌MMP-9的能力高于健康对照组.与空白对照相比,PHA刺激后,患者组及对照组RECK蛋白及mRNA表达均降低,MMP-9 mRNA水平升高,MMP-9分泌均增多.RECK的表达与MMP-9的分泌呈负相关.结论 RECK可能通过抑制MMP-9的分泌在SEE发病过程中起重要作用,对其的调控可望为SLE治疗提供新的方向.     

系统性红斑狼疮病人外周血白细胞TNFRSF12mRNA表达的研究

目的 :了解肿瘤坏死因子受体超家族成员 12 (TNFRSF12 )mRNA在系统性红斑狼疮 (SLE)外周血白细胞中的表达是否异常 ,初步判断TNFRSF12是否为SLE的易感基因。方法 :采用TaqManone stepRT PCR方法 ,分别对SLE病人、正常人和类风湿性关节炎 (RA)病人外周血白细胞TNFRSF12mRNA的表达进行检测。结果 :SLE病人TNFRSF12mRNA的表达形式与表达量和正常人相比均存在差异 ,SLE病人白细胞存在TNFRSF12mRNA的两类形式剪切体 ,分别为编码膜结合蛋白形式和分泌形式的TNFRSF12 ,而正常人只有后者 ,在PHA刺激后才开始同时表达前者。并且TNFRSF12mRNA在SLE病人中的表达量与病情活动度和肾脏累及相关。结论 :提示TNFRSF12在SLE的发病机制中起一定作用 ,因此可能是SLE的易感基因。