MMP-2抑制剂对成釉细胞瘤细胞体外侵袭的影响

目的:探讨基质金属蛋白酶-2抑制剂Ro31-9790对成釉细胞瘤细胞体外侵袭的影响。方法:通过给予Ro31-9790对体外培养的成釉细胞瘤细胞进行处理,采用明胶酶谱法、流式细胞术、体外侵袭试验、细胞粘附分析、免疫组化、MTT试验等方法,观察Ro31-9790对成釉细胞瘤细胞体外侵袭等特性的影响。结果:Ro31-9790对成釉细胞瘤细胞的侵袭及粘附能力均有明显的抑制作用;4例成釉细胞瘤细胞均表达MMP-2,但不同肿瘤组织来源的成釉细胞瘤细胞MMP-2表达量不同。Ro31-9790能显著抑制成釉细胞瘤细胞分泌的MMP-2的活性,但不影响成釉细胞瘤细胞MMP-2和TIMP-2的表达;Ro31-9790不能抑制成釉细胞瘤细胞的体外增殖。结论:MMP-2的活性及其相关的细胞粘附能力与成釉细胞瘤的侵袭能力密切相关,Ro31-9790可在体外抑制成釉细胞瘤的侵袭     

基质金属蛋白酶-2活性与成釉细胞瘤侵袭力的关系

目的：探讨基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）活性与成釉细胞瘤体内、外侵袭力的关系。方法：通过MMP-2活性抑制剂R031—9790降低MMP-2活性进行干预处理，采用成釉细胞瘤细胞原代培养、瘤组织块裸鼠肾包膜下移植、MTT、Western印迹、体外侵袭试验、组织学和免疫组织化学等方法，观察MMP-2活性与成釉细胞瘤体内、外侵袭的关系。采用SPSS10．0统计软件包对上述数据进行χ^2检验和单因素方差分析。结果：R031-9790各处理组和对照组的生长曲线无显著差异（P〉0．05）。R031-9790对成釉细胞瘤细胞的体内、外侵袭均有显著的抑制作用（P〈0．01）。并可增加Ⅳ型胶原在瘤组织的阳性表达，减少E-钙黏素在瘤组织的异常表达，同时在体内、外均不影响成釉细胞瘤细胞MMP-2的表达。结论：MMP-2活性与成釉细胞瘤的侵袭直接相关；R031-9790可通过降低MMP-2活性而抑制成釉细胞瘤的侵袭；活性MMP-2可能通过调节Ⅳ型胶原及E-钙黏素的表达。影响成釉细胞瘤的侵袭。     

基质金属蛋白酶组织抑制剂-2过表达对人成釉细胞瘤鸡胚尿囊膜移植瘤的抑制作用

目的探讨基质金属蛋白酶组织抑制剂-2（TIMP-2）基因过表达对人成釉细胞瘤鸡胚尿囊膜（CAM）移植瘤的抑制作用。方法建立成釉细胞瘤的鸡胚尿囊膜移植瘤模型。将实验分组：空白对照组（Empt）,脂质体转染组（Lipo）,质粒转染组（P）。TIMP－2基因转染成釉细胞CAM移植瘤细胞后,测定移植瘤体积和瘤重;将移植瘤侵袭能力分为4个级别进行移植瘤病理检查。Western blot分析移植瘤基质金属蛋白酶-2（MMP-2）及TIMP-2蛋白的表达。结果移植瘤能在鸡胚绒毛尿囊膜上生长。接种后第9天,转染质粒组的0级侵袭为7例、2级侵袭为1例、3级侵袭为0例。TIMP-2基因转染可以显著抑制成釉细胞CAM移植瘤的局部侵袭能力。质粒转染组TIMP-2表达明显高于空白组TIMP-2的表达（P＜0.05）;质粒转染组MMP-2表达明显低于空白组MMP-2的表达（P＜0.05）。结论成功建立成釉细胞瘤的CAM移植瘤模型。TIMP-2基因转染后,成釉细胞瘤CAM移植瘤的侵袭性生长被抑制。移植瘤的侵袭性生长被抑制的可能原因是由于特异性抑制MMP-2蛋白引起的。     

负向调控基质金属蛋白酶-2的表达抑制成釉细胞瘤的侵袭性

目的探讨基质金属蛋白酶-2（MMP-2）靶向小干扰RNA（siRNA）对成釉细胞瘤（AM）细胞MMP-2基因的负向调控作用及对AM侵袭性的抑制作用。方法培养成釉细胞瘤细胞，应用免疫荧光法检测成釉细胞瘤中MMP-2的表达；体外构建MMP-2靶向siRNA质粒表达载体，并转染成釉细胞瘤细胞．激光共聚焦显微镜检测siRNA质粒表达载体的转染效果，流式细胞仪检测转染效率．逆转录聚合酶链反应检测MMP-2mRNA的改变，免疫印迹法检测细胞MMP-2蛋白表达．侵袭小室微侵袭分析检测细胞的侵袭性，对统计结果进行方差分析。结果成釉细胞瘤中MMP-2呈阳性表达，siRNA质粒表达载体对成釉细胞瘤细胞的转染率为63、6％；转染后，成釉细胞瘤细胞的MMP-2mRNA表达减少69．3％，MMP-2蛋白表达减少64.2％，P〈0．05，细胞的侵袭抑制率为61．2％。结论MMP-2靶向siRNA表达质粒成功转染成釉细胞瘤细胞并沉默MMP-2基因，MMP-2与细胞的侵袭性密切相关。     

核因子κB、Ki-67和MMP-9在牙源性钙化囊肿中的表达

目的 检测核因子κB（NF-κB）、Ki-67和基质金属蛋白酶9（MMP-9）在牙源性钙化囊肿（COC）中的表达，探讨COC的增殖活性和侵袭性。方法 根据2005年WHO关于牙源性肿瘤的分类标准，将26例被诊断为COC的病例分为牙源性钙化囊性瘤（calcifying cystic odontogenic tumor，CCOT）、成牙本质影细胞瘤（dentinogenic ghost cell tumor，DGCT）、牙源性影细胞癌（ghost cell odontogenic carcinoma，GCOC）3种病损，用免疫组化方法检测NF-κB（p65）、Ki-67、MMP-9在COC和10例一般型成釉细胞瘤中的表达。结果 NF-κB主要在肿瘤细胞胞质中表达，偶见胞核表达（核阳性率＜1％）。Ki-67在GCOC中的表达明显高于CCOT（P＜0．001）、DGCT（P＜0．05）和成釉细胞瘤（P＜0．005），差异有统计学意义。MMP-9在肿瘤细胞及间质细胞中均有表达，GCOC间质细胞MMP-9的阳性表达率明显高于其余3组良性牙源性肿瘤（P＜0．05）。结论 NF-κB在COC的恶性转化及侵袭过程中影响较小。GCOC的增殖活性和侵袭性明显高于CCOT和DGCT，GCOC间质中的MMP-9是其高侵袭性的重要原因。     

成釉细胞瘤中基质金属蛋白酶MMP-2的表达及意义

:目的　探讨成釉细胞瘤局部侵袭性生长的生物学机制。方法　免疫组化 S- P法检测基质金属蛋白酶MMP- 2在成釉细胞瘤中的表达和分布。结果　成釉细胞瘤中 MMP- 2阳性染色位于肿瘤外周柱状细胞的胞浆中 ,中心星网状细胞未见表达 ;角化囊肿和含牙囊肿的上皮细胞中均未见 MMP- 2的阳性表达。结论　成釉细胞瘤细胞产生的 MMP- 2 ,导致基底膜成分 型胶原降解 ,破坏基底膜的完整性 ,这可能是成釉细胞瘤局部侵袭的机制之一。     

MMP-2靶向siRNA对成釉细胞瘤裸鼠移植瘤的抑制作用

目的:构建裸鼠皮下人成釉细胞瘤移植瘤模型,研究MMP-2靶向siRNA对成釉细胞瘤侵袭性的抑制作用。方法:取新鲜成釉细胞瘤组织标本,剪切成1～2mm3组织小块,接种于裸鼠前肢根部的背侧皮下。实验分为3组:空白对照组不加任何处理因素;脂质体组注射脂质体混合物;siRNA组注射MMP-2靶向siRNA表达质粒混合物。组织块接种后第2周末开始施加处理因素,记录移植瘤体积和实验终止时的肿瘤重量。采用SPSS10.0统计软件包对数据进行t检验,并对移植瘤进行组织病理学分析。结果:所有移植瘤均成活,病理证实移植瘤为成釉细胞瘤,siRNA组和对照组之间肿瘤的体积有显著性差异,P<0.05。结论:裸鼠皮下接种成釉细胞瘤组织块构建成釉细胞瘤移植瘤动物模型是可行的,MMP-2靶向siRNA可在体内抑制成釉细胞瘤的侵袭性和生长。     

基质金属蛋白酶与Ⅳ型胶原在成釉细胞瘤的表达

目的探讨基质金属蛋白酶和Ⅳ型胶原与成釉细胞瘤复发、侵袭的关系。方法采用免疫组织化学LABC方法检测28例成釉细胞瘤组织中MMP-2、TIMP-2和Ⅳ型胶原的表达,并用RT-PCR方法检测MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP在20例成釉细胞瘤的表达。结果MMP-2、TIMP-2和Ⅳ型胶原蛋白在成釉细胞瘤的阳性表达率分别为92.9%、75.0%和42.9%,Ⅳ型胶原阳性着色部位均位于基底膜及部分肿瘤细胞的胞质,MMP-2和TIMP-2阳性着色部位均位于细胞质,分布于瘤组织各层;复发性成釉细胞瘤Ⅳ型胶原的阳性表达率明显低于原发性成釉细胞瘤(P<0.01)。MMP-2、MT1-MMP、TIMP-2的mRNA在成釉细胞瘤组织中均有表达,复发性成釉细胞瘤的TIMP-2、MT1-MMP相对含量均显著高于原发性成釉细胞瘤(P<0.01)。结论基质金属蛋白酶MT1-MMP表达增加和Ⅳ型胶原在基底膜表达缺失与成釉细胞瘤的复发密切相关,MMP-2活性增加和基底膜Ⅳ型胶原降解增多可能是成釉细胞瘤局部侵袭的机制之一。     

人成釉细胞瘤裸鼠皮下移植瘤模型的建立

目的建立人成釉细胞瘤的裸鼠皮下移植瘤模型。方法采用组织块直接贴壁法将新鲜成釉细胞瘤组织进行原代细胞培养,反复贴壁法和胰酶消化法使之纯化。然后将纯化的成釉细胞瘤细胞接种于裸鼠颈背部皮下。观察接种成瘤后瘤组织大体生长情况以及常规病理切片观察瘤细胞的侵袭生长情况。结果成釉细胞瘤细胞可以在裸鼠皮下存活,接种后第23天见有移植瘤形成,成瘤率为25%。病理切片显示瘤细胞可向裸鼠肌间生长,保持了其侵袭性生长的特性。结论初步建立了人成釉细胞瘤的裸鼠皮下移植瘤模型,为进一步研究成釉细胞瘤的侵袭生长特性奠定了基础。     

成釉细胞瘤的体外培养和增殖动力学研究

目的 观察体外培养的成釉细胞瘤的生长特点及增殖活力。方法 对成釉细胞瘤细胞进行体外培养,并用流式细胞仪分析细胞的DNA含量和增殖活力。结果 成釉细胞瘤细胞在体外生存的条件较高,细胞在体外存活时间为 35～54天。培养的肿瘤细胞包含两种形态不同的细胞;肿瘤细胞生长缓慢,DI值为 0.97±0.03,为二倍体细胞;S期细胞比率（SPF）值为 7.77％±1.65％,增殖指数 PI值为 8.06±1.40,增殖活力在正常组织范围内;细胞凋亡受到抑制。结论 成釉细胞瘤是良性二倍体肿瘤,细胞增殖并不活跃,但细胞凋亡受到抑制。可能与其侵袭性有关。     

Inhibition of ameloblastoma invasion in vitro and in vivo by inhibitor of metalloproteinase-2 activity

Background:  Ameloblastoma is an odontogenic benign tumor characterized by local invasiveness and most of its local recurrences clinically result from local invasion. This study used matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) inhibitor I (MMP-2I) to investigate the role played by MMP-2 activity in the local invasiveness of ameloblastoma.
Methods:  The cells and xenografts of ameloblastoma were treated with MMP-2I and treatment group were compared with the control group. In vitro , the invasive activity of tumor cells was assayed in transwell cell culture chamber. Gelatinolytic activity of gelatinases and MMP-2/tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP-2) protein expression was detected using gelatin zymography and flow cytometry. The cell viability and adhesion were evaluated using methyl thiazol tetrazolium. In vivo , bilateral subrenal capsule xenograft transplantation of ameloblastoma was performed in 10 nude mice and the invasion of ameloblastoma into the renal parenchyma was observed.
Results:  Active-MMP-2 of conditioned media was significantly lower in treatment group than in the control group. Accordingly, potential of in vitro cell invasion, adhesion and in vivo tumor invasion were also significantly lower in the treatment group than in the control group.
Conclusions:  Inhibitor of MMP-2 activity suppressed the local invasive capability of ameloblastoma by decreasing MMP-2 activity. MMP-2 activity is in relation with invasive capacity of ameloblastoma.     

过表达RECK基因对成釉细胞瘤hTERT＋_AM永生化细胞株MMPs表达及侵袭能力的影响

目的：观察转染RECK基因对人成釉细胞瘤（ameloblastoma,AM）细胞株hTERT-AM的MMPs表达及细胞侵袭力的影响。方法：利用RECK基因慢病毒载体Lenti—RECK—eGFP／puro转染hTERTAM细胞株．Puro筛选和镜下挑单克隆纯化细胞。CCK8检测细胞活性,Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力,qRT—PCR检测细胞中RECK的mRNA的表达情况。Western蛋白印迹检测细胞中RECK、MMP2、MMP9的表达情况。采用SPSS13．0软件包对数据进行统计学分析。结果：转染RECK基因后,hTERT~AM细胞中RECK的mRNA和蛋白的表达均显著增高（P均〈0．01）,细胞活性无显著变化（P均〉0．05）,细胞迁移、侵袭能力均显著下降（P均〈0．01）,MMP2、MMP9蛋白表达均显著下降（P均〈0．05）。结论：RECK基因参与人成釉细胞瘤局部侵袭的调节,过表达RECK基因后,MMP2、MMP9下调,抑制AM细胞迁移和侵袭。RECK有望成为人成釉细胞瘤侵袭防治的新靶点。     

成釉细胞瘤中MMP-2的表达及RNA干扰的抑制作用

目的：研究MMP-2存成釉细胞瘤中的表达和RNA干扰对成釉细胞瘤细胞中MMP-2基因的沉默效应。方法：培养成釉细胞瘤细胞，应用免疫组织化学方法检测成釉细胞瘤中MMP-2的表达；体外构建MMP-2靶向siRNA质粒表达载体，将siRNA质粘表达载体转染原代培养的成釉细胞瘤细胞，激光共聚焦显微镜检测siRNA质粒表达载体的转染效率，RT-PCR检测成釉细胞瘤细胞中MMP-2 mRNA的改变，明胶酶谱法检测MMP-2的变化．应用SPSSI 1．0统计软件中的t检验对结果进行统计学分析。结果：成釉细胞瘤中MMP-2呈阳性表达．siRNA质粒表达载体对原代培养的成釉细胞瘤细胞的转染半为41.8％；转染后，成釉细胞瘤细胞的MMP-2 mRNA表达水平显著降低，酶原性MMP-2和活性MMP-2显著减少，P〈0．05结论：体外构建的MMP-2靶向siRNA质粒表达载体可以转染体外培养的成釉细胞瘤细胞，并导致MMP-2基因沉默。     

Tissue inhibitor of metalloproteinase-2 inhibits ameloblastoma growth in a new mouse xenograft disease model

J Oral Pathol Med (2010) 39 : 94–102
Background:  Ameloblastomas are odontogenic neoplasms characterized by local invasiveness. This study was conducted to develop a new animal model of ameloblastoma and to address the role of tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2) and matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) in the growth and invasiveness of ameloblastomas.
Method:  Donated fresh human ameloblastoma tissue was finely minced, screened, and subcutaneously implanted in three locations on each of 10 BALB/c-nu/nu nude mice. Newly established tumors on each mouse were injected with: (i) transfection reagent; (ii) liposome and transfection reagent; or (iii) liposome, transfection reagent, and the expression plasmid pcDNA3.1(+)/green fluorescent protein (GFP)-TIMP-2. Tumors were monitored for 5 weeks and excised for histopathology, RNA, and protein analyses.
Results:  The ameloblastoma xenografts were established with high frequency and contained a variety of typical features, validating this new model system. Xenografts injected with the TIMP-2 expression plasmid showed reduced growth, increased TIMP-2 mRNA and protein, and decreased MMP-2 protein compared with the control groups.
Conclusions:  We successfully established a new experimental model of ameloblastoma consisting of subcutaneous human xenografts in nude mice. In addition, we demonstrated the successful introduction of the TIMP-2 gene in tumor xenograft cells in vivo , resulting in xenograft growth inhibition. This growth inhibition may have resulted from TIMP-2 overexpression specifically inhibiting MMP-2 protein expression and activity.     

Establishment of ameloblastoma cell line, AM-1

Ameloblastomas are slowly growing, locally invasive neoplasms with a potentially destructive behaviour. The molecular mechanisms that regulate the cell growth and invasion of ameloblastoma cells are unknown. Because ameloblastoma cells placed in culture have a very limited lifespan, the establishment of immortalized clones of ameloblastoma cells would aid its study. We produced an immortalized ameloblastoma cell line (AM-1) using human papillomavirus type-16. This cell line maintains epithelial cell morphology and expresses cytokeratins K8, K14, K18, K19. Furthermore, bcl-2 protein, which prevents apoptosis, is expressed. We investigated the behaviour of these cells on a collagen matrix in vitro. These cells grew in a monolayer over foci of collagen degradation and could invade the collagen gel at such sites. Since the behavior of cell line AM-1 mimics the behavior of ameloblastoma in vivo , it may be a valuable model for the study of these neoplasms.     

TIMP-2对人成釉细胞瘤裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的：研究TIMP-2基因转染对人成釉细胞瘤裸鼠移植瘤侵袭性生长的抑制作用。方法：实验分为空白对照组（Opti—MEM）、脂质体转染组（脂质体＋Opti—MEM）和质粒转染组[pcDNA3．1（＋）／GFP—TIMP－2＋脂质体＋Opti—MEM]。将以上各组液体混合注射于移植瘤的周围，每3天1次，共3次。采用RT—PCR分析移植瘤MMP－2及TIMP－2mRNA的表达．Western印迹分析移植瘤MMP－2及TIMP－2蛋白的表达，测定移植瘤体积和瘤重。应用SPSS11．0软件包对所得数据进行统计学分析。结果：接种AM组织块后，裸鼠生长良好，所有裸鼠在实验终止前均存活。接种AM组织块后1周末．可见裸鼠的接种处皮下有小结节，颜色与皮肤颜色相近，随皮肤移动而移动；2周末，小结节稍有增大，并且固定于皮下，不随皮肤的移动而移动，小结节表面较第1周略圆；实验终止时，所有移植瘤都有不同程度的增大。与对照组比较，质粒转染组移植瘤的生长速度在接种后4周明显降低。接种后第5周末，质粒转染组移植瘤的生长速度略有增加。自第1周末开始至实验终止时，质粒转染组移植瘤的体积均小于对照组。各组MMP－2mRNA表达平均值无变化，三者之间无显著性差异，P〉0．05。质粒转染组的TIMP－2mRNA表达水平与空白对照组和空脂质体转染组比较均显著增加（P〈0．05）。与空白组比较，质粒转染组的TIMP－2mRNA表达相对增加率为35．72％。质粒转染组MMP－2表达平均值比值为0．38，MMP－2蛋白抑制率为47．36％。质粒转染组MMP－2表达显著低于空白组，P〈0．05。质粒转染组TIMP－2表达平均值比值为0．86，TIMP－2蛋白增加率为54．65％。质粒转染组TIMP－2表达显著高于空白组，P〈0．05。结论：AM移植瘤的生长抑制，可能是由于TIMP－2基因过表达后，特异性抑制MMP－2蛋白所致。