荧光定量聚合酶链反应检测HBV-DNA观察

乙型肝炎病毒（HBV）感染的实验诊断主要依据血清学标志（HBV—M）和HBV—DNA的检测。以往运用的普通PCR检测只能定性,其后处理过程易导致假阳性污染,且所用的染色剂溴乙锭是强致癌物。因此,普通PCR的应用和推广受到一定限制。我们采用实时荧光定量聚合酶链反应（Fluorescence quantitative,FQ—PCR）克服了常规PCR的不足。直接检测146份血清标本乙型肝炎病毒核酸的拷贝数,并同时与酶联免疫吸附试验（ELISA）进行对照,现将结果报道如下。     

聚合酶链反应在乙肝病毒检测中的应用

聚合酶链反应(Polymerase China Reaction,PCR)是近年建立的一种体外基因扩增技术。其原理是:靶DNA变性解链后与特异性引物杂交,在DNA聚合酶作用下使引物延伸,合成新的DNA。上述步骤反复进行,DNA就大量扩增,以指数递增放大。它具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点,故受到广大科学工作者普遍重视。该技术目前已广泛应用     

实时荧光定量聚合酶链反应检测金黄色葡萄球菌

目的建立一种快速、准确、特异定量检测金黄色葡萄球菌的方法. 方法 以金黄色葡萄球菌FemB基因为靶序列,设计并合成引物和Taqman探针,优化引物与探针比例,调整镁离子浓度,对金黄色葡萄球菌进行荧光定量检测. 结果引物与Taqman探针比例为1∶4,镁离子为2.5mmol/L时本底最低,荧光信号最强;该法的灵敏度为1.0×103拷贝,能特异区分金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌. 结论使用Taqman探针技术的荧光定量聚合酶链反应能够对金黄色葡萄球菌准确快速定量检测.     

荧光定量PCR检测乙型肝炎患者唾液HBV-DNA的意义

目的 探讨唾液HBV-DNA在乙型肝炎中的意义。方法 采用荧光定量PCR法检测250例来新乡市中心医院就诊的HBV感染者的唾液和血清。结果 250份标本血清中HBV—DNA为阴性的有25例（10．0％）;唾液中HBV-DNA为阴性的有68例（27．2％）。血清中HBV-DNA大于10^3U／ml的有225例（90％）,唾液中HBV-DNA大于10^3U／ml的有182例（72．8％）。其中大于10^3U／ml标本中,血清209例（83．6％）,唾液123例（49．2％）,血清与唾液HBV—DNA水平之间存在相关性（r=0．79,P〈0．01）。结论乙型肝炎患者的唾液和血清中含有感染性的高载量HBV—DNA,可成为传染源之一。为乙型肝炎的流行病学研究提供了新的思路和理念。     

聚合酶链反应检测乙肝病毒的研究

应用聚合酶链反应（PCR）对在校大学生进行乙型肝炎病毒（HBV）流行病学调查，同时进行血清乙肝病毒标志物（HBVM）检测。在496名大学生血清中，HBVDNA阳性率为11．90％，HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、HBcAg及抗-HBc阳性率分别为11．29％、8．87％、9．48％、12．5％、11．69％和16．33％。在HBVM全明性的375人中有7人检出HBVDNA，阳性率为1．87％。结果表明，只有通过PCR才能检出具有传染性的潜在的低水平HBV复制。     

应用巢式聚合酶链反应在唾液中检出幽门螺杆菌

用互补于幽门螺杆菌(HP)尿素酶A基因的两对引物行巢式聚合酶链反应(N-PCR),检测1株HP标准菌株、20株HP临床分离株均阳性,而12种肠道菌均阴性,特异性100%。该法敏感性好可检测0.1fg细菌DNA.57例因上消化道症状行胃镜检查者,取粘膜分别做细菌培养、尿素酶试验、组织学检查和N-PCR检测,其中27例在行胃镜前收集其唾液标本做N-PCR。19例胃粘膜HP阳性者中有11例唾液中检出HP,而8例胃粘膜HP阴性者中有1例唾液N-PCR阳性。作者认为口腔中确实存在HP,该菌可能通过口—口途径传播。     

聚合酶链反应(PCR)检测HBV-DNA及其在传染病监测中的应用

本文报道了应用聚合酶链反应(PCR)技术,对末梢血中的HBV-DNA进行了测定,同时与静脉血作了比较。并和HBV的血清学标志物(HBVM)的关系作了初步的分析。建议国境卫生检疫机关住传染病监测中应用.     

用聚合酶链反应技术检测血清中HBV－DNA

本文报道了以聚合酶链反应技术检测血清中ＨＢＶ－ＤＮＡ的方法。将血清在０．１ＭＮａＯＨ中３７℃孵育６０分钟使ＨＢＶ－ＤＮＡ从病毒中释放出来。再经琼脂糖检测２７ＤｂＰ的ＨＢＶ－ＤＮＡ片段。本方法检测ＨＢＶ的最低检测限为１０￣（－２）ｐｇ。用建立的方法检测５０例已被证实或怀疑为慢性乙型肝炎感染的病人血清。在１６例ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ为阳性的病人中，斑点杂交和ＰＣＲ分析均为阳性；１９例ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｂ为阳性的病人中，斑点杂交法检出５例，ＰＣＲ法检出１４例；在１５例抗－ＨＢｃ病人中，杂交法检出４例，ＰＣＲ法检出１０例阳性。结果表明ＰＣＲ法比杂交法敏感。     

聚合酶链反应在乙型肝炎病毒感染诊断中的意义

用PCR法检测166例乙型肝炎病毒感染者血清HBV-DNA。结果显示:HBsAg、HBeAg、抗-HBc阳性,HBsAg、抗-HBe、抗-HBc阳性和HBeAg阳性组,HBV-DNA阳性率分别为96.2％、28.6％、93.5％、HBsAg单项阳性者中,检出HBV-DNA阳性78例(孕妇占19.2％),阳性率81.3％。另外,在20例血清标志物全部阴性对照组中发现HBV-DNA阳性1例,阳性率5.36％。6例抗-HBc阳性和12例抗-HBe阳性者,HBV-DNA阳性率均为33.3％。从而提示乙肝病毒血清标志全部阴性,出现抗-HBs、抗-HBe、抗HBc,都不能说明血清中不存在乙肝病毒颗粒。因此应用PCR检测既可提高乙肝病毒感染的早期诊断率,又可直接反映病毒在体内复制状况。为指导临床治疗和预防提供可靠依据。     

用聚合酶链反应研究乙型肝炎病毒的灭活

建立测定乙肝病毒脱氧核糖核酸（ＨＢＶ ＤＮＡ）的聚合酶链反应－溴乙锭法（ＰＣＲ－ＥＢ），该方法特异性好，灵敏度为１ｐｇＨＢＶ ＤＮＡ，可能检出ＨＢＶ敏感动物黑猩猩的最小感染量。应用ＰＣＲ－ＥＢ法测定氯消毒剂对ＨＢＶ的灭活作用表明，有效氯１２５０ｍｇ／Ｌ作用６０分钟或２ ５００ｍｇ／Ｌ作用３０分钟可使１０倍ＰＣＲ灵敏度的纯化ＨＢＶ ＤＮＡ转阴；有效氯２ ５００ｍｇ／Ｌ作用３０分钟或１ ２５０ｍｇ／     

乙型肝炎病毒的液相杂交技术在聚合酶链反应酶联免疫检测的应用探讨

目的 利用液相杂交技术,将核酸杂交技术进行简化,建立乙型肝炎病毒(HBV)的液相杂交的聚合酶链反应酶联免疫检测(PCR-ELISA)方法.方法 以HBV为目的靶DNA,引物P15'端标记Bio-PCR扩增37个循环.PCR扩增产物与5’端标记地高辛的探针呈液相混合,85cC 2.5 min,60C1 min进行杂交,杂交后产物均经过链霉素亲和素酶标板进行固定,经过酶标仪记录抗地高辛标记抗体,结合、显色.结果 液相杂交酶联免疫检测条件的优化:地高辛的探针浓度为2.4 pmol/次,液相杂交时间为2.5min,固相杂交时间为100 min,检测结果差异无统计学意义(P＞0.05);本试剂对87份“HBsAg+、HbeAg+、抗HBc+”标本的阳性检出率为91.95％; 72例“HBsAg+、抗-Hbe+、抗HBc+”标本的阳性检出率为68.06％,其他免疫检测指标组合标本为16份.结论 HBV的液相杂交技术应用于聚合酶链反应酶联免疫检测(PCR-ELISA),该杂交技术的实验操作简便,快速,适合于临床实验室的检测.     

荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA假阴性结果原因分析

目的探讨荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus, HBV-DNA)产生假阴性结果的原因,以控制和减少假阴性结果。 方法依据第三版《临床检验操作规程》和2013版中国合格评定国家认可委员会(China National Accreditation Service for Conformity Assessment,CNAS)-CL36《医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的应用说明》,对当天送检的79份HBV DNA定量项目出现HBV-DNA假阴性的临床标本进行复查,并通过试验研究对试剂、仪器、操作过程和环境等原因分别进行确认。首先,分析2015年5月13日检测的79份临床送检的HBV-DNA定量检测血清标本和质控品的仪器原始结果,排除试剂、仪器和人员问题;其次,5次重复实验验证HBV-DNA定量结果为10⁷ IU/ml的临床血清样本是否因主要操作步骤不规范导致HBV-DNA定量检测结果下降(偏倚>7.5%)。选择第一次检测结果在6次方以上的血清标本2份,平行做5个复孔,其中1份标本做5个复孔,即用取上清液时所弃沉淀分别以不弃掉沉淀、弃掉1/4沉淀、2/4沉淀、3/4沉淀和全部沉淀分为A0、A1、A2、A3、A4组,比较弃上清液中沉淀量对HBV DNA定量检测结果的影响。另1份标本5个复孔在加模板量时,以正常加2 μl为对照组A0,其他4孔分别加1.5、1、0.5、0.1 μl模板为A1、A2、A3、A4组,分析模板加样量的不同对HBV DNA定量检测结果的影响;第三,挑选第一次HBV DNA定量检测结果为不同次方的10份血清标本,其中5份分别加入1 μl除胶剂,另5份分别加入1 μl含氯消毒液,验证是否因除胶剂或含氯消毒液导致HBV-DNA定量检测出现假阴性结果(偏倚>7.5%)。 结果操作过程中弃上清液时,A1~A4组与A0比较,各孔的偏倚均<7.5%,无差异。加入不同量的模板,A1和A2与A0比较,无差异(偏倚均<7.5%),随着模板加入HBV DNA量的减少,A3和A4孔HBV DNA值逐渐降低,偏倚均>7.5%。加入商用除胶剂1 μl后的检测结果与初次检测结果比较,5份标本中,有3份标本检测结果偏倚>7.5%。加入含氯消毒液1 μl后的检测结果与初次检测结果比较,5份标本中有3份标本检测结果偏倚>7.5%,其中有1份标本结果由阳性(10⁷ IU/ml)变为阴性。 结论除胶剂和次氯酸气溶胶对荧光定量PCR的DNA模板扩增环节的抑制作用是产生荧光定量PCR检测HBV-DNA假阴性的主要原因,临床基因实验室应当注意使用除胶剂和次氯酸消毒液后通风与降低次氯酸在空气中浓度过高问题。     

实时荧光PCR法检测乙型肝炎病毒基因型

目的:建立实时荧光PCR法检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型。方法:根据乙肝病毒基因序列选取保守区域设计引物,结合不同基因型的差异设计各型的特异荧光探针检测乙型肝炎基因B、C型。结果:200例HBV感染者中基因B型70例占35%,基因C型120例占60%,基因B,C混合型10例占5%,未捡出基因型A、D、E、F,分别取B、C型基因标本10例进行测序结果一致。结论:实时荧光PCR检测乙型肝炎基因型操作简单、快速、适合临床常规检测。     

中国11城市乙型肝炎病毒慢性感染者中乙型肝炎病毒基因型分布

目的了解中国乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染者中HBV基因型的分布情况。方法收集北京、清远、深圳、石家庄、汉川、南京、长春、济南、聊城、宁波和温州市共1214份HBV DNA阳性的慢性HBV感染者血清样本,用型特异性引物聚合酶链反应法（PCR）进行基因型测定,并对其中部分样本以PCR产物直接测序验证。结果在1214份血清中,检测到A基因型9例,占0．7%;B基因型345例,占28．4%;C基因型709例,占58．4%;B、C混合基因型（B＋C）151例,占12．4%。未检测到其他基因型。北方地区（长春、北京、石家庄市等）慢性HBV感染者中,C基因型比例较高,分别为58．2%、67．5%和63．6%,山东省聊城和济南市的C基因型比例分别高达90．2%和87．9%。随地理位置南移,B基因型比例逐渐增加,广东省清远和深圳市的B基因型比例分别为71．4%和63．6%。结论HBV基因型分布有明显地区差异。在中国慢性HBV感染者中,HBV C和B基因型为主要流行株。北方地区以C基因型为优势株,而南方地区则B基因型较为多见。     

PCR荧光法对乙型肝炎病毒基因分型的检测及临床意义

目的 用荧光聚合酶链反应(PCR)技术,对乙型肝炎(HBV)患者基因型进行检测,了解该地区HBV基因型分布及其与肝功能损害、病毒复制水平的关系.方法 采用荧光聚合酶链反应(PCR),检测乙型肝炎病毒基因型,通过荧光探针识别基因型特异性序列,采集分析荧光信号确定病毒基因型,并分别检测谷丙转氨酶(ALT)水平、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)和HBV-DNA含量.结果 532例慢性HBV感染者中,HBV基因型以C型为.主占60.2％,其次为B型占31.6％,B、C混合型占6.0％,未分型占2.3％例;C基因型HBV-DNA水平和HBeAg阳性率分别为(6.41±1.15)lg拷贝/ml和91.3％,明显高于B型(5.88±1.30)lg拷贝/ml和83.3％,差异有统计学意义(P＜0.01);C基因型患者的ALT(130.16±197.19)U/L高于B基因型(125.6±145.02)U/L,但差异无统计学意义.结论 甘肃地区HBV基因型以C型为主,B型次之,C基因型HBV-DNA水平显著高于B基因型,C基因型HBeAg阳性率较B基因型高,C基因型对肝脏损害较B基因型重,并与HBV载量及HBeAg系统具有相关性.     

乙型肝炎病毒基因型检测及其临床意义

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)基因型与抗病毒治疗前后患者HBV DNA载量、肝功能和HBeAg的相关性及其临床意义。方法采用聚合酶链反应(PCR)-反向点杂交法对87例慢性乙型肝炎患者HBV进行基因分型,分别用连续监测法、荧光定量PCR法和ELISA法检测患者治疗前、治疗6、12个月后的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、HBV DNA载量和乙型肝炎两对半。结果 87例慢性乙型肝炎患者感染的HBV中B型58例,占66.7%,C型24例,占27.6%,B、C混合型3例,占3.4%,未分型2例,占2.3%;抗病毒治疗前,B基因型患者的ALT[(151.3±5.6)U/L]低于C基因型患者的ALT[(232.5±7.3)U/L],差异有统计学意义(P<0.05);B、C基因型患者HBV DNA载量分别为7.3±1.0和7.6±1.1,差异无统计学意义;抗病毒治疗后,B、C基因型患者ALT和HBV DNA载量均比治疗前降低,且B基因型患者HBV DNA载量显著低于C基因型患者,P<0.05;B基因型的HBeAg阴转率(62.1%)和HBV DNA阴转率(44.8%)显著高于C基因型,分别为29.2%和20.8%,P<0.05。结论广州地区HBV基因型以B型占显著优势,其次是C型,B基因型的临床表现轻于C基因型,对抗病毒治疗的应答反应更好,且较C基因型有更高的HBeAg阴转率。     

肝组织中HBV cccDNA荧光定量聚合酶链反应检测法的建立

目的 建立和优化一种灵敏、特异的检测肝组织中乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)荧光定量聚合酶链反应(荧光定量PCR).方法 设计检测HBV DNA(tDNA)和cccDNA特异性引物及探针,用3.44×100-3.44×109copies/μl含HBV全基因组序列(C基因型)质粒作为标准品,建立荧光定量PCR检测标准曲线.取33例乙肝肝癌患者肝组织标本、13例慢性乙肝患者肝活检组织标本和10例非乙肝患者肝组织标本,验证该法灵敏度和特异度.提取肝组织中DNA,取一部分进行质粒安全ATP依赖的DNA酶(PSAD)酶切;另一部分不酶切作为tDNA和β-globin检测样本,分别进行HBV cccDNA、tDNA和p-globin定量检测,以β-globin为参比,对每个细胞的HBV cccDNA和tDNA含量进行标准化.结果 检测肝组织中HBV cccDNA和tDNA定量的线型范围均为3.44 × 100-3.44×109 copies/μl.检测HBV cccDNA和HBV DNA下限均为3.44×100copies/μl.33例乙肝肝癌患者和13例慢性乙肝患者的肝组织中HBV cccDNA最低含量分别为0.003 copies/cell和0.031 copies/cell;检测10份非乙肝肝癌患者的肝组织标本均为阴性.应用PSAD消化肝组织中提取的DNA可减少假阳性,提高cccDNA检测法特异度达7.24× 102倍.对2例乙肝肝癌患者的肝组织标本重复检测5次,Ct值的变异系数为0.224%～0.609%.结论 该方法灵敏度和特异度高,重复性好,可用于检测肝组织中HBV cccDNA.

Abstract：

Objective To establish and optimize a sensitive and specific quantitative realtime polymerase chain reaction(PCR)method for detection of hepatitis B virus covalently closed circular DNA(HBV cccDNA)in liver tissue. Methods Specific primers and probes were designed to detect HBV DNA(tDNA)and cccDNA. A series of plasmids(3.44 × 100-3.44 × 109 copies/μl)containing a full double-stranded copies of HBV genome(genotype C)were used to establish the standard curve of real-time PCR. Liver samples of 33 patients with HBV related hepatocellular carcinoma(HCC), 13 Chronic hepatitis B patients(CHB)and 10 non-HBV patients were collected to verify the sensitivity and specificity of the assay. A fraction of extracted DNA was digested with a Plasmid-Safe ATP-dependent Dnase(PSAD)for HBV cccDNA detection and the remaining was used for tDNA and β-globin detection. The amount(copies/cell)of HBV cccDNA and tDNA were measured by a real-time PCR, using β-globin housekeeping gene as a quantitation standard. Results The standard curves of real-time PCR with a linear range of 3.44 × 100 to 3.44 × 109 copies/μl were established for detecting HBV cccDNA and tDNA, and both of the lowest detection limits of HBV cccDNA and tDNA were 3.44 × 100 copies/μl. The lowest quantitation levels of HBV cccDNA in liver tissues tested in 33 HBV related HCC patients and 13 CHB patients were 0.003 copies/cell and 0.031copies/cell, respectively. HBV cccDNA and tDNA in liver tissue of 10 non-HBV patient appeared to be negative. The true positive rate was increasing through the digestion of HBV DNA by PSAD, and the analytic specificity of cccDNA detection improved by 7.24 × 102 times. Liver tissues of 2 patients were retested 5 times in the PCR for detecting cccDNA and the coefficience of variations on cycle threshold (Ct)were between 0.224%-0.609%. Conclusion A highly sensitive and specific quantitative real time PCR method for the detection of HBV cccDNA in liver tissue was established and could be used for clinical and epidemiological studies.     

乙型肝炎病毒学检验结果分析

目的 了解乙型肝炎病毒(HBV)病毒学检测特点,探讨HBV基因分型与HBeAg、抗-HBc-IgM、HBV DNA及疾病进展的关系.方法 采用ELISA法检测深圳地区200例乙型病毒性肝炎患者的两对半标志物(HBsAg,抗-HBs,HBeAg,抗-HBe,抗-HBc)及抗-HBc-IgM,采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法进行HBV DNA定量检测,用单克隆抗体ELISA法进行HBV基因分型,并对检验结果 进行分析.结果 在200例乙型病毒性肝炎患者中测定出HBV基因分型179例(89.5%),B型121例(60.5%),C型58例(29.0%).HBeAg、抗-HBc-IgM、HBV DNA与基因分型无关.B型多见于无症状HBsAg携带者及慢性乙型病毒性肝炎患者;C型多见于肝硬化及慢性乙型病毒性肝炎患者.结论 深圳地区HBV基因分型以B型为主,C型次之.单克隆抗体ELISA法检测HBV基因分型具有特异、敏感、简单和实用的特点,HBV复制强弱与病毒基因分型无关.HBV基因分型与HBeAg、抗-HBc-IgM、HBV DNA检验可相互补充,具有临床应用价值.     

肝组织中HBV cccDNA荧光定量聚合酶链反应检测法的建立

目的 建立和优化一种灵敏、特异的检测肝组织中乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)荧光定量聚合酶链反应(荧光定量PCR).方法 设计检测HBV DNA(tDNA)和cccDNA特异性引物及探针,用3.44×10⁰-3.44×10⁹copies/μl含HBV全基因组序列(C基因型)质粒作为标准品,建立荧光定量PCR检测标准曲线.取33例乙肝肝癌患者肝组织标本、13例慢性乙肝患者肝活检组织标本和10例非乙肝患者肝组织标本,验证该法灵敏度和特异度.提取肝组织中DNA,取一部分进行质粒安全ATP依赖的DNA酶(PSAD)酶切;另一部分不酶切作为tDNA和β-globin检测样本,分别进行HBV cccDNA、tDNA和p-globin定量检测,以β-globin为参比,对每个细胞的HBV cccDNA和tDNA含量进行标准化.结果 检测肝组织中HBV cccDNA和tDNA定量的线型范围均为3.44 × 10⁰-3.44×10⁹ copies/μl.检测HBV cccDNA和HBV DNA下限均为3.44×10⁰copies/μl.33例乙肝肝癌患者和13例慢性乙肝患者的肝组织中HBV cccDNA最低含量分别为0.003 copies/cell和0.031 copies/cell;检测10份非乙肝肝癌患者的肝组织标本均为阴性.应用PSAD消化肝组织中提取的DNA可减少假阳性,提高cccDNA检测法特异度达7.24× 10²倍.对2例乙肝肝癌患者的肝组织标本重复检测5次,Ct值的变异系数为0.224%～0.609%.结论 该方法灵敏度和特异度高,重复性好,可用于检测肝组织中HBV cccDNA.