Fas siRNA真核表达载体构建及其抑制Jurkat细胞凋亡的作用

 目的 构建Fas（CD95）特异性siRNA真核表达载体psilencircle-FasSi,转染Fas-FasL凋亡敏感细胞株Jurkat,研究其抗凋亡作用。方法 通过聚合酶链式反应（PCR）制备siRNA表达框架(SECs),转染Jurkat细胞,实时荧光定量PCR检测Fas mRNA抑制率,筛选出高效抑制Fas mRNA表达的siRNA;把筛选出的siRNA序列插入siRNA真核表达质粒psilencircle,构建psilencircle-FasSi;psilecircle FasSi转染Jurkat细胞,实时荧光定量PCR检测Fas mRNA、Western blot检测Fas蛋白;anti-Fas mAb刺激Jurkat细胞凋亡,流式细胞术检测Jurkat细胞凋亡率。结果 酶切、测序证明成功构建了psilecircle-FasSi,实时荧光定量PCR及Western blot表明psilencircle-FasSi可抑制Fas mRNA和蛋白表达,流式细胞术检测证实psilencircle-FasSi可抑制Jurkat凋亡率。结论 我们成功构建了Fas特异性siRNA真核表达载体psilencircle-FasSi,它不仅可以下调Jurkat细胞的Fas表达而且可以显著抑制Fas-FasL途径诱导的凋亡。     

Survivin反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

恶性肿瘤无限增殖的主要原因是细胞凋亡调控障碍.Survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein,IAP)成员[1],特异性表达人类多种常见肿瘤中,而不存在于正常成人组织,能抑制caspase活性而发挥抗凋亡作用[2].有研究表明[3-4],应用反义策略阻断survivin表达可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,诱导凋亡的发生,已成为肿瘤治疗的新亮点.     

survivin启动子调控siRNA真核表达载体的构建及对HeLa细胞中stathmin基因的干涉作用

目的：探讨survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体对HeLa细胞中stathmin基因表达的肿瘤特异性封闭作用。方法：合成针对人stathmin基因的siRNAcDNA寡核苷酸链退火形成双链，连接入经BamHI和HindIII双酶切后的pSilencer4．1-CMVneo真核表达载体。PCR扩增suvivin基因启动子并测序，用EcoRI和BamHl分别双酶切，连接至经相同内切酶消化的载体，获得survivin启动子调控的siRNA真核表达载体，酶切及测序鉴定。脂质体法转染重组质粒人HeLa细胞，G418筛选。RT-PCR扩增stathmin基因，检测其对stathmin基因表达的干涉效果；流式细胞仪分析转染后HeLa细胞增殖周期的改变。结果：经酶切及测序鉴定，成功构建重组质粒；RT—PCR结果显示所构建的干涉载体可有效封闭stathmin基因表达；流式细胞仪分析结果显示，Hale细胞在stathminsiRNA作用下G2／M期细胞的比例明显增加。结论：survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体可有效地封闭HeLa细胞中stathmin基因表达并使HeLa细胞阻断于G2／M期，为以stathmin基因为靶点的恶性肿瘤生物治疗奠定了理论基础。     

Survivin基因真核表达载体的构建及其在cos-7中的表达

[目的]克隆人survivin基因并在真核细胞中表达。[方法]以人喉癌组织中提取总RNA为模版，采用反转录聚合酶链RT-PCR法获得survivin cDNA。将该基因克隆到pcDNA3．0载体中，构建真核细胞表达载体pcDNA3．0／survivin，将测序正确的survivin基因通过脂质体介导下转染cos-7,Westem blot检测survivin蛋白在cos-7中表达。[结果]DNA测序证明获得了survivin基因，其序列与GeneBank中报道序列完全一致。Western blot检测survivin蛋白获得高效表达，其相对分子质量为16．5kD。[结论]Survivin基因的克隆和表达均获得了成功，为进一步探讨survivin基因在喉癌诊治中应用奠定了基础。     

Survivin反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 为了特异封闭白血病细胞survivin的表达，抑制其功能，本实验构建了survivin反义核酸载体并导入白血病细胞系中。方法 应用RT—PCR获得survivin的cDNA片段，反向插入pcDNA3质粒载体中；经限制性酶切和测序鉴定所构建的反义核酸是否正确；采用电转染方法将重组体导入HL—60细胞中；RT—PCR技术检测转染细胞survivin表达的变化。结果 经限制性酶切和测序鉴定证明survivin反义核酸已成功构建；RT—PCR产物电泳结果显示，与转染前细胞、空质粒转染细胞相比，转染survivin反义核酸的细胞survivin mRNA水平明显降低。结论 本实验已成功建立了survivin反义核酸真核表达载体，而且在白血病细胞系中发挥了特异封闭作用，为进一步研究survivin反义核酸在白血病治疗中的作用提供了实验基础。     

survivin启动子调控siRNA真核表达载体的构建及对HeLa细胞中stathmin基因的干涉作用

目的:探讨survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体对HeLa细胞中stathmin基因表达的肿瘤特异性封闭作用。方法:合成针对人stathmin基因的siRNA cDNA寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHI和HindIII双酶切后的pSilencer4.1-CMV neo真核表达载体。PCR扩增suvivin基因启动子并测序,用EcoRI和BamHI分别双酶切,连接至经相同内切酶消化的载体,获得survivin启动子调控的siRNA真核表达载体,酶切及测序鉴定。脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,G418筛选。RT-PCR扩增stathmin基因,检测其对stathmin基因表达的干涉效果;流式细胞仪分析转染后HeLa细胞增殖周期的改变。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建重组质粒;RT-PCR结果显示所构建的干涉载体可有效封闭stathmin基因表达;流式细胞仪分析结果显示,Hale细胞在stathmin siRNA作用下G2/M期细胞的比例明显增加。结论:survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体可有效地封闭HeLa细胞中stathmin基因表达并使HeLa细胞阻断于G2/M期,为以stathmin基因为靶点的恶性肿瘤生物治疗奠定了理论基础。     

凋亡素体外诱导表达Survivin膀胱癌细胞凋亡效果观察

目的:观察凋亡素对表达Survivin膀胱癌细胞株的作用效果,并结合相应机制探讨其临床意义.方法:利用免疫组织化学法检测膀胱癌细胞株BIU-87中Survivin的表达水平,并计算平均每高倍镜视野中阳性细胞比率.将肿瘤细胞分为单纯细胞组、转染空质粒pCDNA3组及转染pCDNA3/Apoptin组,利用脂质体转染法将真核表达栽体pCDNA3/Apoptin及pCDNA3空质粒转染入膀胱癌细胞中,并于转染后24h通过RT-PCR法检测细胞中Apoptin的表达情况.分别于转染后24、48、72h利用MTT法检测各组细胞存活率,并利用流式细胞仪TUNEL法检测各组细胞的凋亡率.结果:利用免疫组织化学法检测发现膀胱癌细胞株BIU-87中Survivin呈高表达状态,平均每个高倍镜视野中阳性细胞比例约70%,并有较多细胞呈现高表达状态.转染后24h通过RT-PCR法可见Apoptin在膀胱癌细胞中表达.分别于转染后24、48、72h利用MTT法检测各组细胞存活率,发现转染pCDNA3/Apoptin组肿瘤细胞存活率均明显低于对照组,差别有统计学意义(P<0.05);利用流式细胞仪TUNEL法检测各组细胞的凋亡率,发现转染pCDNA3/Apoptin组肿瘤细胞凋亡率均明显高于对照组,差别有统计学意义(P<0.05).结论:凋亡素可在体外诱导高表达Survivin的膀胱癌细胞株BIU-87高效凋亡,结合相关机制表明凋亡素可在一定程度上克服Survivin的抗凋亡作用,因此有可能成为Survivin拮抗的抗肿瘤药物的协同用药选择.     

Survivin特异性siRNA真核表达载体的构建

目的构建Survivin特异性siRNA真核表达载体，为以Survivin基因为靶点、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）为手段的白血病和其它恶性肿瘤基因治疗的基础和临床应用提供良好的技术手段。方法根据GeneBank数据库提供的Survivin基因所有变异体的共同核苷酸序列，按照Tuschl设计原则，选择设计双链siRNA，再转化为能表达其小发卡结构RNA（small hairpin RNA，shRNA）的DNA序列，并与载体pSINsi-hU6定向连接，构建受控于启动子u6的真核表达载体pSIN／shRNA1、pSIN／shR-NA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果构建Survivin特异性siRNA真核表达载体pSIN／shRNA1、pSIN／shRNA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。结论Survivin特异性siRNA真核表达载体构建成功。     

siRNA抑制survivin基因周期的影响表达对HeLa细胞

目的设计靶向survivin基因的干涉片段,构建真核表达载体pSUPER／survivin并转染宫颈癌HeLa细胞,探讨siRNA抑制survivin表达对联合1射线宫颈癌HeLa细胞周期的影响。方法化学合成干涉引物,退火获得survivin基因的干涉片段,连入pSUPER载体并测序。将测序正确的pSUPER／survivin载体转染HeLa细胞株,RT—PCR法和流式细胞术检测HeLa细胞中survivin基因的表达,流式细胞术检测转染联合＇射线照射后各组细胞的细胞周期数据。结果本实验成功的构建了pSUPER／survivin载体。转染pSUPER／survivin的HeLa细胞其survivin基因表达水平明显低于未转染的HeLa细胞及转染空载体pSUPER的HeLa细胞。1射线照射后,转染pSUPER／survivin的HeLa细胞发生了S期细胞比例下降,及G2／M期阻滞。结论成功的构建了pSUPER／survivin载体,siRNA干涉survivin可以作为提高放射敏感性的潜在分子靶点,通过减少S期细胞比例,促进肿瘤细胞凋亡,通过增加G2／M期阻滞增加放射线的杀伤。     

siRNA介导的survivin基因沉默诱导人膀胱癌BIU-87细胞凋亡的研究

[目的]研究siRNA（small interference RNA）对人膀胱癌BIU-87细胞凋亡和survivin基因表达的影响。[方法]利用Ambion公司设计软件，设计并体外转录合成针对survivin基因的3个特异性siRNA，通过脂质体将siRNA转入BIU-87细胞，分别采用MTT和DNA原位末端标记（TUNEL）法检测siRNA对BIU-87细胞生长抑制率（IR）和凋亡指数（AI），半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western Blotting检测siRNA对survivin mRNA及其蛋白表达的影响。[结果]转染后的siRNA1～3组的BIU-87细胞的IR（41.84%、56.21%、54.13%）和AI（21.98%、36.54%、31.34%）均分别显著高于正常对照组（1.98%和3.17%）（P＜0.05），survivin mRNA及其蛋白表达水平均显著低于对照组；其中siRNA2～3对BIU-87细胞的IR、AI和survivin表达的抑制作用均显著高于siRNA1。[结论]体外转录合成的siRNA可抑制BIU-87细胞survivin的表达，诱导BIU-87细胞凋亡，从而抑制BIU-87细胞生长，为siRNA介导的膀胱肿瘤基因沉默提供实验依据。     

聚酰胺树形分子-脂质体介导survivin反义寡核苷酸诱导肝癌细胞的凋亡

目的:评价聚酰胺-胺型树枝状高聚合物(polyamidoamine,PAMAM)-脂质体复合物作为survivin反义寡核苷酸(survivin antisense oligonucleotide,survivin-asODN)载体传递系统的可行性,及其对人肝癌SMMC-7721细胞survivin表达、细胞凋亡的影响。方法:制备PAMAM与脂质体的复合物(PAMAM-脂质体),将survivin-asODN与PAMAM-脂质体或PAMAM混合,分别制备PAMAM-脂质体-survivin-asODN和PAMAM-survivin-asODN。透射电镜观察复合物的形态、粒径;zeta电位分析仪测定复合物的zeta电位;离心法和紫外分光光度仪测定复合物的包封率、载药率。将PAMAM-脂质体-survivin-asODN和PAM-AM-survivin-asODN转染SMMC-7721细胞,测定其转染率;Western blotting检测转染后SMMC-7721细胞中survivin蛋白的表达;流式细胞术检测SMMC-7721细胞的凋亡。结果:成功制备PAMAM-脂质体、PAMAM-脂质体-survivin-asODN和PAMAM-survivin-asODN。PAMAM-脂质体-survivin-asODN粒径与PAMAM-survivin-asODN粒径无显著差异[(189.33±15.42)vs(181.83±13.67)nm,P>0.05],包封率和载药率也无显著差异(P>0.05),但zeta电位高于后者[(42.83±7.14)vs(32.33±5.57)mV,P<0.05],PAMAM-脂质体-survivin-asODN转染SMMC-7721细胞的效率高于PAMAM-survivin-asODN[(73.33±9.29)%vs(60.67±7.81)%,P<0.05],转染后SMMC-7721细胞中survivin蛋白的表达较低(24.67±11.74 vs43.17±11.63,P<0.05),但细胞凋亡率高于PAMAM-survivin-asODN组SMMC-7721细胞[(73.31±12.59)%vs(52.67±12.19)%,P<0.05]。结论:PAMAM-脂质体能将survivin-asODN高效递送到人肝癌SMMC-7721细胞,诱导细胞凋亡。     

胃癌相关基因GCRG213小干扰RNA表达载体的构建及其对胃癌细胞的影响

目的探讨胃癌相关基因GCRG213小干扰RNA(siRNA)转染对胃癌细胞MKN45的影响。方法设计两对针对GCRG213可转录为siRNA的DNA片段,退火后插入siRNA表达载体IMG-800。测序正确的重组子IMG-800-1(含干扰片段1)、IMG-800-2(含干扰片段2)和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株。采用半定量RT-PCR及Western免疫印迹法,比较转染不同质粒的MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异。选取稳定转染不同质粒的MKN45细胞,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞的增殖状态,Annexin V FITC/PI双标记法检测凋亡细胞,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性。结果经测序证实,干扰片段退火后正确插入小干扰RNA表达载体IMG- 800,组成重组子IMG-800-1和IMG-800-2。重组子IMG-800-1、IMG-800-2和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株。与对应的空载体比较,RT-PCR结果显示,转染siRNA的MKN45细胞中,mRNA的表达分别下调44.9%和49.5%;Western印迹法结果显示,转染siRNA的MKN45细胞中,蛋白的表达分别下调55.3%和64.2%。与转染空载体的细胞相比,转染siRNA的MKN45细胞生长增殖速度明显减慢,细胞周期表现为处于G0～G1期的细胞有所增加,G2/M期和(或)S期的细胞比例减少,细胞凋亡率增加,细胞克隆形成数量减少,裸鼠体内成瘤性降低。结论胃癌相关基因GCRG213 siRNA转染,可抑制肿瘤细胞的生长和增殖,促进肿瘤细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞的成瘤性。     

人微管不稳定蛋白基因真核表达载体的构建与表达及对食管癌细胞的作用

目的 构建人微管不稳定蛋白基因(stathmin)真核表达载体,研究其对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增stathmin cDNA,克隆至pMDl8-T载体并酶切鉴定后,亚克隆至pEGFP-C2真核表达载体.将测序鉴定正确的重组载体和空载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察转染细胞荧光蛋白的表达,采用Western blot检测转染细胞中增强型荧光蛋白(EGFP)和stathmin融合蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪分析细胞的增殖状态,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定后获反向插入质粒;亚克隆至pEGFP-C2载体后,经酶切与测序鉴定,重组载体pEGFP-stathmin构建成功.重组载体和空载体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察到,转染细胞中呈现绿色荧光;经Western blot证实,重组载体表达46 000的融合蛋白.与空载体转染细胞相比,转染重组载体的EC9706细胞形态变大,增殖速度减慢,细胞分裂阻滞于G2/M期,细胞克隆形成数减少,裸鼠体内成瘤性降低(P＜0.05).结论 构建的真核表达载体pEGFP-stathmin在食管癌EC9706细胞中能够稳定表达,并抑制肿瘤细胞的增殖和成瘤性.     

BLCAP基因cDNA的克隆及siRNA表达载体的构建

目的：克隆BLCAP基因cDNA并构建和鉴定针对于BLCAP基因的siRNA真核表达载体.方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得BLCAP基因.将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,酶切及测序鉴定.将合成的siRNA核酸片段退火形成双链后连接到经BamHI和HindⅢ双酶切后的pSilencer4.1真核表达载体,命名为pSilencer4.1-B1以及pSilencer4.1-B2,并进行酶切及测序鉴定.脂质体法转染SOSP-9607细胞系,G418筛选以及RT-PCR验证构建的真核表达载体对目的基因的干涉情况.结果：经酶切及测序鉴定,所获得的目的片段序列BLCAP基因完全相符.重组质粒中含有与理论值相符的插入片段,其测序结果与设计序列一致.经脂质体法转染后pSilencer4.1-B2可明显抑制SOAP-9607细胞的BLCAP表达.结论：成功克隆了BLCAP基因并cDNA构建和验证了其siRNA真核表达载体.     

Construction of PR domain eukaryotic expression vector and its inhibitory effect on esophageal cancer cells

Objective：PR domain is responsible for the tumor suppressing activity of RIZ1.The study aimed to construct human PR domain eukaryotic expression vectors,transfect human esophageal cancer cells （TE13）,and evaluate the anticancer activity of PR domain on human esophageal cancer TE13 cells.Methods：First,mRNA was extracted from human esophageal cancer tissue by RT-PCR,then reversetranscribed to cDNA.After amplifying from the DNA template,PR domain was linked to T vector.Second,after extraction,PR domain was cut using enzyme and linked to pcDNA3.1（＋）.Then,the plasmid was transfered to Trans1-T1 phage resistant competent cells,following by extracting the ultrapure plasmid,and transfecting into TE13 cells.In the end,the protein expression of pcDNA3.1（＋）/PR domain in TE13 was detected by Western blot,and the apoptosis of TE 13 by technique of flow cytometry.Results：More than 5,000 bp purposed band of pcDNA3.1（＋）/PR domain plasmid was found by agarose gel electrophoresis.After transfection,the PR domain （molecular weight of about 28 Da） was found only in 3,4 and 5 groups by Western blot.Flow cytometry assay showed apoptosis in experimental group was significantly more than that in the control group （P＜0.05）.Conclusions：The PR domain eukaryotic expression vector was constructed successfully.The protein of the PR domain could be expressed in esophageal cancer TE13 cells firmly after transfection,and a single PR domain could promote apoptosis of TE13 cells.     

Survivin反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞生长的抑制

目的: 观察survivin反义寡聚脱氧核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide ，ASODN）对人胃癌细胞株SGC7901的抑制作用。方法：用ASODN与人胃癌细胞SGC7901共同温育一定时间后，PCR检测ASODN处理后肿瘤细胞survivin mRNA的表达，倒置显微镜、电镜观察细胞生长形态变化     

凋亡抑制因子反义核酸对肝癌细胞生物学作用研究

目的探讨survivin反义寡核苷酸对人肝癌细胞凋亡、增殖的影响。方法设计合成特异性sur-vivin的反义寡核苷酸(ASODN)。以高表达survivin基因的人肝癌细胞系(SMMC-7721)为靶细胞、反义sur vivin(AS-ODN)为阻断剂,倒置显微镜观察细胞形态变化,WesternBlot法检测细胞survivin表达情况,MTT试验观察AS-ODN对该细胞系的生长抑制作用,流式细胞仪分析细胞增殖周期。结果AS-ODN明显抑制了SMMC-7721肝癌细胞的生长,细胞分裂阻滞在分裂期的中期,并诱导细胞发生凋亡,而各对照组细胞生长良好,细胞增殖指数明显低于各对照组(P<0.05)。结论survivingASODN能下调其蛋白表达,诱导人肝癌细胞凋亡,抑制细胞增殖。     

miRNA-126真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖和迁移的抑制作用

目的： 构建miRNA-126的重组真核表达载体,研究其对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖和迁移的影响。 方法: 设计合成miRNA-126的正义和反义寡核苷酸,构建真核表达载体pcDNA6.2-miR-126,体外瞬时转染至4T1细胞,荧光显微镜下观测转染效率。Real-time PCR检测4T1细胞中miRNA-126的表达,MTT法和克隆形成实验检测4T1细胞的增殖和克隆形成能力,划痕法观察4T1细胞的体外迁移。 结果： 成功构建pcDNA6.2-miR-126真核表达载体,其可在4T1细胞中有效表达miR-126。与转染空质粒组（pcDNA6.2-Ctrl）相比,瞬时转染72 h后,pcDNA6.2-miR-126转染组4T1细胞的体外增殖能力受到明显抑制\[(030±0.03) vs (0.51±0.04),P<0.05\];瞬时转染48 h后,pcDNA6.2-miR-126组4T1细胞迁移能力也受到明显抑制\[(817±2.30) vs (28.33±2.16)个,P<0.05\]。 结论： miRNA-126过表达可抑制乳腺癌4T1细胞的增殖及迁移。