基于CD_(107a)标记流式细胞仪检测NK细胞毒性方法的建立

目的建立基于CD107a标记、利用流式细胞仪检测NK细胞毒性的方法。方法首先将外周血单个核细胞(PBM-Cs)与K562细胞以3∶1比例混合,2 h后加入莫能菌素,1.5 h后加入CD107a和CD56标记抗体,流式细胞仪分析CD107a阳性细胞的频率。其次观察CD107a抗体孵育时间、不同效靶比例对CD107a阳性细胞检测的影响。最后观察该方法与传统LDH释放法检测NK细胞毒活性的一致性。结果 NK细胞活化后可在其表面检测到高水平表达的CD107a分子,效靶细胞孵育结束后加入CD107a抗体可降低检测背景,低效靶比例同样具有检测敏感性。该方法与LDH释放法的检测结果一致。结论利用CD107a抗体标记检测NK细胞毒活性的方法具有快速、敏感、所需效应细胞少的优点。     

利用流式细胞仪检测人外周血NK细胞毒性方法的建立

目的利用流式细胞仪（FAcs）技术检测人外周血NK细胞的毒性。方法首先将pEGFP-N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562，经过G418筛选后进一步单克隆化，得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的K562细胞。取对数期的K562-EGFP细胞与人外周血单个核细胞分别按5：1、10：1、20：1、40：1的比例混合，分别孵育0．5、1、2、4h后用碘化丙啶（PI）标记，用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数，最后计算NK细胞的杀伤效率。结果0．5、1、2、4h均能得到明显的杀伤效果，而且以2h的杀伤率最高。此时杀伤率与传统乳酸脱氢酶法（LDH）具有显著相关性（7=0．997，P=0．003），而且显示出更强的敏感性。结论利用流式细胞仪检测NK细胞毒活性的方法可作为传统^51Cr释放法、LDH法的一个补充，而且具有经济、快速和敏感的特点。     

利用流式细胞仪检测人外周血NK细胞毒性方法的建立

目的利用流式细胞仪(FACS)技术检测人外周血NK细胞的毒性。方法首先将pEGFP-N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562,经过G418筛选后进一步单克隆化,得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的K562细胞。取对数期的K562-EGFP细胞与人外周血单个核细胞分别按5∶1、10∶1、20∶1、40∶1的比例混合,分别孵育0.5、1、2、4 h后用碘化丙啶(PI)标记,用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数,最后计算NK细胞的杀伤效率。结果0.5、1、2、4 h均能得到明显的杀伤效果,而且以2h的杀伤率最高。此时杀伤率与传统乳酸脱氢酶法(LDH)具有显著相关性(γ=0.997,P=0.003),而且显示出更强的敏感性。结论利用流式细胞仪检测NK细胞毒活性的方法可作为传统51Cr释放法、LDH法的一个补充,而且具有经济、快速和敏感的特点。     

流式细胞仪ProCOUNT方法计数CD34^＋细胞

目的：评价流式细胞仪ProCOUNT方法计数CD34^ 细胞的方法及其临床应用，方法：用核酸染料设阈值，根据已知的干／祖细胞特点，表达CD34抗，CD45弱阳性或阴性，核酸染料着色强及侧向散射光低表达，用多参数设门策略精确识别干／祖细胞，结果：ProCOUNT方法批内精密度为15．8％（CD34^ ／有核细胞＝0．035％）和9．3％（CD34^ ／有核细胞＝2．785），平均回收率91．8％，12例标本中CD34^ 细胞平均为1．99％，结果为7511／μl。结论：ProCOUNT法操作简便，精密度高，能准确计数CD34^ 细胞，适合临床常规应用。     

流式细胞仪ProCOUNT方法计数CD34+细胞

目的评价流式细胞仪ProCOUNT法计数CD34+细胞的方法及其临床应用.方法用核酸染料设阈值.根据已知的干/祖细胞特点表达CD34抗原、CD45弱阳性或阴性、核酸染料着色强及侧向散射光低表达,用多参数设门策略精确识别干/祖细胞.结果ProCOUNT方法批内精密度为15.8%(CD34+/有核细胞=0.035%)和 9.3%(CD34+/有核细胞=2.785),平均回收率91.8%.12例标本中CD34+细胞平均为1.99%,结果为7511/μl.结论ProCOUNT法操作简便,精密度高,能准确计数CD34+细胞,适合临床常规应用.     

高纯度CD3~-CD56~+CD16~+NK细胞体外扩增技术的研究

本研究探索高纯度CD3-CD56+CD16+NK细胞体外扩增技术。应用免疫磁珠分选法(MACS)分离出高纯度的CD3-CD56+CD16+NK细胞,置于含10%人AB血清的造血干细胞培养基(SCGM)中,加入细胞因子IL-2、IL-15、SCF组成不同培养体系进行体外扩增。采用细胞计数法、流式细胞术免疫表型分析和CCK-8试剂盒检测对K562细胞的杀伤率等方法比较不同培养体系对NK细胞增殖前后的数量、纯度及杀伤活性的影响;并采取相同方法对IL-2的浓度与NK细胞增殖效率及杀伤活性之间的关系进行探讨。结果发现,经免疫磁珠分选法所得的高纯度CD3-CD56+CD16+NK细胞扩增18天后,IL-2/IL-15/SCF组扩增倍数显著高于其他组(p0.05);含细胞因子组的NK细胞对K562细胞的杀伤活性显著提高,尤其是IL-2/IL-15组和IL-2/IL-15/SCF组在效靶比10∶1时杀伤活性均高达90%以上。低、中、高浓度IL-2组扩增倍数之间比较差异无显著性(p0.05),而在对K562细胞杀伤率的比较上,高浓度组明显高于低、中浓度组(p0.05)。结论:在10%人AB血清的SCGM中加入IL-2/SCF/IL-15细胞因子组合,可使经MACS纯化的NK细胞在体外高效地活化及增殖;本培养体系中IL-2浓度较低(1 000U/ml)时,NK细胞的扩增效率及对K562细胞的杀伤率与IL-2的浓度高低无相关性;而高浓度的IL-2(≥1 000U/ml)可进一步激活纯化后NK细胞的体外杀伤活性。     

CD16CD56NK细胞在重症肌无力发病机制中的作用

目的:研究重症肌无力(MG)患者外周血CD16+CD56+ NK细胞的水平,及其在MG发病机制中的作用.方法:应用流式细胞仪检测16例MG患者与20名正常对照外周血CD16+CD56+NK细胞的百分率.结果:MG组外周血CD16+CD56+NK细胞百分率(13.81±5.59)%明显高于对照组的(7.23±1.95)%,P <0.05.结论:NK细胞在MG发病中起重要作用,既可通过分泌IFN2γ等细胞因子途径促进MG的发病,也可通过细胞毒作用发挥免疫效应.     

流式细胞检测术分析胎肝CD34^＋细胞成分

目的了解胎肝中CD34+CD38+和CD34+CD38-细胞数量组成.方法从胎肝中分离细胞,制成细胞悬液;经淋巴细胞分离液密度梯度离心,收集单个核细胞;洗涤两次,制备细胞母液;取约1×106细胞经CD34CD38荧光抗体标记,流式细胞仪检测CD34+CD38+和CD34+CD38-细胞含量;用红细胞裂解液裂解残留在MNCs中的红细胞,统计肝细胞中MNCs的相对总数,最终统计出胎肝中CD34+和CD34+CD38-细胞的相对数量.结果 22～30W胎龄胎肝MNC中CD34+细胞平均为12.02%±4.00%,CD34+CD38-细胞平均为6.17%±5.08%,CD34+CD38-细胞在CD34+细胞中约占51.00%±32.56%;该期胎肝组织中CD34+细胞和CD34+CD38-细胞相对总数和胎龄有一定的相关性,30W时明显高于22W.结论 22～30W胎龄胎肝中的CD34+细胞和CD34+CD38-细胞相对百分率都高于胎儿脐血、新生儿脐血、成人骨髓和外周血的百分率;CD34+CD38-细胞在CD34+细胞中的比例也远高于上述四种组织中的比例.     

CyFlow Space流式细胞仪CD34+细胞绝对计数分析

目的 比较在Partec CyFlow Space流式细胞仪上采用不同设门方法计数CD34+造血干细胞结果的差异.方法 采集经骨髓动员的患者外周静脉血标本30例,在分别采用同型对照设门法和国际血液治疗与移植工程协会(ISHAGE)推荐设门法设置流式细胞仪后进行标本测定.结果 两种设门法标本计数结果具有相关性(r=0.9...     

AIDS患者与正常人CD8+CD25+、CD4+CD25+、B淋巴细胞、NK细胞与NKT细胞计数对照研究

目的方法研究AIDs患者与正常人CD8+CD25+、CD4+CD25+、B淋巴细胞、NK细胞与NKT细胞数量差异,进一步了解AIDs患者免疫功能状态。方法:将研究对象分为两组:AIDs患者组与正常对照组。分别对AIDs患者组40余份样本与正常对照组30份正常人全血样本进行CD8CD25、CD4+CD25+、B淋巴细胞、NK细胞与NKT细胞计数检测。结果与正常对照组相比,AIDs患者组CD8CD25、CD4+CD25+细胞计数显著增加,B淋巴细胞计数下降,NK细胞计数下降,P<0.05,差异具有统计学意义。NKT细胞计数下降,差异无统计学意义,P>0.05。结论 AIDs患者CD8+CD25+、CD4+CD25+细胞计数增加,B淋巴细胞与NK细胞计数下降,NKT细胞计数与正常人无显著差异。     

CD34+造血祖细胞定向诱导分化为T/NK细胞的研究进展

成熟T/NK细胞具有重要的移植免疫和抗肿瘤免疫效应。利用造血干/祖细胞具有多向分化的潜能,通过体外培养体系(含促进T/NK细胞分化发育的以下成份:如SCF、Flt-3L、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、TNF-α等细胞因子,胸腺肽/胸腺素,胸腺基质细胞等不同组合),定向诱导其分化为成熟的T/NK细胞,可用于造血干细胞移植后的细胞过继免疫治疗。本文就CD34~+造血祖细胞定向诱导分化为T/NK细胞的实验研究的理论基础和进展作一综述。     

FcγRⅢa基因多态性对利妥昔单克隆抗体介导的NK细胞杀伤Raji细胞作用的影响

由于FcγRⅢa的基因多态性可导致NK细胞上Fcγ受体(Fcgamma receptor,FcγR)与抗肿瘤单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)Fc段结合的亲和力不同,NK细胞以抗体依赖细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)对肿瘤细胞的杀伤能力也不同.本研究通过CFSE-PI双荧光染色法检测不同FcγRⅢa基因型的NK细胞对Raji细胞的ADCC效应强度,确定不同FcγRⅢa基因型的NK细胞所介导的AD-CC效应差异.用nest-PCR测定FcγRⅢa表型,用CFSE-PI双荧光染色法染色靶细胞(Raji细胞),用流式细胞术检测NK细胞上CD3-CD56+及FcγRⅢa的表达以及Raji细胞上CD20的表达,计算细胞毒性.结果表明:FcγRⅢa-158V/V基因型的NK细胞ADCC细胞毒性指数为(69.05±2.38)%,FcγRⅢa-158V/F基因型的NK细胞ADCC细胞毒性指数为(39.63±3.86)%,与V/V基因型相比,V/F基因型的NK细胞对Raji细胞的ADCC效应明显较弱,差异具有统计学意义(t=12.950,p=0.000).结论:FcγRⅢa基因多态性可影响利妥昔单克隆抗体介导的NK细胞对Raji细胞的体外ADCC效应.以FcγRⅢa-158V/V基因型的NK细胞ADCC效应较FcγRⅢa-158V/F基因型的NK细胞ADCC效应强.     

急性白血病儿童外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞和NK细胞的变化及其在白血病免疫中的意义

本研究观察急性白血病患儿外周血CD4^＋CCD25^＋调节性T细胞（CD4^＋CD25^＋Treg）及自然杀伤细胞（nature killer cell,NK）在不同病程阶段的变化,了解白血病患儿的免疫状态,以探讨CD4^＋CD25^＋Treg细胞及NK细胞在急性白血病肿瘤免疫中的意义。建立流式细胞术检测外周血CD4^＋CD25^＋Treg细胞和NK细胞的方法：检测急性白血病初诊患儿25例、完全缓解患儿28例及20例正常健康对照者外周血CD4^＋CD25^＋Treg细胞及NK细胞的数量及比例。结果表明：初诊组、完全缓解组及对照组外周血CD4^＋CD25^＋CD127^＋占CD4^＋T细胞的比例分别为（9．55±2．41）％,（8．54±2．51）％和（6．25±0．85）％,在初诊患儿组和缓解患儿组高于正常对照组,且在初诊患儿组高于完全缓解组（P〈0．05）;同时,与正常对照组比较,急性白血病患儿的NK细胞数量减少,完全缓解后患儿组NK细胞数量仍低于正常对照（4．11±3．87％和10．41±7．20％w14．06±5．95％,P〈0．05）。结论：联合应用CD4、CD25及cDl27检测Treg细胞简便可行、重复性好、检测结果可靠、准确,CD4^＋CD25^＋CD127^＋T细胞可较好地反映CD4^＋CD25^＋Treg细胞的比例。急性白血病患儿外周血中Treg细胞数量升高,NK细胞数量降低,表明急性白血病患儿NK细胞免疫功能处于抑制状态。Treg细胞可能在白血病的发生、发展中起一定作用,参与NK细胞的调节可能是Treg细胞在白血病免疫中的一个环节。     

流式细胞术检测外周血CD14+细胞的活化程度

目的　利用流式细胞术检测外周血CD14+细胞活化程度。方法　应用流式细胞术分别检测了 2 5份 ( 7份肝素抗凝的正常对照标本、7例肝素抗凝、11例枸橼酸钠抗凝的慢性活动性乙型肝炎标本 )外周血 (PBMC)CD14+细胞的侧向角光散射 (颗粒度 )SSC值、细胞活化相关表面抗原 (CD6 9)表达率。结果　肝素抗凝HBV组CD14+细胞颗粒度值 [( 85 3 1± 2 46 3)道 ]高于肝素抗凝正常对照组CD14+细胞颗粒度值 [( 474 5± 47 9)道 ](P≤ 0 0 5 ) ;肝素抗凝HBV组CD14+细胞颗粒度值 [( 85 3 1±2 46 3)道 ]高于枸橼酸钠抗凝组 [( 5 2 0 1± 10 5 6 )道 ](P≤ 0 0 5 ) ;肝素抗凝HBV组CD6 9在CD14+细胞的表达率 ( 2 2 71± 13 5 7) %明显高于肝素抗凝正常对照组CD6 9在CD14+细胞的表达率 ( 7 18±4 2 7) % (P≤ 0 0 5 ) ;肝素抗凝HBV组CD6 9在CD14+细胞的表达率 ( 2 2 71± 13 5 7) %明显高于枸橼酸钠抗凝HBV组 ( 3 93± 3 94) % (P≤ 0 0 1)。结论　采用流式细胞术检测细胞颗粒度、活化抗原表达率 ,是一种灵敏、快速、客观的评价外周血CD14+细胞活化程度的方法 ;使用不同抗凝剂肝素或枸橼酸钠对外周血CD14+细胞颗粒度、活化抗原表达率有影响 ,肝素抗凝血用来检测CD14+细胞活化程度效果更好。     

CD8~+细胞毒性T细胞的反应质量在EV71HFMD病程发展中的作用

目的研究中国EV71感染手足口病(HFMD)中CD8+细胞毒性T细胞的活化和第二信号的表达,探讨EV71感染的病程发展机制。方法选取48例EV71HFMD患儿分为轻症组、重症组(其中包括中枢神经病变组、中枢神经病变伴自主神经失调组、神经源性肺水肿组),应用流式细胞术检测CD8+T细胞上CD28和CD38的表达水平,分析CD8+T细胞的质量水平在EV71感染病程发展中的作用。结果 CD8+CD28+细胞、活化分子CD38的表达轻症组与健康同龄对照组、重症各组比较增高明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CD8+细胞毒性T细胞在EV71感染中的反应质量可能是病程发展的原因之一。     

NK细胞活性与血清可溶性CD25水平检测在继发性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断中的意义

本研究探讨继发性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（secondary hemophagocytic lymphohistiocytosis，HLH）患者外周血NK细胞活性、血清可溶性CD25（sCD25）水平的检测在早期诊断中的意义。收集2005年6月至2008年5月继发性HLH疑似病例38例，25名正常健康人员作为对照，采用LDH释放法检测外周血NK细胞活性，ELISA法检测血sCD25的水平，38例疑似病例根据HLH-2004诊断标准分为排除组和诊断组，比较各组NK细胞活性及sCD25水平的差异，同时比较确诊组确诊前后各项诊断标准的符合情况。结果表明：38例疑似患者中有22例最终确诊为继发性HLH，其NK细胞活性均明显低于正常对照组，差异有显著统计学意义（P〈0．001），血清sCD25水平明显高于正常对照组，差异亦有统计学意义（p〈0．05），且确诊组患者的NK细胞活性和血清sCD25水平在疾病早期100％出现异常。结论：NK细胞活性及血清sCD25水平的检测对于继发性HLH的早期诊断可能具有重要的意义。     

流式细胞仪检测CD55和CD59表型对诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿的意义

目的：探讨用流式细胞仪检测CD55和CD59表型对诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿(Paroxysmal nocturnal he—moglobinuria，PNH)的意义。方法：采用流式细胞技术测定20例健康体检者(对照组)、14例阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH组)、6例再生障碍性贫血-阵发性睡眠性血红蛋白尿综合征(AA-PNH综合征组)、21例再生障碍性贫血(AA组)患者外周血红细胞膜CD55和CD59标记率。结果：PNH组和AA-PNH组患者的CD55和C59标记率与对照组比较，有显著性差异(P＜0．01，P＜0．05)；AA组CD55和CD59标记率与对照组相比均无显著性差异(P＞0．05)；PNH组的CD55和CD59标记率与AA-PNH综合征组比较，虽然有差异，但无统计学意义(P均＞0．05)；AA组CD55和CD59标记率与PNH组比较，均有显著性差异(P均＜0．05)。结论：红细胞膜上糖基磷脂酰肌醇(Glyco-sylphatidylinositol，GPI)“锚”相关蛋白CD55和CD59的缺陷与PNH有密切关系。流式细胞技术测定红细胞膜上CD55和CD59可作为诊断PNH的有效检查方法。     

前列腺癌浸润性树突状细胞CD1a、CD83的表达及与临床指标的相关性分析

目的探讨前列腺癌肿瘤浸润性树突状细胞（tumor infiltrating dendritic cells,TIDCs）的数量与活化功能的变化,并探讨分析前列腺癌组织TIDCs的表达与患者血清PSA值、年龄、Gleason评分、骨转移等情况的相关性。方法运用免疫组化Envision两步法染色技术标记28例前列腺癌组织及10例良性前列腺增生组织树突状细胞（dendriti ccell,DC）的CD1a及CD83分子,镜下观察被标记的DC的形态和分布情况并人工计数,比较良性和恶性前列腺组织的DC的CD1a及CD83的均数,使用student—t检验,P％0．05为差异有统计学意义。进行28例前列腺癌患者CD1a、CD83、年龄、PSA、Gleason评分的Pearson相关分析及Logistic回归分析,以．P〈0．05为相关性有统计学意义。结果前列腺癌组织DCCD1a多分布在癌周,染色浅,数量比前列腺增生组织CD1a的数量少,差异有统计学意义（P〈0．05）;前列腺癌组织DCCD83亦分布于癌周,染色较浅,数量比前列腺增生组织CD83的数量略多,差异无统计学意义（P〉0．05）;28例前列腺癌患者的CD1a、CD83、年龄、PSA的相关性不显著,相关无统计学意义（P〉0．05）。结论前列腺癌TIDCs多分布在癌周,总体数量（用CD1a标记）较良性前列腺组织少,活化的TIDCs（用CD83标记）的数量与良性组织相差不大;CD1a、CD83与年龄、PSA、Gleason评分及骨转移相关性不显著。     

CD34^＋造血祖细胞定向诱导分化为T／NK细胞的研究进展

成熟T／NK细胞具有重要的移植免疫和抗肿瘤免疫效应。利用造血干／祖细胞具有多向分化的潜能，通过体外培养体系（含促进T／NK细胞分化发育的以下成份：如SCF、Flt-3L、IL－2、IL-7、IL-12、IL-15、TNF-α等细胞因子，胸腺肽／胸腺素，胸腺基质细胞等不同组合），定向诱导其分化为成熟的T／NK细胞，可用于造血干细胞移植后的细胞过继免疫治疗。本文就CD34^ 造血祖细胞定向诱导分化为T／NK细胞的实验研究的理论基础和进展作一综述。