树突状细胞在免疫应答中的作用

树突状细胞(dendritic cell,DC)是指呈典型树突状或伪足状突起、膜表面高表达MHC-Ⅱ类分子、能移行至次级淋巴器官和刺激初始型T细胞(naive T cells)增殖活化、并具有一些相对特异性表面标志的专职抗原提呈细胞(professional antigenpresenting cell,pAPC).DC在免疫应答的首要环节一抗原提呈中扮演着重要的角色,在抗感染、器官移植、AIDs、自身免疫性疾病及肿瘤治疗中具有广泛的应用前景.自90年代初期,DC体外培养获得成功,使DC的研究得以飞速发展,成为免疫学研究领域的热点之一.现在人们不仅认识到DC和许多细胞一样具有异质性,更重要的是日益认识到DC在免疫应答中的重要作用.本文主要就髓系DC作一论述.     

沙培林诱导脐血树突状细胞的成熟

目的 改进体外诱导脐血树突状细胞（DC）成熟的方案，为后期制备临床使用的抗肿瘤DC疫苗提供新的技术路线。方法 分离脐血单个核细胞（CBMC）并在含10％同源脐血浆、重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM—CSF）和重组人白细胞介素-4（rhIL-4）的培养体系中诱导培养，部分加入肿瘤冻融抗原和／或沙培林（OK-432）冲击，光镜和电镜下观察细胞形态，流式细胞仪检测培养前后各组细胞表面抗原CD1a和CD83的表达情况。结果培养过程中，细胞形态发生明显变化，呈现典型的DC形态。收集第9天各组DC，细胞表面均高度表达CD1a和CD83，与贴壁分离的CBMC比较有统计学意义，肿瘤冻融抗原冲击后，DC表面CD1a和CD83的表达上调，沙培林进一步刺激后，CD1a和CD83表达率显著升高。结论 诱导脐带血来源的前体细胞分化为未成熟DC的途径相对简便；沙培林能促进肿瘤冻融抗原冲击后的脐血DC进一步成熟。     

肺癌细胞裂解物刺激树突状细胞诱导产生免疫应答的实验研究

目的采用肺癌细胞裂解物致敏树突状细胞（DCs）的方法制备肺癌疫苗并进一步通过实验验证其疗效。方法利用外周血的单个核细胞经粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子（GM-CSF）和人白细胞介素4（IL-4）体外诱导产生树突状细胞,用A549（人肺腺癌细胞系）细胞冻融抗原对其进行冲击诱导自体细胞毒T淋巴细胞（CTLs）产生。通过细胞毒试验及ELISA测定细胞因子的分泌和CTLs杀伤活性。制备荷瘤裸鼠模型,不同分组裸鼠经过一次或多次皮下注射CTLs。结果 A549冻融抗原致敏的DCs增加CTLs增殖,诱导的CTLs对A549细胞产生特异性杀伤,经过一次及多次接种后荷瘤裸鼠肿瘤生长减缓,并且肿瘤变小及生存时间较对照组明显延长,起到抑制肿瘤生长和延长生存时间的作用。结论通过实验证实了肺癌细胞裂解物抗原来刺激树突状细胞治疗肺癌A549荷瘤裸鼠模型是安全有效、可行的。为临床应用以树突状细胞为基础的肺癌疫苗免疫治疗提供了实验依据。     

重组腺相关病毒转导人树突状细胞体外诱导抗肝癌免疫应答

目的 探讨携带甲胎蛋白基因的重组腺相关病毒(rAAV-AFP)转导人树突状细胞(DC)体外诱导抗肝癌免疫应答.方法 分离健康志愿者外周血单核细胞,贴壁细胞转导rAAV-AFP后,在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和白细胞介素4(IL-4)的联合作用下,诱导分化为DC.用四唑盐(MTS)比色法检测AAV-AFP转导的DC(AAV-AFP+DC)刺激自体T细胞增殖的能力;流式细胞仪检测DC表型、AAV-AFP转导DC的效率以及AAV-AFP+DC激活的T细胞干扰素γ(IFN-γ)和IL-4的分泌;乳酸脱氢酶(LDH)释放细胞毒试验检测AAV-AFP+DC刺激的T细胞对AFP阳性肝癌细胞系的杀伤活性.结果 AAV-AFP转导的DC高表达人类主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(HLA Ⅰ,97.12%)、HLAⅡ(97.32%)、CD80(38.94%)、CD83(60.84%)、CD86(98.14%)等DC的典型表面标记;AAV-AFP转导后,81.2%的DC表达AFP;AAV-AFP+DC能够有效地刺激自体T细胞增殖、活化,激活后19.84%的CD4+T细胞和18.65%的CD8+T细胞能够分泌IFN-γ而不分泌IL-4,对AFP阳性的肝癌细胞系HepG2、BEL7402杀伤率分别为56.45%和78.94%.结论 AAV-AFP+DC体外能够诱导出有效地抗AFP阳性肝癌免疫应答,为AFP表达阳性的肝癌患者的主动性免疫治疗提供了实验依据.

Abstract：

Objective To investigate the generation of antitumor response against hepatocellular carcinoma by in vitro transduction of dendritic cells (DC)with recombinant adeno-associated virus expressing α-fetoprotein (rAAV-AFP). Methods Peripheral blood mononuclear cells were isolated from healthy volunteers. Adherent peripheral blood mononuclear cells were transduced with AAV-AFP and cultured in the presence of granulocyte macrophage colony stimulating factor and interleukin-4 to generate dendritic cells.MTS assay was used to measure the ability of DC transduced with AAV-AFP ( AAV-AFP + DC) to stimulate the proliferation of T cell. The phenotype and AFP protein expression of DC and the secretion of IFN (interferon)-γ and IL (interleukin)-4 by T cells were detected by flow cytometry. The killing efficacy of cytotoxic T lymphocytes (CTL) activated by AAV-AFP + DC against AFP positive hepatocellular carcinoma cell lines was detected by lactate dehydrogenase (LDH) release assay. Results AAV-AFP + DC expressed HLA Ⅰ (97. 12%), HLAⅡ (97.32%), CD80(38.94%), CD83(60.84%)and CD86(98. 14%). AFP was secreted by 81.2% of AAV-AFP + DC. And it could stimulate effectively the proliferation of T cell.19. 84% of CD4 + T cells and 18.65% of CD8 + T cells activated by AAV-AFP + DC produced IFN-γbut not IL-4 and showed distinct killing activities against AFP positive hepatocellular carcinoma cell lines HepG2 (56. 45% ) and BEL7402 (78. 84% ). Conclusion AAV-AFP + DC can elicit distinct antitumor responses against AFP positive hepatocellular carcinoma cell lines so as to provide a basis for further researches on the clinical application of AAV-AFP + DC in the treatment of hepatocellular carcinoma.     

慢性粒细胞白血病树突状细胞诱导及其抗肿瘤功能的体外研究

目的 探讨人慢性粒细胞白血病(CGL)来源的树突状细胞(DC)的免疫功能。方法 应用重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)联合重组人白介素(rhIL)-4在体外诱导培养CGL细胞,获得DC。应用流式细胞仪(FACS)检测诱导前、后的细胞表型,观察其诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)的体外抗肿瘤效应。采用酶联免疫吸附试验(ELIS)测定DC培养及DC与外周血单个核细胞(PBMNC)共同培养的上清液中IL-12及干扰素(IFN)-γ的量。结果 联合rhGM-CSF及rhIL-4可诱导CGL细胞分化为DC;CGL-DC体外激活的CTL对CGL细胞具有特异性细胞毒活性;分别从诱导DC培养上清液和DC PBMNC培养的上清液中检测出一定量IL-12及IFN-γ。结论 CGL-DC具有抗原提呈细胞的免疫功能,可望用于CGL的免疫治疗。     

树突状细胞在免疫应答中的作用及其调控

18 68年 ,树突状细胞 (ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ,ＤＣ)的分支郎罕细胞(Ｌａｎｇｃｒｈａｎｓｃｅｌｌ,ＬＣ)首先在皮肤内被发现 ;本世纪 70年代初 ,Ｓｔｅｉｍａｎ和Ｃｏｈｎ正式报道了这类形态、功能均极为特殊的免疫细胞。此后的研究发现ＤＣ在免疫应答的首要环节 抗原提呈中扮演着重要的角色 ,是一类功能强大的抗原提呈细胞 (ａｎｔｉ ｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｃｅｌｌ,ＡＰＣ) ,在抗感染、器官移植、自身免疫疾病中具有广泛的应用前景。 90年代初 ,随着体外大量获取纯化ＤＣ实验技术的建立和成熟 ,对ＤＣ的研究飞速发展。在基础和…     

反义bcl-2的表达诱导癌细胞凋亡致敏树突状细胞的免疫应答

目的 观察树突状细胞（DCs)对反义bcl-2的逆转录病毒表达载体诱导的凋亡胆管癌细胞获取抗原后，抗肿瘤免疫应答及对胆管癌细胞的特异性免疫杀伤效果。方法 用粒－巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）加白介素－4（IL－4）从人外周血分化，诱导DCs，反义bcl-2的逆转录病毒表达载体在体外诱导培养的人胆管癌细胞凋亡，将DCs，T淋巴细胞和凋亡胆管癌细胞区培养，同时设计不同类型肿瘤细胞（坏死胆管癌细胞及培养胆管癌细胞）作对照，7d后，分离，富集DCs，T淋巴细胞进行免疫应答及肿瘤细胞杀伤试验。结果 DCs高表达共刺激分子B7和CD1a，表面具有典型不规则突起，反义bcl-2表达诱导癌细胞凋亡形成的凋亡小体被DCs捕捉，吞噬，负载抗原的DCs可以有效提呈胆管癌细胞抗原，有强烈的免疫应答，刺激的细胞毒T淋巴细胞（CTLs)特异性地杀伤胆管癌细胞。结论 反义bcl-2的逆转录病毒表达载体诱导癌细胞凋亡可以致敏rhGM-CSF加rhIL-4从人外周血单核细胞诱导，扩增出的DCs并产生显著的杀伤胆管癌细胞的免疫反应，可望成为特异性免疫治疗肿瘤的一条新途径。     

慢性粒细胞白血病来源的DC细胞体外诱导高效而特异的抗肿瘤免疫

目的：选用慢粒患者的原代血细胞，经细胞因子组合联合诱导，生成携带白血病抗原信息的树突状细胞（Dendritic Cell,DC)，为DC疗法在临床上的应用提供理论依据。方法：慢粒（急变期）病人的PBMC用GM-CSF IL-4 TNFα诱导后进行形态和细胞表型的鉴定。应用同种混合淋巴细胞反应和细胞毒性实验，观察诱生之DC刺激淋巴细胞增殖的能力以及介导抗白血病特异性细胞毒性反应的能力。利用酶联免疫吸附实验检测DC产生IL-2及协助产生IFN-γ的能力。结果：诱生DC均具有DC的形态特征和超微结构。表达DC相关表面分化抗原。并可刺激T淋巴细胞产生较强的增殖效应。诱导出针对自身肿瘤靶细胞的特异性CTL反应。同时可不同程度的分泌IL-12和可协助T细胞产生IFN-γ。结论：慢粒细胞在适当的细胞因子的诱导下，可分化为具有DC形态的细胞，后者可诱导出高效而特异的抗肿瘤免疫。     

HSP65-MUC1／HSP65抗体免疫复合物对人树突状细胞的活化作用

目的：探讨免疫复合物能否诱导树突状细胞的活化与成熟。 方法：用免疫复合物刺激来自人外周血经细胞因子IL-4和GM-CSF诱导的未成熟的树突状细胞, 观察免疫复合物对未成熟树突状细胞的活化与成熟的影响。 结果：HSP65-MUC1/HSP65免疫复合物与HSP65-MUC1抗原或HSP65抗体相比较,能够显著地活化树突状细胞,使其表面的协同刺激分子CD86的表达显著上调,为激活细胞毒性T淋巴细胞提供第二信号,这一结果说明免疫复合物具有交叉递呈的作用;同时,加入免疫复合物的树突状细胞培养上清中IL-6和TNFα分泌量明显增加。结论： 免疫复合物能够诱导树突状细胞的活化与成熟,免疫复合物具有交叉递呈的作用。     

树突状细胞研究新进展一诱导免疫耐受

自身免疫性疾病是机体对自身抗原产生免疫反应而导致的自身组织损害性疾病。其基本特征是在患者血清中可测到高效价的自身抗体和自身应答性T淋巴细胞，二者作用于表达相应抗原的组织细胞，造成其损伤和功能障碍。自身免疫性疾病的起因与发病机制还不十分清楚，一般认为是由于自身抗原的异常所致，如隐蔽抗原的释放、自身抗原发生改变等。     

树突状细胞摄取和提呈颗粒化HPV-E7抗原能诱导高水平体液和细胞免疫应答

目的 研究特定大小聚苯乙烯微粒作为抗原载体介导树突状细胞(DC)摄取和提呈抗原,诱导体液和细胞免疫应答的能力,并与DC-微粒-卵清蛋白(OVA)及DC-E7抗原表位的诱导能力进行比较。方法 用粒一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)联合白细胞介素(IL)-3从小鼠骨髓黏附细胞培养制备DC,流式细胞术分析表型,细胞经荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的微粒-OVA或微粒-E7饲育,或用OVA抗原表位(SIIFEKL多肽)或E7抗原表位(RAHYNIVTF多肽)负载,流式细胞术分析DC对微粒-OVA和微粒-E7的摄取能力,B3Z细胞活化试验检测DC提呈微粒-OVA和OVA抗原表位的能力。分别用DC-微粒-OVA、DC-微粒-E7、DC-OVA抗原表位、DC-E7抗原表位经双侧足掌免疫小鼠,36h后取髂部引流淋巴结,流式细胞仪分析微粒阳性细胞的表型,10d后用酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定小鼠血清的抗体水平,酶联免疫斑点法(ELISPOT法)检测小鼠脾细胞干扰素γ(IFNγ)形成单位。结果 小鼠骨髓黏附细胞在GM-CSF和IL-3条件下培养5d后大部分细胞呈树突状形态和表型,经微粒-OVA或微粒-E7饲育后,能高效地摄取和提呈抗原,用DC-微粒-OVA或DC-微粒-E7免疫小鼠后引流淋巴结微粒阳性细胞,主要组织相容(抗原)复合物(MHC)分子和共刺激分子表达率分别为87．06％(MHC-I),63．57％(MHC-Ⅱ),73．40％(CD80),58．43％(CD86),37．62％(CD40)。第10天血清IgG和IgM水平显著升高,脾脏IFNγ形成单位与未免疫小鼠相比显著增多,DC-微粒-E7所诱导的细胞免疫应答与DC-微粒-OVA差异无显著意义。用负载E7抗原表位或OVA抗原表位的DC免疫小鼠后也能诱导细胞免疫应答,但应答强度与DC-微粒-OVA和DC-微粒-E7相比显著减弱。结论 DC-微粒-E7免疫小鼠后,细胞能迁移到引流淋巴结并诱导高水平的体液和细胞免疫应答,提示DC-微粒-抗原可能是一较理想的肿瘤疫苗形式。     

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞免疫功能的研究

目的　研究慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞 (DC)表面分子HLA -DR、CD1a、CD80 、CD86表达水平及其与DC免疫功能的相关性。方法　临床确诊的慢性乙型肝炎轻度患者 1 0例 ,从其外周血中分离单个核细胞 ,体外培养扩增DC ,流式细胞仪检测DC表型HLA -DR、CD1a、CD80 、CD86。以健康成人 1 0例作为对照。结果　慢性乙型肝炎患者DC表面HLA -DR、CD1a、CD80 、CD86分别为 :48.63± 6.34,2 7.73±7.1 9,2 1 .0 5± 8.33,1 8.5 8± 5 .5 1 ,明显低于对照组 :83.1 1± 6.46,5 2 .80± 1 1 .70 ,36.1 1± 7.5 5 ,40 .83± 5 .48,两者相比差异显著 (P <0 .0 0 1 )。结论　慢性乙型肝炎患者外周血DC表面HLA -DR、CD1a、CD80 、CD86表达水平下降 ,并与DC免疫功能低下密切相关     

七氟醚对树突状细胞成熟及成熟树突状细胞活力的影响

目的探讨吸入性麻醉药七氟醚对脐血来源未成熟树突状细胞成熟及成熟树突状细胞(DCs)活力的影响。方法密度梯度离心法分离脐血来源单核细胞,并随机分为3组,即常规培养组(C组)作为对照组、未成熟DC组(I组)和成熟DC组(M组)。C组加入重组人粒细胞—单核细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)50 ng/ml和重组人白介素-4(rhIL-4)10 ng/ml共培养12d,然后加入肿瘤坏死因子(TNF-α)50ng/ml,持续培养至第14天。I组、M组分别于第6、13天用含2.5%七氟醚的混合气体处理,余同C组。倒置显微镜及扫描电镜下观察细胞形态,流式细胞技术(FCM)检测细胞表面免疫表型表达(CD80/CD86、CD83/HLA-DR),MTT法检测DC刺激T细胞增殖活力,ELISA法检测上清液中IL-12水平。结果 (1)DCs形态学:C组及M组细胞表面有大量较长突起,面I组细胞表面树突状突起短,分支少。(2)CD80/CD86、CD83/HLA-DR表达率:C组、M组、I组分别为(36.9±2.8)%和(12.9±2.4)%、(39.4±2.1)%和(14.4±3.0)%、(19.6±2.6)%和(7.1±1.4)%,I组与C组比较,差异有统计学意义(P<0.05),而M组与C组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(3)DCs刺激T细胞增殖活力:C组、M组、I组分别为1.44±0.23、1.37±0.10和0.56±0.12,I组与C组比较,差异有统计学意义(P<0.05),而M组与C组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(4)DCs分泌IL-12水平:C组、M组、I组分别为(958±321)pg/ml、(982±408)pg/ml和(377±312)pg/ml,I组与C组比较,差异有统计学意义(P<0.05),而M组与C组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论七氟醚可抑制脐血来源树突状细胞成熟,但对成熟树突状细胞活力影响不明显。     

抗原负载的树突状细胞介导的抗自身膀胱癌作用研究

目的:研究膀胱癌肿瘤细胞冻融抗原负载的树突状细胞(DC)对特异性抗自身膀胱癌作用研究。方法:将膀胱癌肿瘤病人外周血单个核细胞来源的DC在体外用冻融负载,再与膀胱癌患者的经细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共同培养,应用乳酸脱氢酶释放法观察其对自身膀胱癌细胞杀伤活性,与未负载肿瘤抗原的CIK组进行比较。结果:DC经抗原负载后介导的CIK对自身膀胱癌细胞杀伤性活性明显增强。结论:用肿瘤抗原负载可进一步提高DC介导的CIK细胞对膀胱癌细胞的杀伤活性。     

成熟与未成熟小鼠树突状细胞的生物免疫学特性研究

目的 研究小鼠骨髓成熟树突状细胞(mDC)与未成熟树突状细胞(imDC)的生物免疫学特性.方法 体外诱导培养小鼠骨髓imDC,经肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激获得mDC.用小鼠CD11c免疫磁珠纯化DC.电镜观察DC的细胞形态.流式细胞术(FCM)检测细胞表面分子MHCⅡ、CD80、CD86的表达.用细胞增殖检测试剂(CCK-8)检测混合淋巴细胞反应(MLR)中DC刺激同种异基因T细胞的增殖能力.实时荧光定量PCR(QPCR)检测DC上细胞因子mRNA的表达.ELISA检测DC培养上清中的细胞因子表达.结果 电镜观察:imDC比mDC细胞突起少、短.胞质内有更多吞饮泡及溶酶体.FCM检测imDC上MHC-Ⅱ(27.2％)、CD80(27.6％)、CD86(29.5％)的表达水平均显著低于mDC MHC-Ⅱ(97.7％)、CD80(97.2％)、CD86(96.4％).MLR中相同反应比例imDC刺激T细胞的增殖能力,1∶5(1.63±0.04),1∶10(1.50±0.08),1∶20(1.28±0.07),1∶40(1.19±0.04),显著低于mDC 1∶5(2.21±0.09),1∶10(1.92 ±0.02),1∶20(1.64±0.01),1∶40(1.45±0.06),两组间差异均有统计学意义(均P＜0.01).QPCR检测imDC上IL12p35(0.66±0.13)、IL12p40(0.57±0.10)、IFN-γ(0.74±0.08)mRNA相对表达量(mDC为对照)显著低于mDC(1.00±0.00,P＜0.05),而TGF-β(1.35±0.09)显著高于mDC(1.00±0.00,P＜0.05).ELISA法检测imDC分泌IL12p70(6 ±4)、IFN-γ(56±15)显著低于mDC IL12p70(120±22)、I FN-γ(90±15,P＜0.05),而TGF-β(176±23)显著高于mDC TGF-β(55±18,P＜0.05).结论 imDC低表达共刺激分子、MHC-Ⅱ和Th1类细胞因子,高表达TGF-β,不能活化T细胞,具有耐受原性.mDC高表达共刺激分子、MHC-Ⅱ和Th1类细胞因子,可激活初始T细胞,具有免疫原性.     

卵巢癌细胞对人树突状细胞成熟及功能的影响

目的 探讨肿瘤组织树突状细胞(DC)功能缺陷机制,研究卵巢癌细胞对DC成熟及功能的影响.方法 体外共培养卵巢癌细胞与DC,观察DC表面标志、吞噬功能及对T淋巴细刺激胞能力的变化,检测免疫相关因子的变化.结果 成人外周血单个核细胞,经rhGM-CSF和rhIL-4诱导生成DC后,表达CD1a(55.0%±10.3%)、CD86(63.5%±11.1%)、HLA-DR(89.4±19.7%)和CD83(9.7%±3.4%),经肿瘤坏死因子(TNF)-α促成熟后,DC成熟标志CD83(39.5%±7.5%)升高.与卵巢癌细胞共培养,DC特异性标志CD1a(19.1%±4.0%)表达减少,成熟特异性标志CD83(44.2%±8.3%)增高且时间提前,对TNF-α诱导无反应.卵巢癌细胞使DC对葡聚糖的吞噬功能下降43.05%,对同种异体T淋巴细胞刺激活性降低56.35%;抑制DC分泌白细胞介素(IL)-12及与IL-12相关的p38磷酸化,使MLR中T细胞分泌干扰素(IFN)-γ降低而IL-10增高.结论 卵巢癌细胞影响DC成熟及功能,DC吞噬能力及抗原处理功能下降,不能有效刺激T淋巴细胞增殖,抑制特异性CTL活化,造成T细胞对肿瘤细胞耐受.可能是肿瘤逃避机体免疫监视作用的机制之一.     

沙眼衣原体感染对树突状细胞功能的影响

目的：探讨鼠型沙眼衣原体(Chlamydia muridarum,C.muridarum）在树突状细胞（Dendritic Cell,DC）内的存活情况以及对DC功能的影响,为衣原体致病机制的研究提供实验依据。方法：诱导培养BALB/c小鼠骨髓来源的DC。用C.muridarum感染DC,分别在24、72h固定细胞进行衣原体包涵体染色;采用ELISA方法检测感染DC上清中的细胞因子;感染DC与T细胞共孵育48h, CCK-8检测T细胞增殖。结果：C.muridarum能够感染骨髓来源DC,衣原体在DC中生长缓慢,形成非典型的包涵体;感染后的DC分泌较高水平的IL-12和低水平的IL-10;并且能够刺激T细胞增殖,说明衣原体感染的DC仍然具有抗原递呈能力。结论：成功建立C.muridarum感染DC的体外细胞模型,且沙眼衣原体感染对DC抗原递呈功能没有造成明显影响。     

光动力治疗和冻融对肿瘤细胞抗原释放及树突细胞成熟表型的影响

目的 探讨光动力疗法(PDT)和冻融导致的肿瘤细胞抗原暴露,对体外树突细胞(DC)成熟表型的影响.方法 对体外培养的4T1乳腺癌细胞分别予以PDT和反复冻融,检测4T1细胞的坏死与凋亡,收获上清液并与未成熟DC(imDC)或成熟DC(mDC)共同孵育,采用流式细胞法和激光共聚焦显微镜分析DC免疫表型和形态学特征.结果 经两种机制处理的4T1细胞都以坏死为主,但PDT较冻融诱导更高的凋亡率(34.7%±9.6%比16.8%±5.1%,P＜0.05);与上清液孵育后,PDT组imDC的CD80、CD86与I-A/I-E阳性率分别为22.4%±4.6%、22.5%±5.6%、24.3%±6.3%,冻融组依次为17.3%±3.3%、18.0%±4.7%、20.7%±3.1%,均高于空白对照组(14.2%±3.0%、13.6%±3.3%、15.5%±2.1%,P＜0.05),且PDT组升高更明显,而mDC的免疫表型变化差异无统计学意义(P＞0.05).结论 与冻融相比较,PDT导致更高的细胞凋亡率,更易诱导imDC表达成熟表型.

Abstract：

Objective To investigate the effects of tumor antigen on the maturation phenotypes of dendritic cells through different treatments of antigenic exposure. Methods The necrosis and apoptosis of 4T1 mammary carcinoma cells were detected after an in vitro treatment of photodynamic therapy (PDT) or freezing-thawing. The supernatant of 4T1 cells was harvested and added into the culture of immature or mature dendritic cells (DCs). The immune phenotypes and morphological features of DCs were analyzed by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy respectively. Results Necrosis predominated after these treatments. But the apoptotic ratio was higher in PDT cells than that in freezing-thawing cells (34. 7% ±9. 6% vs 16. 8% ± 5. 1%, P ＜ 0.05 ). After co-culturing with different supernatants, the immature DCs of PDT group showed more significant increases of positive rates of CD80 (22. 4% ±4. 6% ),CD86 (22. 5% ± 5. 6% ) and I-A/I-E (24. 3% ± 6. 3% ) versus the immature DCs of freezing-thawing group (17.3% ±3.3%, 18.0% ±4.7% and 20.7% ±3.1% respectively,P＜0. 05) and control group (14.2% ±3.0%、13.6% ±3.3% 、15.5% ±2.1%,P＜0.05). No difference was found between two groups of mature DCs (P ＞ 0. 05 ). Conclusion As compared with the treatment of freezing-thawing, PDT yields a higher apoptotic ratio of 4T1 cells and an elevated expression of maturation phenotypes in imature DCs.     

黄芪多糖对小鼠树突状细胞分化及成熟的影响

目的探讨黄芪多糖(APS)是否具有诱导小鼠髓源性树突状细胞(DC)分化和成熟的作用,以阐释APS药理作用的机制。方法APS分别取25(APS25组)、50(APS50组)、75(APS75组)、100 mg／L(APS100组)4种浓度,分别体外诱导小鼠髓源性DC前体和未成熟DC,采用倒置显微镜观察细胞生长状态,电子显微镜检测细胞形态,流式细胞仪检测CD11C、主要组织相容性复合物(MHC)-Ⅱ类分子及协同刺激分子CD80、CD86表达水平。结果APS、APS 白介素(IL)-4及空白对照组诱导的DC前体细胞,培养结束时大部分细胞已经死亡。粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-csF) IL-4诱导小鼠髓源性DC,在APS刺激36 h后,流式细胞检测结果显示APS100、APS75、APS50组的CD80、CD86、CD11c、MHC-Ⅱ类分子表达水平均明显高于空白对照组(P值均< 0．05),与内毒素(LPS)组类似;空白对照组与APS25组的差异无显著性(P>0．05)。结论APS不能诱导小鼠髓源性DC前体分化为DC,但可能有促进DC成熟的作用。     

树突状细胞-结直肠癌细胞融合疫苗的制备及生物学特性的研究

目的：研究树突状细胞（DC）与结直肠癌（Lovo）细胞融合疫苗的制备及其生物学特性。方法：①应用PEG融合技术融合树突状细胞和Lovo细胞，制备融合疫苗。②通过描记细胞生长曲线、倒置显微镜和激光共聚焦显微镜、流式细胞仪检测观察细胞生物学特性。③通过检测疫苗的克隆形成率、促进T淋巴细胞增殖能力和疫苗的成瘤活性来观察疫苗的安全性和免疫学效应。结果：融合疫苗呈悬浮生长，具有两种亲代细胞的形态结构特点，CD80、CD83、CD86等在融合细胞表面的表达较单纯DC显著丰富；融合细胞不出现明显的细胞倍增；融合疫苗在软琼脂上培养21d，未见明显的细胞克隆形成；通过^3H—TdR掺人法检测融合细胞刺激T淋巴细胞增殖情况，发现融合疫苗可强烈刺激T淋巴细胞增殖；融合疫苗接种于裸鼠体内观察30d，未见肿瘤组织生长。结论：融合细胞具有作为抗肿瘤疫苗应具备的低增殖能力和不成瘤的安全性；融合疫苗可明显促进T淋巴细胞的增殖能力说明将其作为抗结直肠癌特异性免疫治疗方法有进一步研究的意义。