人釉原蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定。选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm。经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm。结果重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别。结论成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm。大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础。     

人可溶性CD83基因的克隆、原核表达和纯化

目的:构建人可溶性CD83基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达和纯化.方法:利用反转录PCR方法从正常人外周血单个核细胞中获得可溶性CD83基因,克隆到表达载体pET-32a载体,构成重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达6×His融合蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定.表达产物包涵体经Ni-NTA亲和层析纯化.结果:经酶切鉴定及测序证实可溶性CD83蛋白基因的原核表达载体构建正确.经SDS-PAGE及Western blot显示在M,约32 000处出现融合表达条带.融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的45%.重组蛋白经Ni-NTA亲和层析进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白.结论:成功克隆人外周血单个核细胞来源的可溶性CD83基因片段,并在大肠杆菌B121(DE3)中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度融合蛋白.     

人白细胞介素-10在大肠杆菌中的高效可溶性表达及一步纯化

目的:在大肠杆菌(E.coli)中表达和纯化人白细胞介素-10(IL-10)。方法:用PCR技术从质粒pH15C中扩增编码人IL-10成熟蛋白的cDNA序列,将其克隆到pET-44载体中,构建表达质粒pET-44-IL-10。用菌落PCR和限制性酶切鉴定重组质粒并进行序列分析。重组质粒转化E.coliRosettaBlue(DE3)表达含6×His的重组人IL-10蛋白。重组蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化。结果:RosettaBlue(DE3)经1 mmol/L IPTG诱导、25℃培养,表达的IL-10主要以可溶性形式存在,表达效率为26%。超声破菌后的可溶性上清经一步Ni-NTA亲和层析进行纯化,所得蛋白纯度大于95%。结论:成功地得到了重组人IL-10纯品。     

人釉原蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的 构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白.方法 利用限制性内切酶EcoR I和Sal I将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定.选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm.经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误.在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别.结论 成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm.大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础.     

人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I在大肠杆菌中的表达及建立其快速复性方法

目的:在大肠杆菌中克隆和表达人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I(troponin Ⅰ,Tn Ⅰ),建立一种Tn Ⅰ快速复性方法.方法:通过PCR方法将人Tn Ⅰ基因克隆在大肠杆菌表达质粒pET28a中,经过PCR和DNA序列测定验证,并通过IPTG诱导表达.结果:通过PCR和DNA核酸序列分析,证实获得的基因片段为Tn Ⅰ全编码序列,Tn Ⅰ被克隆在大肠杆菌表达质粒pET28a中,重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导获得表达,表达水平为占菌体总蛋白的40%,Tn Ⅰ包涵体产物经过对1-mmol*L-1透析复性,获得了抑制血管新生的生物活性.结论:构建了Tn Ⅰ表达菌株,经诱导获得Tn Ⅰ的高效表达,建立了简易的Tn Ⅰ体外复性方法,为Tn Ⅰ的深入研究和应用奠定了坚实的基础.     

剪接因子SRp55原核表达质粒的构建和表达

目的:本研究通过扩增剪接因子SR蛋白家族的SRp55基因,构建GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55,并在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化。方法:用PCR法扩增SRp55基因,将扩增产物和载体pGEX-2T进行双酶切后回收,连接载体和目的片段,获得重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。在大肠杆菌BL21(DE3)中通过IPTG进行诱导表达,然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠,亲和纯化得到纯的GST-SRp55融合蛋白。结果:SRp55基因以正确的阅读框架插入pGEX-2T。IPTG诱导大肠杆菌BL21(DE3)表达,随诱导时间的增加蛋白表达量增高,4h以后接近最高表达量。通过亲和纯化得到分子量在60kD左右的蛋白,经蛋白印迹分析证实为GST-SRp55融合蛋白。结论:成功地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55,并获得GST-SRp55融合蛋白,为进一步研究tau蛋白可变剪接机制提供了必要的基础。     

小鼠金属硫蛋白—Ⅰ在大肠杆菌中的表达与分离纯化

目的：在大肠杆菌中表达小鼠金属硫蛋白－Ⅰ，并研究其分子结构和生物学功能。方法：将小鼠金属硫蛋白－Ⅰ基因克隆入融合表达载体pGEX-4T-1中，转化大肠杆菌BL21，得到含重组表达质粒pGMA的工程菌。结果：经IPTG诱导，表达出分子量约为33KD的融合蛋白。然后经Glutathione-Sepharose4B亲和纯化后，用凝血酶切除GST部分。经SephacrylS-100过滤纯化，得到结合有Cd^2 的小鼠金属硫蛋白－Ⅰ。产率约为3mg/L培养液。结论：成功制备了表达MT的工程菌。     

截短形式弓形虫SAG1抗原在大肠杆菌中的可溶性高效表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫SAG1基因的截短片段,并进行纯化及免疫反应性鉴定。方法利用NcoⅠ、HindⅢ双酶切,从本室建立的pET-30a( )-SAG1重组质粒中获取SAG1基因的截短片段,并将目的片段连接到经同样双酶切的质粒pET32a中,构建表达重组质粒pET-32a( )-trSAG1。将重组质粒转入E.coliBL21中并进行诱导表达。表达蛋白经Ni-NTA agarose纯化后, Western-blotting分析其免疫反应性。结果成功构建重组质粒pET-32a( )-trSAG1 ,通过IPTG诱导得到了以可溶性形式表达的重组SAG1蛋白,相对分子质量40 000,Western-blotting结果显示纯化的重组蛋白具有良好的免疫反应性,ELISA试验表明重组SAG1蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别。结论在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达了弓形虫SAG1基因的截短片段,表达蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别,有望成为一种有价值的诊断抗原。     

GST-p60PLAD融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化

目的:制备GST-p60PLAD融合蛋白. 方法:依据人p60PLAD氨基酸序列,根据大肠杆菌偏爱密码子进行反翻译,获得适合在大肠杆菌中表达的基因序列. 根据该基因序列设计五条引物,用重叠延伸PCR法获得编码人p60PLAD的基因,进而将其克隆入原核表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌BLR(DE3)polys. 经IPTG诱导表达后收集菌体,超声裂解,将上清液经GSTrapFF亲和层析柱纯化、经HiTrap脱盐柱脱盐,用SDS-PAGE进行分析. 结果:成功构建重组质粒pGEX-4T-2-p60PLAD,经DNA 测序证实插入序列与设计完全一致. 并在大肠杆菌中高表达出Mr约为34×103大小具有可溶性的目的蛋白,经亲和层析柱纯化后获得纯度很高的GST-p60PLAD融合蛋白. 结论:成功制备了高纯度的GST-p60PLAD融合蛋白,为进一步探讨p60PLAD蛋白的结构和生物学活性提供必要的物质基础.     

登革Ⅱ型病毒E蛋白第三结构域在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的 在大肠杆菌中表达登革Ⅱ型病毒包膜糖蛋白(E)的第三结构域(DⅢ),并进行纯化及免疫反应性鉴定.方法 登革Ⅱ型病毒接种乳鼠,提取总RNA,经RT-PCR扩增E蛋白全长基因片段,构建pMD 18-T-DV2-E载体.以pMD18-T-DV2-E质粒为模板,PCR扩增E蛋白DⅢ基因片段并纯化.用限制性内切酶双酶切纯化产物和表达质粒pET-32a(+)并连接构建重组质粒.筛选的阳性质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,表达蛋白经SDS-PAGE分析和Ni-NTA树脂纯化,Western blot鉴定.结果 RT-PCR扩增获得1.5 kb的E蛋白全长基因片段,构建pMD 18-T-DV2-E质粒;以pMD 18-T-DV2-E质粒为模板,PCR扩增获得320 bp的E蛋白DⅢ基因片段,构建pET-32a(+)-DV2-E-DⅢ表达质粒;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析,表达相对分子质量约为29000的可溶性重组蛋白,其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的52.50%:Western blot鉴定显示重组蛋白与His·Tag单抗和登革病毒(Ⅰ-Ⅳ)单抗均发生反应.结论 重组质粒pET-32a(+)-DV2-E-DⅢ在大肠杆菌中可溶性表达登革Ⅱ型病毒E蛋白第三结构域,重组蛋白能被登革病毒(Ⅰ-Ⅳ)单抗识别.     

GST-hZimp10融合蛋白的重组及抗体制备

目的:构建pGEX-4T-1/hZimp10重组质粒,并在大肠杆菌中表达,纯化出GST-hZimp10融合蛋白,用以制备抗hZimp10抗体。方法:采用PCR技术以pcCDNA3.1-Flag-hZimp10为模板,扩增出hZimp10蛋白N端128个氨基酸对应DNA片段,并将其与谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1进行重组,酶切鉴定后获得重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达,获得GST-hZimp10融合蛋白,纯化后将其作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体特异性。结果:经BamHⅠ和XhoⅠ 双酶切鉴定,确定PGEX-4T-1/ hZimp10重组质粒中包含384bp的片段,与测序结果一致,表明pGEX-4T-1/hZimp10重组质粒构建成功。SDS-PAGE电泳,融合蛋白成功表达,蛋白相对分子质量大小与预期相符。间接ELISA法检测抗hZimp10抗体效价可达1:100 000以上。Western blotting法,hZimp10在LNCaP细胞中具有很高的特异性。结论:成功获得GST-hZimp10融合蛋白,且制备了抗hZimp10抗体。     

人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ在大肠杆菌中的表达及建立其快速复性方法

目的 :在大肠杆菌中克隆和表达人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白I(troponinⅠ ,TnⅠ ) ,建立一种TnⅠ快速复性方法。方法 :通过PCR方法将人TnⅠ基因克隆在大肠杆菌表达质粒pET2 8a中 ,经过PCR和DNA序列测定验证 ,并通过IPTG诱导表达。结果 :通过PCR和DNA核酸序列分析 ,证实获得的基因片段为TnⅠ全编码序列 ,TnⅠ被克隆在大肠杆菌表达质粒pET2 8a中 ,重组表达质粒在大肠杆菌BL2 1(DE3 )中经IPTG诱导获得表达 ,表达水平为占菌体总蛋白的 40 % ,TnⅠ包涵体产物经过对 1mmol·L- 1 透析复性 ,获得了抑制血管新生的生物活性。结论 :构建了TnⅠ表达菌株 ,经诱导获得TnⅠ的高效表达 ,建立了简易的TnⅠ体外复性方法 ,为TnⅠ的深入研究和应用奠定了坚实的基础。     

用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素

目的 利用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素（endostatin）.方法 采用PCR技术从pMFGendo质粒上扩增出小鼠endostatin完整的cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pThiohisA中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物为包涵体,将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素,经SDS-PAGE分析鉴定.结果 高效表达出相对分子量约32KD的重组融合蛋白,灰度扫描软件分析显示,其表达量占菌体总蛋白质的35.9%,经镍柱亲和层析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白,纯度可达95%,得率为0.27g/L.结论 用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性.     

EB病毒潜伏膜蛋白2A胞外区重组基因在大肠杆菌中的表达及其在血清学检测中的应用

目的:构建EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)胞外区重组基因的表达载体在大肠杆菌中表达,并将表达的蛋白用于EB病毒相关鼻咽癌(NPC)患者的血清学检测.方法:用BamHⅠ和EcoRⅠ将含LMP2A胞外区重组基因的质粒pEC2A双酶切后,克隆到pET32a中.重组质粒经PCR、酶切鉴定、核酸序列分析后转化大肠杆菌(E.coli)BL21,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,表达的蛋白经镍柱亲和层析纯化,并用Western blot法检测其抗原活性.用纯化的蛋白进行鼻咽癌患者血清学检测.结果:重组表达质粒经PCR及酶切鉴定为阳性,核酸序列分析正确.SDS-PAGE和Western blot结果显示表达的重组蛋白分子质量约为40 ku.以此为抗原能在鼻咽癌患者血清中检测到特异性的抗体.结论:成功获得了LMP2A胞外区重组基因表达的蛋白,纯化的蛋白可用于EBV相关鼻咽癌患者的血清学检测.     

重组hEGF-TCS融合蛋白基因表达载体的构建及表达产物的纯化

目的 构建新型人表皮生长因子(human epidermal growth factor,hEGF)和天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)融合蛋白的表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化EGF-TCS融合蛋白.方法 利用基因工程技术将人表皮生长因子EGF和天花粉蛋白基因连接起来,克隆到高效表达载体pQE30中,构建重组表达质粒pQE30-EGF-TCS.并在大肠杆菌M15中表达该融合蛋白(EGF-TCS).产物经Ni-NTA Agrose亲和层析柱纯化.结果 重组表达质粒pQE30-EGF-TCS在大肠杆菌M15中获得稳定、高效的融合表达.目的蛋白占细胞总蛋白的40%左右,以可溶性形式存在,表达上清柱纯化纯度达95%以上.结论 应用基因工程技术,成功构建了融合蛋白EGF-TCS,为进一步研究其结构功能关系和临床应用奠定了基础.     

弓形虫SAGl基因在大肠杆菌中的高效表达及重组抗原对弓形虫感染的检测

目的在原核系统中高效表达弓形虫表面抗原SAG1并利用重组抗原检测弓形虫感染.方法将截短的SAG1基因经PCR扩增后,定向亚克隆入原核表达载体pET-30a(+),酶切鉴定出阳性重组子并经序列测定证实读码框正确,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,对融合的表达产物进行纯化和复性,通过免疫印迹和ELISA实验检测其特异的免疫反应性.结果成功构建截短型SAG1在原核系统中的重组表达质粒,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的31.58%.经过简易的纯化和复性过程,该重组抗原(rSAG1)能被弓形虫感染的人血清所识别.用rSAG1构建的ELISA试剂盒对弓形虫病的检测具有高度的敏感性和特异性.结论截短型SAG1在大肠杆菌中得到了高效表达,重组抗原经纯化和复性后,能有效检测弓形虫的感染,可用于构建弓形虫病检测试剂盒.     

人肿瘤抗原基因Delta-like4(DLL4)可溶性表达、纯化及鉴定

目的研究克隆肿瘤抗原人DLL4基因,与原核表达载体可溶性融合表达、分离纯化及其鉴定,并计划将其应用于DLL4特异性肺癌肿瘤疫苗研究过程中的抗血清滴度检测.方法采用PCR方法扩增DLL4多核苷酸序列,克隆入pMD-18T载体.测序正确后,将其亚克隆入pGEX-KG原核表达载体,获得pGEX-KG-hDLL4载体.以该载体转化E.coli菌株BL21(DE3),IPTG诱导其表达,裂解大肠杆菌,以GSTrap亲和层析柱纯化目的蛋白,采用SDS-PAGE电泳,Western Blot方法鉴定目的蛋白的表达.结果 PCR扩增获得了hDLL4基因片段,经测序证实与GenBank公布的序列一致,重组的质粒经过PCR、酶切鉴定,证明重组质粒中已成功的插入了目的基因hDLL4.成功构建了该蛋白的原核表达载体pGEX-KG-hDLL4.结论融合蛋白GST-hDLL4在25℃,IPTG终浓度0.5 mmol/L条件下诱导表达,以GSTrap亲和层析柱纯化,获得纯化融合蛋白.采用SDS-PAGE,Western Blot的方法可检测到目的可溶性融合蛋白GST-hDLL4的表达.     

人转录因子sp1在大肠杆菌中的表达与体外纯化

目的：在大肠杆菌中表达人源转录因子spl蛋白,并进行体外纯化。方法：首先将人源sp1真核表达质粒pCMV-sp1中的sp1 cDNA用限制性内切酶切开,连入原核表达质粒pET28b,构建原核表达重组质粒pET28b-sp1-699c;然后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导表达带His-Tag的融合蛋白His-sp1（88-786aa）,通过包涵体的变复性和Ni-IDA亲和层析纯化后,SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白。结果：融合蛋白His-sp1在大肠杆菌内得到高效表达,纯化后可得到较高纯度的蛋白。结论：本研究获得了较高纯度的融合蛋白His-sp1,为进一步研究sp1蛋白对靶基因的转录调控奠定了基础。     

TDG变体的构建、表达、纯化及其DNA修复功能研究

目的:研究DNA错配修复蛋白 mTDG截短变体修复G:U错配的生物活性.方法:通过PCR扩增得到mTDG的C-端截短变体mTDG(1-279)基因片段,用Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切并回收,然后插入双酶切过的原核表达载体pET28a(+),得到pET28a-mTDG(1-279)重组质粒.将重组质粒转化表达菌株BL21(DE3),经IPTG诱导表达,过Ni+柱纯化得到His- mTDG(1-279)融合蛋白.最后通过TDG体外测活试验,测试mTDG(1-279)蛋白对G:U错配的修复活性.结果:mTDG(1-279)蛋白获得了表达和分离纯化,且体外测活实验表明mTDG(1-279)蛋白具有良好的G:U错配修复活性.结论:mTDG(1-279)蛋白依然具有修复G:U错配的生物活性,为进一步研究其活性结构域等结构与功能关系奠定了基础.     

人生物素基因的原核表达及纯化

目的构建生物素原核表达载体,获取同源性、可溶性、高纯度的重组生物素融合蛋白,为生物素的深入研究及肿瘤的早期诊断奠定基础。方法从胃癌细胞中提取RNA,经RT-PCR扩增,克隆出生物素基因;用BamHⅠ和HindⅢ对生物素DNA和载体pET32进行双酶切,构建pET32．生物素重组质粒;将重组质粒转化BL21感受态细胞,通过氨苄青霉素抗性、PCR和重组质粒双酶切筛选重组子转化菌落,经DNA测序及BLAST比对,确认生物素基因序列正确性以及插入pET32质粒的位点和方向;用IPTG诱导表达,Western-Blotting鉴定。用Ni2＋金属螯合层析柱纯化重组融合蛋白。结果通过RT-PCR。经1％的琼脂糖凝胶电泳检测,扩增的生物素DNA片段与预期大小一致。经双酶切及DNA测序鉴定,生物素DNA定向插入了pET32质粒。用重组质粒转化大肠杆菌BL21、诱导表达和纯化目的蛋白。经Western．Blotting鉴定。所诱导的蛋白为重组生物素融合蛋白。结论成功构建了生物素基因原核表达载体,表达和纯化了生物素融合蛋白。