人自体血清培养的鼻中隔软骨细胞

目的：比较人自体血清和胎牛血清对人鼻中隔软骨细胞增殖和分化的影响。方法：实验于2004—08／2005—03在解放军第一军医大学珠江医院全军儿科中心实验室完成。①全血标本取自健康鼻中隔偏曲手术患者，男2例（分别为27岁和32岁），女1例（35岁），经患者知情同意。②自体血清的制备：抽取患者全血40mL，室温静置1h后，离心（1000r／min，30min）后取上清约加mL。③取手术患者的鼻中隔软骨分离软骨细胞进行原代培养，设人自体血清组和胎牛血清组，分别加含体积分数为0．1的自体血清和胎牛血清的1640培养基，并进行传代培养。④取第3代软骨细胞接种于培养板上培养，设人自体血清组、胎牛血清组和对照组（无血清培养），分别于培养后的第1，2，3，4，5，6天行四甲基偶氮唑盐检测。⑤取第2，3，4，5，6代软骨细胞接种于养板上培养，设人自体血清组、胎牛血清组和对照组，行软骨基质蛋白多糖含量（^35S-Na2SO4掺入量）测定。⑥取第2代软骨细胞，分别将人自体血清组和胎牛血清组的细胞接种于两个25mL的培养瓶中培养至细胞传代老化，观察细胞表型。 结果：①在体积分数为0．1的血清浓度下，人自体血清和胎牛血清对人鼻中隔软骨细胞增殖作用差异不明显（P〉0．05）。②人鼻中隔软骨细胞蛋白多糖合成量的比较显示两种血清对第2，3，4，5代软骨细胞软骨基质蛋白多糖的合成作用差异不明显（P〉0．05），但在第6代，人自体血清组软骨细胞蛋白多糖合成量明显高于胎牛血清组（P〈0．01）。③胎牛血清人鼻中隔软骨细胞到第6代几乎所有细胞变为梭形，人自体血清培养的软骨细胞到第7代以后才绝大部分变为梭形细胞，初步证实了人自体血清在维持鼻中隔软骨细胞表型方面也有一定的作用。 结论：人自体血清能够有效地促进软骨细胞增殖和蛋白多糖合成同时维持细胞表型。     

冻存复苏培养的人鼻中隔软骨细胞生物学特性观察

目的：观察冻存复苏过程对人鼻中隔软骨细胞生物学特性的影响。方法：体外培养人鼻中隔软骨细胞，对冻存1周组、1个月组、3个月组和新鲜制备组的软骨细胞进行倒置相差显微镜动态观察、甲苯胺蓝异染和Ⅱ型胶原的免疫组化染色，并测定”S-Na2SO4掺入量以观察对软骨细胞蛋白多糖合成量的影响，在细胞表型和功能方面进行比较。结果：各组间软骨细胞的生长过程、特殊染色无明显差别，蛋白多糖合成量(^35S-Na2SO4掺入量)测定值为(3.2&;#177;0.24)&;#215;10^3dpm／ug DNA，统计分析其差异无显著性意义(F=0.6，P&;gt;0.05)。各组间细胞存活率差异没有显著性意义(F=2．1．P&;gt;0．05)。结论：冻存复苏的人鼻中隔软骨细胞保持了其生物特性，且冻存时间长短对冻存的软骨细胞存活率无显著影响。     

类胰岛素生长因子Ⅰ在人鼻中隔软骨细胞体外培养中的作用

目的：为加速体外培养的人鼻中隔软骨细胞的增殖，观察类胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）对体外培养软骨细胞的影响。方法：体外培养人鼻中隔软骨细胞，MTT法观察IGF-Ⅰ对软髓细胞增殖的影响；流式细胞仪检测IGF-Ⅰ对软骨细胞周期的影响；斑点杂交法了解IGF-Ⅰ对软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA的影响。结果：IGF-Ⅰ浓度大于5ng/ml即可促进体外培养软骨细胞的增殖，缩短软骨细胞增殖周期，有助于Ⅱ型胶原mRNA的合成。结论：IGF-Ⅰ促进人鼻中隔软骨细胞增殖与缩短细胞周期有关，并可能通过促进软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA的合成使软骨细胞保持表型稳定。     

自体血清培养新西兰大白兔关节软骨细胞

目的：改进与探讨新西兰大白兔软骨细胞体外培养的方法。方法：取3月龄新西兰大白兔自体血,制备自体血清备用,无菌条件下取4周龄新西兰大白兔双侧膝关节软骨,采用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法,分离关节软骨细胞并应用新西兰大白兔自体血清进行原代、传代培养;采用形态学观察,甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学方法对膝关节软骨细胞进行鉴定,MTT法检测软骨细胞的增值能力;结果：倒置显微镜下见原代软骨细胞2 h后开始贴壁,8 h可形成单层,24 h即可传代。第1~5代细胞表型稳定,增殖力良好。甲苯胺蓝染色显示培养的软骨细胞核呈深染色,细胞质呈淡蓝色;免疫组织化学显示软骨细胞Ⅱ型胶原呈黄褐色表达,MTT检测显示前5代软骨细胞增值能力强,无明显差异;结论：结果表明自体血培养的前5代新西兰大白兔节软骨细胞均可用于膝骨关节炎的研究。     

冻存复苏培养的人鼻中隔软骨细胞生物学特性观察

目的:观察冻存复苏过程对人鼻中隔软骨细胞生物学特性的影响。方法:体外培养人鼻中隔软骨细胞,对冻存1周组、1个月组、3个月组和新鲜制备组的软骨细胞进行倒置相差显微镜动态观察、甲苯胺蓝异染和Ⅱ型胶原的免疫组化染色,并测定35S-Na2SO4掺入量以观察对软骨细胞蛋白多糖合成量的影响,在细胞表型和功能方面进行比较。结果:各组间软骨细胞的生长过程、特殊染色无明显差别,蛋白多糖合成量(35S-Na2SO4掺入量)测定值为(3.2±0.24)×103dpm/μgDNA,统计分析其差异无显著性意义(F=0.6,P>0.05)。各组间细胞存活率差异没有显著性意义(F=2.1,P>0.05)。结论:冻存复苏的人鼻中隔软骨细胞保持了其生物特性,且冻存时间长短对冻存的软骨细胞存活率无显著影响。     

自体血清与胎牛血清培养兔关节软骨细胞的生物学特性

背景：目前培养软骨细胞多使用胎牛血清。但近年异种血清培养组织向临床应用的安全性受到质疑,因此自体血清培养越来越受到重视。目的：比较体积分数10%兔自体血清与体积分数10%胎牛血清培养兔关节软骨细胞生物学特性的差异。方法：兔自体血清培养液制备后,分离培养兔关节软骨细胞,分别在体积分数10%自体血清和体积分数10%胎牛血清中进行单层传代培养至1,3,5代,采用光镜观察细胞形态变化,绘制生长曲线评估细胞增殖速度,观察甲苯胺蓝染色、Ⅰ,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果,以流式细胞仪分析细胞Ⅰ,Ⅱ型胶原以及CD26,CD44的表达变化。结果与结论：①在细胞形态上自体血清和胎牛血清培养的软骨细胞差异不大。②自体血清培养的软骨细胞较胎牛血清培养的软骨细胞生长速度更快。③甲苯胺蓝染色结果示,无论是自体血清还是胎牛血清所培养的细胞,染色随代龄的增加逐渐变浅,细胞传至第5代时两组几乎均无异染。对于1代和3代细胞而言,自体血清培养的软骨细胞较胎牛血清所培养的软骨细胞较为深染。④Ⅰ型胶原的表达随代数的增加而增加,而Ⅱ型胶原的表达则随代数的增加而减少。在3代时自体血清培养的软骨细胞Ⅰ型胶原的表达水平低于胎牛血清培养的软骨细胞（P〈0.05）;在1代和3代时自体血清培养的软骨细胞Ⅱ型胶原的表达水平高于胎牛血清培养的软骨细胞（P〈0.05）。⑤CD26表达呈现先升高后降低的趋势,而CD44的表达不随传代数的增加而改变。提示同异体体积分数10%的胎牛血清相比,体积分数10%的自体血清培养的兔软骨细胞生长速度快,且在大部分指标上可以较好地保持细胞表型。     

无血清培养兔关节软骨细胞的初步研究

软骨细胞体外扩增移植治疗关节软骨缺损是近年来软骨缺损研究的热点[1-2].目前体外培养软骨细胞多是使用含血清培养基,但血清成分十分复杂,质量不恒定,不利于实验条件标准化和细胞产物的分析、提纯;     

无血清培养兔关节软骨细胞的初步研究

软骨细胞体外扩增移植治疗关节软骨缺损是近年来软骨缺损研究的热点。目前体外培养软骨细胞多是使用含血清培养基，但血清成分十分复杂，质量不恒定，不利于实验条件标准化和细胞产物的分析、提纯；同时血清中也含有一定的细胞毒性物质和抑制物质，对细胞有去分化作用，影响某些细胞功能的表达。因此，作者对无血清培养关节软骨细胞进行了初步研究。     

自体血清关节腔内注射对骨性关节炎软骨细胞凋亡的实验研究

目的:研究自体血清关节腔内注射对骨性关节炎软骨细胞凋亡率、关节腔内炎性因子浓度的影响.方法:成年雄性犬22只,行双下肢"前交叉韧带横断术"建立膝关节骨性关节炎(osteoarthritis,OA)模型后,随机分为四组:空白对照组A(左膝)vs自体血清组B(右膝)(n=11);布比卡因对照组C(左膝)vs透明质酸钠组D(右膝)(n=11),分别进行不同膝关节腔内注射.于治疗前、疗程结束后第2、4、8周进行关节软骨细胞凋亡率(TUNEL末端荧光标记法)、关节腔炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α浓度的测定(ELISA法).结果:自体血清B组治疗后2、4、8周的软骨细胞凋亡率和术前、其他三组治疗后相比显著降低(P＜0.05).A、C、D组治疗前、后软骨细胞凋亡率差异没有显著性(P＞0.05).自体血清组B和透明质酸D组治疗后2、4、8周与治疗前及空白对照A组、布比卡因C组之间相比均可以有效抑制关节腔内IL-1、IL-6水平(P＜0.05).A组和C组间治疗前、后各时点差异无显著性(P＞0.05).TNF-α水平各组间治疗前、后没有显著差异(P＞0.05).结论:自体血清关节腔内注射可有效降低OA关节软骨细胞调亡率和关节腔内IL-1和IL-6浓度.     

同种异体血清体外培养兔膝关节软骨细胞的增殖

背景:兔关节软骨细胞体外单层培养采用胎牛血清培养基易去分化,有必要寻找合适培养基来提高兔关节软骨细胞培养质量。目的:观察同种异体兔血清对体外培养的兔膝关节软骨细胞增殖能力的影响。方法:以0.4%链霉蛋白酶和0.025%Ⅱ型胶原酶分离成年兔膝关节软骨细胞,将获得的软骨细胞随机分为实验组和对照组。实验组以体积分数10%异体兔血清+DMEM/F12培养;对照组以体积分数10%胎牛血清+DMEM/F12培养,传代培养至4代。结果与结论:实验组前4代软骨细胞增殖较对照组慢,但软骨细胞形态未发生明显改变而对照组软骨细胞出现去分化现象。提示体积分数10%异体兔血清培养利于维持软骨细胞增殖和形态的稳定,是较好的获取大量优良软骨细胞的体外培养方式。     

A multi-center study of repairing articular cartilage defects of the knee using cultured autologous chondrocytes

背景:由于关节软骨再生修复能力有限,自体软骨细胞移植技术为关节软骨损伤的修复提供了较好的修复材料.目的:多中心评估自体软骨细胞移植的短期疗效与安全性.设计、时间及地点:自身前后对照观察,于2001-03/2006-04在韩国80所附属医院完成.对象:软骨缺损患者261例,男169例,女92例,年龄15～70岁,平均36.47岁.软骨缺损面积2.0～20.0 cm2.其中股骨髁损伤215例,滑车30例,髌骨25例,胫骨2例.方法:取关节非负重区软骨组织200～300 mg,体外培养扩增后将软骨细胞植入患者关节缺损区.于移植后6个月对所有患者进行随访,膝关节功能评估标准采用美国膝关节协会评分系统[Knee society score-A(KSS-A)和Knee society score-B(KSS-B)].主要观察指标:自体软骨细胞膝关节缺损区移植后KSS-A和KSS-B评分.结果:获得随访患者261例.患者移植前KSS-A评分为63.55±18.47,移植后6个月为88.74±11,47,差异有显著性意义(P＜0.05)移植前KSS-B评分为59.56±24.92,移植后6个月为85.13±14.67,差异有显著性意义(P＜0.05).患者移植前后膝关节疼痛、活动度、前后稳定性、屈曲挛缩、伸直迟滞、行走能力和上下楼能力均明显改善(P＜0.05).综合评价移植有效率为97.3%,优良率为89.3%.结论:自体软骨细胞移植可有效的治疗关节软骨缺损,促进膝关节功能的恢复.     

利用自体血清培养人外周血内皮祖细胞

背景:传统方法培养人外周血来源内皮祖细胞操作复杂,费用大,细胞获得率较低。目的:利用自体血清培养人外周血来源内皮祖细胞,并鉴定其功能。方法:采用密度梯度离心法从人外周血分离得到单个核细胞,体外培养分化为内皮祖细胞。按培养基条件不同分为EGM-2MV组、添加自体血清组(M199+体积分数10%自体血清+胰岛素样生长因子)、添加胎牛血清组(M199+体积分数10%胎牛血清+血管内皮细胞生长因子+碱性成纤维细胞生长因子+胰岛素样生长因子+表皮生长因子)。观察内皮祖细胞增殖、迁移能力;采用细胞形态观察、双荧光染色法及流式细胞仪等技术对培养的内皮祖细胞进行鉴定。结果与结论:培养第7天,EBM-2MV组和添加自体血清组细胞增殖能力和迁移率都优于添加胎牛血清组(P<0.05)。每组细胞经结合Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素双色荧光染色鉴定后双阳性率>80%,免疫细胞化学检测显示每组细胞CD133,CD34和KDR的表达均为阳性。证实在M199培养液中添加自体血清是一种简单、高效的培养内皮祖细胞方法。     

人胎关节软骨细胞体外培养的生物学特性

目的:研究软骨组织工程中传代软骨细胞与原代的差异。方法:用5个月人胎关节软骨分离培养细胞,观察细胞存活率、贴壁率、生长曲线和组织形态学的改变。结果:(1)软骨块在4℃下,3d 内细胞存活率可达 93.4％～97.6％。(2)原代细胞为圆形或三角形;第4代有一半转变成梭形,到第6代全部变为长梭形。(3)传代细胞贴壁时间(2～3h)短于原代(4～7h)。玻璃瓶内贴壁率传代细胞为78.7％～85.5％,原代8.8％。(4)生长曲线表明,从原代到第4代都有高增殖力;到第8代时增殖降低;到第12代几乎丧失细胞增殖。结论:软骨块4℃冷藏,3d内对细胞存活率无明显影响。第4代细胞贴壁快、增殖快,适于作为组织工程用细胞。第8代以后不适合。     

Chondrogenic differentiation of human chondrocytes cultured in the absence of ascorbic acid

Bioreactor systems will likely play a key role in establishing regulatory compliant and cost‐effective production systems for manufacturing engineered tissue grafts for clinical applications. However, the automation of bioreactor systems could become considerably more complex and costly due to the requirements for additional storage and liquid handling technologies if unstable supplements are added to the culture medium. Ascorbic acid (AA) is a bioactive supplement that is commonly presumed to be essential for the generation of engineered cartilage tissues. However, AA can be rapidly oxidized and degraded. In this work, we addressed whether human nasal chondrocytes can redifferentiate, undergo chondrogenesis, and generate a cartilaginous extracellular matrix when cultured in the absence of AA. We found that when chondrocytes were cultured in 3D micromass pellets either with or without AA, there were no significant differences in their chondrogenic capacity in terms of gene expression or the amount of glycosaminoglycans. Moreover, 3D pellets cultured without AA contained abundant collagen Types II and I extracellular matrix. Although the amounts of Collagens II and I were significantly lower (34% and 50% lower) than in pellets cultured with AA, collagen fibers had similar thicknesses and distributions for both groups, as shown by scanning electron microscopy imaging. Despite the reduced amounts of collagen, if engineered cartilage grafts can be generated with sufficient properties that meet defined quality criteria without the use of unstable supplements such as AA, bioreactor automation requirements can be greatly simplified, thereby facilitating the development of more compact, user‐friendly, and cost‐effective bioreactor‐based manufacturing systems.     

Passaged human chondrocytes accumulate extracellular matrix when induced by bovine chondrocytes

A source of sufficient number of cells is a major limiting factor for cartilage tissue engineering. To circumvent this problem, we developed a co‐culture method to induce redifferentiation in bovine articular chondrocytes, which had undergone dedifferentiation following serial passage in monolayer culture. In this study we determine whether human osteoarthritic (OA) and non‐diseased passaged dedifferentiated chondrocytes will respond similarly. Human passaged chondrocytes were co‐cultured for 4 weeks with primary bovine chondrocytes and their redifferentiation status was determined. Afterwards the cells were cultured either independently or in co‐culture with cryopreserved passaged cells for functional analysis. The co‐culture of passaged cells with primary chondrocytes resulted in reversion of their phenotype towards articular chondrocytes, as shown by increased gene expression of type II collagen and COMP, decreased type I collagen expression and extracellular matrix formation in vitro. Furthermore, this redifferentiation was stable, as those cells not only formed hyaline‐like cartilage tissue when grown on their own but also they could induce redifferentiation of passaged chondrocytes in co‐culture. These data suggest that it may be possible to use autologous chondrocytes obtained from osteoarthritic cartilage to form tissue suitable to use for cartilage repair. Copyright © 2009 John Wiley & Sons, Ltd.     

不同方法体外培养软骨细胞的活力、功能及成软骨能力

目的探讨不同体外培养方法所培养软骨细胞活力、表型及成软骨能力的差异。方法取股骨髁关节面软骨,经不完全酶消化法消化后,与未完全消化的软骨块置入预涂多聚赖氨酸的培养瓶中培养;以传统法对照,用倒置显微镜、免疫组化等方法进行观测;并将多次传代后的软骨细胞悬液注入裸鼠腋部皮下,观察其成软骨能力。结果改良法培养的细胞活性率可达100%;经多次传代的软骨细胞仍保持初代软骨细胞的表型特征,并可观察到软骨的特有的细胞-胶原纤维几何构象;移植到裸鼠皮下后可形成软骨样组织。结论改良法是一种较方便、有效的培养法。     

成人关节软骨细胞增殖与人参皂甙Rg1的促进作用

背景：人参总皂甙的主要有效成分为人参皂甙Rg1,有促进细胞增殖、抗衰老、抗细胞凋亡、抗炎及抗自由基等作用,但以往实验对象多为鼠、兔等动物的关节软骨细胞。目的：体外培养成人软骨细胞,观察人参皂甙Rg1对体外培养的成人关节软骨细胞增殖的促进作用。方法：实验分2组,Rg1组使用含质量浓度为40mg/L人参皂甙Rg1的DMEM培养液培养,对照组使用未加人参皂甙的DMEM培养液培养,每日应用倒置相差显微镜观察细胞生长情况至第7天,并进行细胞计数。同时培养至第6天检测软骨细胞中Ⅱ型胶原的表达。结果与结论：对照组自培养第2天起细胞进入对数增殖期,到第7天细胞数约为接种时的8倍。Rg1组自培养第2天起细胞增殖能力较对照组增强（P〈0.05）,到第7天细胞数约为接种时的18倍（P〈0.05）。免疫组织化学SABC法检测结果显示,Rg1组与对照组细胞胞浆均可见Ⅱ型胶原表达,两组差异无显著性意义（P〉0.05）。说明人参皂甙Rg1可促进成人软骨细胞的增殖。