HBV母婴传播胎盘细胞感染体外模型建立

目的 研究胎盘滋养层细胞系Bewo被乙型肝炎病毒(HBV)感染的可能性,为HBV母婴传播过程中胎盘细胞感染机制的研究建立合适的体外模型.方法 高浓度HBV DNA阳性血清与Bewo细胞共培养,荧光定量PCR法检测培养上清中HBV DNA含量;免疫组织化学技术检测细胞爬片Bewo细胞中HBsAg的表达.结果 HBVDNA阳性血清与Bewo共培养1 d后及时清洗细胞,更换培养液后1,2,3 d,细胞培养上清液中HBV DNA含量为4.67×103,2.22×104,3.63×103;HBV DNA阳性血清与Bewo共培养2 d后及时清洗细胞,更换培养液后1,2,3 d,细胞培养上清液中HBV DNA含量为3.21×104,3.99×104,5.77×104.免疫组织化学技术检测细胞爬片Bewo细胞中HBsAg呈阳性表达.HBV DNA阳性血清与Bewo共培养对细胞形态无明显影响.结论 胎盘滋养层细胞系Bewo与HBV DNA阳性血清共孵育可被HBV直接感染,该细胞系可用于进行胎盘HBV感染机制的研究.     

polyI:C诱导人胎盘滋养层细胞抗HBV感染的体外研究

目的:探讨体外polyI:C对人胎盘滋养层细胞乙型肝炎病毒(HBV)感染的作用。方法:将2μg或8μg HBV重组质粒pcDNA3.1(+)-HBV1.3转染人胎盘滋养层细胞Bewo,12 h后以Toll样受体3(TLR3)配体polyI:C处理3天,同时设对照组。采用微粒子酶免疫分析法(MEIA)和荧光定量PCR法分别检测细胞上清液HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平,并以荧光定量RT-PCR和ELISA分别检测细胞TLR3 mRNA表达及细胞上清IFN-β水平。结果:与对照组比较,polyI:C均可显著抑制Bewo细胞HBV复制(P<0.01或0.05),但与2μg HBV重组质粒转染组比较,转染8μg HBV重组质粒组polyI:C对HBV复制的抑制率显著下降(P<0.01),且polyI:C诱导Bewo细胞TLR3 mRNA表达及IFN-β水平显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:polyI:C可诱导人胎盘滋养层细胞抗HBV感染,但随着HBV感染量的增大,通过下调细胞TLR3 mR-NA表达及IFN-β产生,其抗HBV感染的作用被显著削弱。     

polyⅠ:C诱导人胎盘滋养层细胞抗HBV感染的体外研究

目的:探讨体外polyⅠ:C对人胎盘滋养层细胞乙型肝炎病毒(HBV)感染的作用.方法:将2μg或8μg HBV重组质粒pcDNA3.1(+)-HBV1.3转染人胎盘滋养层细胞Bewo,12 h后以Toll样受体3(TLR3)配体polyⅠ:C处理3天,同时设对照组.采用微粒子酶免疫分析法(MEIA)和荧光定量PCR法分别检测细胞上清液HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平,并以荧光定量RT - PCR和ELISA分别检测细胞TLR3 mRNA表达及细胞上清IFN -β水平.结果:与对照组比较,polyⅠ:C均可显著抑制Bewo细胞HBV复制(P＜0.01或0.05),但与2μgHBV重组质粒转染组比较,转染8μgHBV重组质粒组polyⅠ:C对HBV复制的抑制率显著下降(P＜0.01),且polyⅠ:C诱导Bewo细胞TLR3 mRNA表达及IFN -β水平显著下降,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:polyⅠ:C可诱导人胎盘滋养层细胞抗HBV感染,但随着HBV感染量的增大,通过下调细胞TLR3 mRNA表达及IFN -β产生,其抗HBV感染的作用被显著削弱.     

RIG-I配体poly(dAT:dAT)诱导Bewo细胞抑制乙型肝炎病毒复制的研究

目的探讨维甲酸诱导基因-I(retinoic acid inducible gene I,RIG-I)配体poly(d AT:d AT)抑制人滋养层细胞Bewo中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的作用及机制,为防治HBV宫内感染提供依据。方法首先将2μg 1.3倍HBV全基因重组质粒pc DNA3.1(+)-HBV1.3转染Bewo细胞12 h后,以RIG-I配体poly(d AT:d AT)处理24 h。然后,以poly(d AT:d AT)处理Bewo细胞,观察干扰素-β(interferon-β,IFN-β)表达的动力学。采用微粒子酶免疫分析法和荧光定量聚合酶链反应法分别检测HBs Ag、HBe Ag和HBV DNA水平,并以酶联免疫吸附测定和逆转录PCR分别检测IFN-β水平,RIG-I、线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)、干扰调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF 3)和核因子-κB(NF-κB)的表达。结果 poly(d AT:d AT)可显著诱导Bewo细胞产生IFN-β(P0.05),呈时间和剂量依赖性。与对照组比较,poly(d AT:d AT)处理组HBs Ag、HBe Ag和HBV DNA水平显著下降(P0.05),可显著抑制Bewo细胞中HBV复制。且poly(d AT:d AT)可诱导HBV重组质粒转染的Bewo细胞表达RIG-I、MAVS、IRF 3和NF-κB mRNA。结论通过RIG-I/MAVS信号途径诱导Bewo细胞产生IFN-β,RIG-I配体poly(d AT:d AT)可显著抑制HBV复制。     

乙型肝炎病毒感染人胎盘绒毛膜癌BeWo细胞体外培养模型的建立

目的建立乙型肝炎病毒（HBV）感染人绒毛膜癌滋养层细胞（BeWo）体外培养模型,探讨HBV宫内感染机制。方法应用高病毒载量的HBV阳性血清感染BeWo细胞并传代,应用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术检测感染初代细胞和传代细胞内以及上清液中HBV DNA量;应用化学发光微粒子免疫法检测感染后初代细胞和传代细胞的上清液中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)量;应用SABC免疫组化检测感染细胞内HBsAg、乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的表达。结果感染初代各时间点细胞内和上清液中HBV DNA量随时间延长而增加,120 h HBV DNA量最高;传代细胞内和上清液中HBV DNA量随传代次数增加逐渐降低,5代后检测均为阴性。感染初代各时间点细胞的上清液中HBsAg量随时间延长而增加;传代细胞的上清液中HBsAg量在1～3代为阳性,但量逐渐降低,4代后均为阴性。感染初代各时间点细胞和传代细胞的上清液中HBeAg量均为阴性;1～3代细胞HBsAg、HBcAg染色可见阳性细胞。结论HBV可以感染BeWo细胞,且能在传代细胞中表达;BeWo细胞可用于HBV宫内感染机制的研究。     

乙型肝炎病毒体外感染HepG2细胞的初步研究

目的建立HBV阳性血清体外感染HepG2细胞的实验模式。方法在六孔板上培养HepG2细胞,用HBV阳性血清体外感染HepG2细胞,设立感染组和对照组。用HBV阳性血清和感染组细胞共孵育24 h,0.01 mol/L PBS清洗细胞后,每孔板中加入4 ml DMEM细胞培养液,每隔12 h收集细胞上清液至PBS洗后84 h。收集完最后一次细胞上清液,收集细胞培养板中的细胞。ELSIA检测细胞培养上清中HBsAg;PCR方法检测细胞培养上清和细胞中HBV DNA;免疫荧光定量PCR检测细胞培养上清中HBV DNA的含量。结果HBV感染组细胞培养上清,在PBS洗后第12 h,ELISA即可检测到HBsAg并持续到84 h,PCR检测感染组细胞培养上清和感染组细胞的HBV DNA均阳性。荧光定量PCR检测感染组细胞培养上清中HBV DNA的结果:感染组PBS洗后(0 h)的HBV定量为阴性,而在PBS洗后36 h8、4 h细胞培养上清中HBV的量达到5×105,3×106copies/ml)。结论用HBV阳性血清体外感染HepG2细胞的实验是可行的。     

HBV阳性血清体外感染HepG-2细胞方法建立

目的建立乙型肝炎病毒(HBV)阳性血清体外感染人肝癌细胞系HepG-2的方法。方法低温同步化处理HepG-2细胞后用高浓度HBV阳性血清与含有4%聚乙二醇的无血清伊格尔极限必需培养基(MEM)共孵育HepG-2细胞,设阴性对照组和空白对照组;18 h后加入含10%胎牛血清的MEM继续培养6 d,每隔24 h收集细胞和培养上清,荧光定量PCR检测HBV DNA,间接免疫荧光技术检测细胞内乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。结果 HBV阳性血清感染组HepG-2细胞内和培养上清中在感染后第1 d可检测到HBV DNA,分别为(16.04±7.99)×103、(8.84±3.97)×103 copies/mL,细胞内DNA含量在第2 d达到(3.51±1.86)×105 copies/mL,然后逐渐下降,在第4 d降到检测下限以下,而培养上清中病毒DNA在检测的时间内逐渐升高,在第6天达到(8.41±5.34)×105 cop-ies/mL;间接免疫荧光检测感染组细胞膜和胞浆中均有HBsAg表达;传代培养感染细胞后,在第1代细胞培养上清和细胞内均可检测到HBV DNA(3.58×105、7.34×105 copies/mL),第2代培养上清中可检测到少量HBV DNA(2.89×103 copies/mL),但细胞内检测到HBV DNA低于检测下限(896 copies/mL),第3代细胞的上清和细胞内均未检测到HBV DNA。结论 HBV阳性血清在一定条件下可以感染HepG-2细胞,病毒能在细胞内进行短期复制。     

外周血单个核细胞感染乙型肝炎病毒对新生儿宫内感染的影响

目的 :探讨 HBs Ag、 HBe Ag阳性孕妇外周血单个核细胞 ( PBMC)内乙型肝炎病毒 ( HBV) DNA感染状况及其在宫内母婴垂直传播中的作用。方法 :对 HBs Ag/ HBe Ag双阳性共 6 7对孕妇及其新生儿静脉血分离和提纯 PBMC后 ,经抽提、纯化后的 DNA进入 PCR扩增反应 ,引物为 HBV C区基因序列。结果 :6 7例 HBs Ag及 HBe Ag双阳性的孕妇中有 35例 ( 5 2 .2 % )PBMC中 HBV DNA阳性 ,2 5例孕妇在血清及 PBMC中均发现 HBV DNA。6 7例新生儿有 2 2例感染 HBV DNA,感染率 32 .8% ,其中血清 HBV DNA阳性者 10例 ,PBMC HBV DNA阳性者 19例 ,二者均阳性者 7例。结论 :母亲 PBMC内 HBV DNA阳性可能导致新生儿 PBMC中 HBV DNA阳性 ,PBMC内的 HBV DNA可能是 HBV母婴垂直传播的一条重要途径 ,同时 ,HBs Ag及HBe Ag阳性母亲若血清 HBV DNA为阳性就极大增加了其新生儿感染 HBV的危险性     

外周血单个核细胞感染乙型肝炎病毒对新生儿宫内感染的影响

目的探讨HBsAg、HBeAg阳性孕妇外周血单个核细胞(PBMC)内乙型肝炎病毒(HBV)DNA感染状况及其在宫内母婴垂直传播中的作用.方法对HBsAg/HBeAg双阳性共67对孕妇及其新生儿静脉血分离和提纯PBMC后,经抽提、纯化后的DNA进入PCR扩增反应,引物为HBV C区基因序列.结果67例HBsAg及HBeAg双阳性的孕妇中有35例(52.2%)PBMC中HBV DNA阳性,25例孕妇在血清及PBMC中均发现HBV DNA.67例新生儿有22例感染HBV DNA,感染率32.8%,其中血清HBV DNA阳性者10例,PBMC HBV DNA阳性者19例,二者均阳性者7例.结论母亲PBMC内HBV DNA阳性可能导致新生儿PBMC中HBV DNA阳性,PBMC内的HBV DNA可能是HBV母婴垂直传播的一条重要途径,同时,HBsAg及HBeAg阳性母亲若血清HBV DNA为阳性就极大增加了其新生儿感染HBV的危险性.     

HCV感染实验探讨人胎盘滋养层细胞分子生物性及侵袭力

目的探讨持续感染丙型肝炎病毒(HCV)对体外培养人胎盘合体滋养层细胞分子生物学性状及其金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9合成及分泌的影响。方法分别采用Matrigel人工重建基底膜侵袭实验、MTT法细胞黏附实验、细胞移动实验,研究HCV RNA阳性患者血清感染的体外培养人胎盘滋养层细胞(感染组)侵袭能力以及侵袭相关的黏附、移动能力的改变;检测培养上清中人绒毛膜促性腺激素(HCG)浓度以评估感染对细胞激素合成、分泌能力的影响。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清MMP-2和MMP-9水平,分析感染组和对照组(健康体检者血清培养)数据间的差异,并用明胶酶谱进一步验证ELISA结果。应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分析感染对细胞proMMP-2和proMMP-9 mRNA表达的影响。结果感染组细胞侵袭、黏附、移动以及激素合成、分泌能力较对照组细胞均显著下降(P0.05)。感染组细胞分泌MMP-2和MMP-9能力明显下降(与对照组比较,MMP-2:t=4.186,P0.05;MMP-9:t=2.325,P0.05);RT-PCR结果显示感染组细胞proM-MP-2和proMMP-9 mRNA表达弱于对照组,但差异无显著性(proMMP-2:t=1.196,P0.05;proMMP-9:t=1.417,P0.05)。结论持续HCV感染的体外培养人胎盘合体滋养层细胞MMP-2和MMP-9合成、分泌能力下降。持续感染HCV可抑制体外培养人胎盘合体滋养层细胞包括侵袭能力和激素合成、分泌能力在内的多种生物学功能。     

乙型肝炎病毒宫内传播机制研究进展

慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染者中母婴传播占50％以上,围生期HBV感染者90％以上会发展为慢性携带者,且有较高肝硬化和(或)肝癌的发生风险.宫内感染是乙型肝炎疫苗+乙型肝炎免疫球蛋白联合免疫失败致HBV母婴传播的主要原因.HBV宫内感染途径有生殖细胞感染、经胎盘屏障渗漏、经胎盘细胞...     

CD81和LDLR在不同妊娠时期绒毛组织中的定位与表达

目的检测CD81、低密度脂蛋白受体(LDLR)在人胎盘绒毛组织滋养层细胞中mRNA表达水平,了解一些可能参与丙型肝炎病毒(HCV)入胞的宿主因子表达。方法通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测CD81、LDLR在人胎盘绒毛组织滋养层细胞中mRNA表达水平,并采用免疫荧光方法检测CD81、LDLR在不同孕期胎盘绒毛组织的表达。结果发现不同孕期胎盘绒毛组织的CD81、LDLR表达量随孕期呈递增趋势。采用免疫荧光方法证实了CD81、LDLR在不同孕期胎盘绒毛组织的表达。结论胎盘绒毛组织滋养层细胞中可以定位并表达HCV入胞的宿主相关因子CD81、LDLR。为进一步研究CLEC4M传播HCV的分子机制奠定了实验基础。     

脂多糖经MyD88/NF-κB信号途径抑制Bewo细胞中乙型肝炎病毒复制

目的 探讨Toll样受体4(TLR4)配体脂多糖(LPS)抑制人滋养层细胞Bewo中乙型肝炎病毒( HBV)复制的作用机制,为防治HBV宫内感染提供依据.方法 首先将2μg 1.3倍HBV全基因重组质粒pcDNA3.1(+)-HBV1.3转染Bewo细胞12h后,以TLR4配体LPS处理3d.尔后用LPS处理Bewo细胞,观察IFN-β、TNF-α表达的动力学、NF-κB拮抗剂二硫代氨基甲酸吡咯烷( PDTC)对LPS诱导Bewo细胞产生细胞因子的作用.采用微粒子酶免疫分析法(MEIA)和荧光定量PCR法分别检测HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平,并以ELISA和RT-PCR分别检测IFN-β、TNF-α水平及TIR结构域的转接蛋白(TRIF)、髓样分化蛋白(MyD88)表达.结果 与对照组比较,LPS可显著抑制Bewo细胞中HBV复制(P＜0.01),且LPS可显著诱导Bewo细胞产生TNF-α(P＜0.05),呈时间和剂量依赖性.PDTC可抑制LPS诱导细胞产生TNF-α,显著低于对照组(P＜0.01),但对IFN-β无显著作用(P＞0.05).与对照组比较,LPS可诱导HBV重组质粒转染的Bewo细胞表达MyD88(P＜0.01).结论 通过MyD88/NF-κB信号途径诱导Bewo细胞产生TNF-α,TLR4配体LPS可显著抑制HBV复制.     

脂多糖经MyD88／NF-KB信号途径抑制Bewo细胞中乙型肝炎病毒复制

目的探讨Toll样受体4（TLR4）配体脂多糖（LPS）抑制人滋养层细胞Bewo中乙型肝炎病毒（rtBv）复制的作用机制,为防治HBV宫内感染提供依据。方法首先将2txg1．3倍HBV全基因重组质粒pcDNA3．1（＋）-HBV1．3转染Bewo细胞12h后,以TLR4配体LPS处理3d。尔后用LPS处理Bewo细胞,观察IFN—β、TNF-a表达的动力学、NF—KB拮抗剂二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）对LPS诱导Bewo细胞产生细胞因子的作用。采用微粒子酶免疫分析法（MEIA）和荧光定量PCR法分别检测HBsAg、HBeAg和HBVDNA水平,并以ELISA和RT—PCR分别检测IFN-β、TNF—a水平及TIR结构域的转接蛋白（TRIF）、髓样分化蛋白（MyD88）表达。结果与对照组比较,LPS可显著抑制Bewo细胞中HBV复制（P〈0．01）,且LPS可显著诱导Bewo细胞产生TNF-a（P〈0．05）,呈时间和剂量依赖性。PDTC可抑制LPS诱导细胞产生TNF-a,显著低于对照组（P〈0．01）,但对IFN—β无显著作用（P〉0．05）。与对照组比较,LPS可诱导HBV重组质粒转染的Bewo细胞表达MyD88（P〈0．01）。结论通过MyD88／NF—KB信号途径诱导Bewo细胞产生TNF—a,TLR4配体LPS可显著抑制HBV复制。     

乙肝血清标记物阳性孕妇的胎盘组织和PBMC的HBVDNA检测及意义

为探讨乙型肝炎病毒（HBV）宫内感染的机理,本文采用原位分子杂交技术,测定了20份外周血HBsAg/HBeAg双阳孕妇胎盘组织和24份HBsAg阳性孕妇外周血单核细胞（PBMC）的HBV DNA,结果发现,胎盘组织HBV DNA均阳性;HBV DNA主要分布于胎盘蜕膜,而绒毛滋养层细胞未见阳性,提示HBV已侵袭胎盘蜕膜,且可能在蜕膜细胞中有复制,但未累及绒毛,PBM HBV DNA测定结果表明,HBV DNA阳性率为58．3％（14／24）,阳性的孕妇中,有2例其婴儿发生了宫内感染。     

HBsAg阳性产妇血清、乳汁和新生儿血清中乙肝病毒DNA检测结果分析

目的:检测乙肝病毒血清学标志物阳性产妇血清、乳汁及其新生儿脐带血中HBV DNA含量,指导哺乳,减少母婴传播。方法:用荧光定量PCR法检测产妇血清、乳汁和新生儿脐带血中HBV DNA含量。结果:血清高病毒血症组(≥108copies/ml)产妇初乳和新生儿脐血HBV DNA阳性率明显高于其他组。同时与血清HBeAg存在显著相关,血清HBeAg阳性组中产妇自身HBV DNA阳性率明显高于HBeAg阴性组,在初乳和脐血中的HBV DNA也有差异。结论:乙肝病毒宫内感染的发生率与孕妇血清HBV DNA含量相关,孕晚期高病毒血症与宫内感染显著相关;产妇血清高HBV DNA含量,乳汁HBV DNA阳性不适宜母乳喂养,HBeAg阳性者应加强监测,在科学的指导下母乳喂养。     

孕早期胎盘HBV感染的危险因素分析

目的:观察孕早期HBsAg阳性孕妇流产胎盘组织(乙型肝炎病毒)HBV感染情况,分析可能的危险因素,为进一步探讨HBV宫内感染机制提供线索,并为预防措施的制订提供初步的理论依据。方法:采用巢式病例对照研究,对355例自愿流产孕妇中外周血HBsAg阳性者按统一的调查表进行调查,并对其流产胎盘进行免疫组化和HBVDNA原位杂交检测,运用SPSS10.0统计软件对资料和结果进行统计处理和分析。结果:孕妇HBsAg携带率为7%;早期发育的胎盘HBV感染率为32%;孕妇外周血HBVDNA的高浓度(OR=22.5,P=0.004)和HBeAg阳性(OR=12.5,P=0.008),是孕早期胎盘感染的主要危险因素。结论:HBV可感染早期发育的胎盘,感染率为32%;血HBVDNA的高浓度和HBeAg阳性的孕妇,其孕早期胎盘感染HBV的可能性较大。     

乙型肝炎宫内感染免疫失败的原因

孕妇外周血乙型肝炎病毒高浓度、HBeAg阳性、先兆早产和胎盘绒毛毛细血管内皮乙型肝炎病毒感染是胎儿感染乙型肝炎病毒的高危因素。胎儿宫内感染的传播可经两条途径 ,即血源性和细胞性。乙肝免疫球蛋白或拉米夫定的阻断可降低乙型肝炎病毒宫内感染的发生率。变异病毒可以逃避新生儿接种疫苗所产生的免疫 ,乙型肝炎病毒变易株的选择性传播导致了免疫失败