如何提高PCR检测的准确率

PCR是近年来发展起来的一种快速的特定DNA片断体外扩增的一种方法.广泛应用于传染病、遗传性疾病和血液病等.具有特异性强、灵敏度高、简便快速、样品取材范围广等特点.但是,由于PCR强大的扩增能力与检测的敏感性,极微量的污染即可导致假阳性、假阴性的产生.如何在检测中避免污染,提高实验的准确率呢?根据我室多年的实践,总结了几点体会和建议,仅供参考.现简述如下.     

PCR实验室污染的排除

PCR技术是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，该技术通过重复高温变性、低温退火、中温延伸等简单的3个温度循环，能将靶DNA扩增数百万倍，获得极高的检测敏感性。但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的结果。如果形成气溶胶污染而扩散，则可引起整个PCR实验室的污染，处理起来非常麻烦，严重的甚至要关闭PCR实验室。我实验室也曾经遭遇过气溶胶的污染，所幸的是经过一段时间的处理，最终将PCR实验室污染排除掉了。现将经过向大家报告如下。     

单细胞扩增前引物延伸多基因位点检测研究

目的：考察单细胞扩增前引物延伸（PEP）全基因组扩增，后续巢式PCR同步检测β地中海贫血突变基因CD17、nt-28及连锁基因（ATTTT）、18和21号染色体短串联重复序列D18S51、D21S11和D21S1411、囊性纤维病CF△F508及连锁基因（GATT）、杜氏肌营养不良症DMD基因外显子17种48以及Y染色体性别决定基因SRY的可行性。方法：显微操作获取单个淋巴细胞和胚胎细胞，PEP全基因组扩增，后续特异性巢式PCR，检测上述10个基因位点的单细胞扩增成功率、假阳性率、假阴性率。结果：上述10个位点的单个淋巴细胞扩增成功率、假阳性率和假阴性主分别为89．5％、0．48％和2．50％，单个胚胎细胞扩增成功率和假阳性率分别为85．56％和3．0％。结论：单细胞PEP后续巢式PCR同步检测上述10个基因位点有较高的扩增成功率和很低的假阳性率和假阴性率，具有应用于植入前遗传学诊断的实际可行性。     

ITS结合RPS0两步PCR快速鉴定临床5种假丝酵母菌

目的:建立快速准确鉴定常见假丝酵母菌种类的基因检测技术。方法:提取假丝酵母菌基因组DNA;第一步PCR用通用引物扩增ITS基因;第二步三重PCR用种特异性引物扩增RPS0基因;分别对已知及未知样本检测、验证。结果:ITS基因扩增,光滑假丝酵母菌(Cg)和克柔假丝酵母菌(Ck)分别得到与预期结果吻合的881bp和419bp的PCR产物;白假丝酵母菌(Ca)、热带假丝酵母菌(Ct)和近平滑假丝酵母菌(Cp)的ITS扩增片段均略大于500bp;RPS0三重PCR对Ca、Ct和Cp DNA扩增,分别得到约310bp、147bp及110bp的片段,与预期结果相符;30株已知假丝酵母菌两步PCR检测结果,种类符合率为100%;43株未知样本两步PCR鉴定结果,经RPS0扩增产物序列测定,符合率亦为100%。结论:建立了ITS通用基因结合RPS0种特异基因鉴定5种常见假丝酵母菌种类的两步PCR技术,该技术简单、快速、准确及廉价;对双重感染患者更有鉴别优势,有临床应用价值。     

多重聚合酶链反应检测结核菌耐异烟肼相关基因

目的：建立耐异烟肼(isoniazid,INH)结核分枝杆菌(M.tuberclasis,MTB)多重聚合酶链反应(multiple PCR,multi-PCR)检测系统，在一次扩增中快速，特异地同时检出aphC启动子，inhA和kagG基因，用于快速初步诊断结核分枝杆菌对INH的耐药性．方法：根据结核分枝杆菌的aphC启动子，inhA和kagG序列，分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物，采用multi—PCR技术，同时检出对结核分枝杆菌耐INH起作用的3个基因．结果：应用multi—PCR反应体系，对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果；multi—PCR扩增的预期结果为：单基因引物出现一条特异性扩增区带，多重基因引物出现2或3条特异性扩增区带，经实验达到预期的扩增结果；对H37Rv标准株、INH敏感株及INH耐药株分别采用常规PCR和multi—PCR进行同时扩增，结果两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段，符合率达100％．结论：multi—PCR能有效地为多基因耐药的临床病原体的诊断提供快速、准确的诊断手段，更能提高检验效率。     

提高准确检测PCR的主要因素

聚合酶链反应（PCR）技术是高新基因诊断技术，具有快速、敏感度高、特异性强等优点，现已广泛应用于医学检验中。但PCR样品制备不得当或试剂盒质量不好等原因均可影响PCR检测的准确性，为了给临床医生提供可靠信息，必须加强PCR实验室的管理以确保检测结果快速、准确。1PCR实验室的基础设施PCR技术对操作环境要求十分严格，首先要求具备三个相互隔离的实验室，既标本处理室、PCR产物扩增室及结果观察室．以减少样品转移时的污染机会。2仪器质量的保证主要是扩增仪，要求循环温度与时间必须准确、应定期检查门次／周），并记录扩增…     

双引物聚合酶链反应同时快速检测梅毒螺旋体和单纯疱疹病毒Ⅱ型

目的 建立双引物聚舍酶链反应（PCR）用于同时快速检测梅毒螺旋体和单纯疱疹病毒Ⅱ型。方法 基于单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）的DNA聚合酶基因以及梅毒螺旋体47KD膜蛋白基因序列，自行设计2对特异性寡核苷酸引物，建立了同时检测上速2种痛原体的双引物PCR。结果 各特异性引物仅扩增相应的病原体DNA，即单纯疱疹病毒Ⅱ型扩增产物为202bp以及梅毒螺旋体扩增产物为252bp。其他11种生殖道常见微生物及正常人基因组DNA不被扩增。检测了51例临床标本，梅毒螺旋体暗视野显微镜检查阳性检出率为15．7％，双引物PCR阳性检出率为19．6％；二种方法检测结果间比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。HSV阳性培养率23．6％，双引物PCR阳性率47．1％，双引物PCR阳性检出率显著高于HSV培养且差异有统计学意义（P=0．019）；上速临床标本分别进行了2种痛原体的单引物PCR，与双引物PCR对照结果完全一致。结论 我们建立的双引物PCR一次可同时检测2种病原体，且有快速、敏感、特异以及简便的特点。     

PCR检测中的几点体会

PCR即聚合酶链式反应,是80年代中期创建的一种体外基因扩增技术,具有快速,灵敏、简便,特异性强等特点。 1 PCR检测中假阴性的解决办法 一般情况下,检测中对假阳性的原因及控制较重视,但对假阴性则容易忽视。造成假阴性的原因有许多,除药盒、仪器的质量引起之外,还有一种是操作中检查不缜密造成的。当证实某一实验体系是切实可行以后,应定期用标准水银温度计检查扩增仪的设置温度,显示温度,实际温度是否一致。尤其是水浴循环扩增仪,需每次扩增前都用温度计调试。电泳槽液虽能反复使用,但亦应定期测定PH值。否则对结果的观察也有很大影响。每次设立阳性     

基于FOK1酶体系的PCR防污染法及在产前诊断中的应用

目的：建立一种有效、实际操作强的聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）防污染法并用于产前检测叶酸利用能力。方法：在1条引物的5′端加入限制性内切酶FOK1的识别序列,将FOK1酶加入PCR扩增反应体系中,切断污染的前PCR产物,考察体系中FOK1酶的用量、酶切扩增一体式反应体系成分的比例及污染量的可控程度,并应用于亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR）基因上C677T突变位点的分析。结果：FOK1酶最佳反应体系却抑制PCR扩增;在TaKaRa反应体系中,0.5 U FOK1酶可完全切割≤0.1 μL含有酶切位点的前扩增产物,且成功扩增,而不加入FOK1酶无法控制假阳性结果。FOK1酶切防污染法成功用于MTHFR C677T的测序检测。结论：本方法有效便捷,完全实现了闭管防止PCR污染,不影响后续测序反应,不仅可适用于以PCR扩增为基础的产前诊断等测序分析,更可广泛应用于所有涉及核酸扩增诊断的实验室防治PCR污染中。     

套式PCR在检测结核分枝杆菌embB基因突变中的应用价值

目的采用套式PCR（二次扩增）替代传统PCR（一次扩增）扩增痰中结核分枝杆菌embB基因。探讨其在检测结核分枝杆菌embB基因突变中的应用价值。方法选取本院已确诊的活动性肺结核住院病人68例和非结核肺部感染病人16例，嘱其留取晨痰，分别进行套式PCR扩增和传统PCR扩增，再行产物分析。结果68例活动性肺结核病人传统PCR扩增embB基因阳性结果为29例，阳性率为42．6％。套式PCR扩增embB基因阳性结果为47例。阳性率为69．1％，两者比较差异有显著性（X^2=9．66，P〈0．05）；16例非结核病人传统PCR和套式PCR和检测结果均为阴性，两者特异度均为100％。结论检测结核分枝杆菌embB基因突变，套式PCR灵敏度高于传统PCR．两者特异度相同，套式PCR能快速、敏感、特异地扩增结核分枝杆菌embB基因片段。     

同时检测四种病原菌的PCR方法分析

目的本文主要是讨论同时检测金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌和志贺菌的四种在食物感染常见的病原菌的快速PCR检测方法。方法选取我中心从2010年3月-2011年3月检验科收集的病原样本共60例作为研究对象。其中包括金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌和志贺菌。采用多重PCR检测方法进行检验。结果将需要检测的4中病原菌加入需扩增浓度混合液中,并且加入PCR扩增体系中进行PCR扩增。结果显示没有出现有扩征带,并且4种病原菌均出现其特异性扩增带,说明4种病原菌之间没有相互干扰,而且没有出现假阳性结果。结论多重PCR病原菌检测方法能准确检出金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌和志贺菌等四种常见的肠道病原,值得在卫生应急食物中毒事故处理中推广使用。     

兔支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立及应用

目的建立一种简便、快速、敏感、特异的适用于支气管败血波氏杆菌的PCR检测方法。方法根据兔支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica）的fim2基因序列设计了一对特异性引物，进行PCR扩增、特异性和敏感性试验，并将其应用于临床样品的检测。结果利用该PCR方法扩增出425bp的目的基因片段，该产物序列与GeneBank上公布的基因序列同源性为100％。特异性试验表明，该方法对大肠埃希氏菌、多杀性巴氏杆菌、魏氏梭菌和金黄色葡萄球菌均无交叉性反应；并且最小可检出菌液浓度为3．6CPU。用该PCR方法检测了从江苏、山东等地采集的146份兔鼻拭子，结果检出支气管败血波氏杆菌阳性92例，阳性率为63．01％。结论建立了快速检测支气管败血波氏杆菌的PCR方法。     

临床PCR技术常见污染及对策

目前,我国许多城市大、中型医院已配套了PCR诊断系统,给某些疾病的快速诊断提供了方便。但根据笔者在几家医院的实地考察,医院应用PCR技术仍存在着不容忽视的污染问题: 一、样品处理时标本间的污染 在提取模板时,由于一批处理的同类可疑样品较多,稍有不慎,它们可经试管一加样器一试管的途径交叉污染而使某些阴性标本的结果出现假阳性。 二、扩增产物的污染 在进行同类样品的批量扩增时,前次扩增产物显然是下次扩增的阳性模板,如实验室布局不合理或处理不当,可经加样器或空气污染。     

荧光定量PCR技术及其应用

PCR技术是一种体外核酸扩增技术。1986年第1台PCR热循环仪的问世使PCR技术实现了操作自动化。通过PCR技术可对特定基因进行扩增,其主要应用领域是基因检测和临床基因诊断。但是,PCR技术应用于基因诊断还存在许多局限性,主要表现在不能准确定量和易产生假阳性和交叉污染等。由于传统的PCR技术只能进行定性检测,PCR技术已从传统的定性检测发展为新型的定量分析。定量PCR技术(QPCR)是PCR技术的革命性进展,它可以定量分析DNA或RNA样本的拷贝数,准确检测出样品中的基因数目,在临床实践中有着重要的意义和应用前景。通过定量PER技术能定量分析病原微生物感染的严重程度和评价药物疗效,对传染病诊断,选择药物、确定药量和疗程等有着重要指导作用。     

阴道分泌物念珠菌感染检测方法对比分析

目的 分析常规镜检、荧光PCR核酸扩增法和真菌显色培养法在阴道分泌物真菌检测结果的相关性.方法 选取2014-2016年于该院就诊的疑似阴道炎患者,收集镜检阴道分泌物真菌阳性和阴性标本各500例,用荧光PCR核酸扩增法鉴定念珠菌类型,并将100份荧光PCR核酸扩增法检测结果阳性标本进行真菌微生物培养,验证分型结果的正确率.结果 荧光PCR核酸扩增法和常规镜检一致性检验Kappa值为0.632,二者一致性差.500例患者阴道分泌物常规镜检阳性标本,荧光PCR核酸扩增法测得白色念珠菌感染382例(76.4％),光滑假丝酵母菌感染73例(14.6％),热带假丝酵母菌感染10例(2.0％),白色念珠菌合并光滑假丝酵母菌感染3例(0.6％),其他真菌感染32例(6.4％).500例患者阴道分泌物常规镜检阴性标本,荧光PCR核酸扩增法鉴定阳性共152例,其中白色念珠菌130例,光滑假丝酵母菌16例,热带假丝酵母菌6例.荧光PCR核酸扩增法与CHROMAgar快速显色法检测结果比较,差异无统计学意义(x2 =0.131,P=0.936).结论 对于有临床表现而镜检阴性的患者,建议行荧光PCR核酸扩增快速分型鉴定或真菌培养鉴定.     

尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR防污染中的应用

1.PCR“残留污染” 在PCR操作过程中,最容易出现“污染”问题,原因主要有如下几种情况:①模板的交叉污染:在样品采集或处理中,气溶胶、加样器取样时的泡沫或其他原因引起样品或模板的交叉污染,造成假阳性,属于正常DNA(由A、T、G、C四种碱基组成)引起的污染;②扩增产物的污染:在扩增过程中,将碱基T置换成U,使得扩增产物为U-     

弓形虫(Toxoplasma gondii)的PCR检测方法在笼养猕猴群中的应用

目的建立快速、灵敏、特异及检测结果易判断的PCR方法，并应用于大规模猕猴种群的弓形虫常规检测中。同时比较巢式PCR和单一PCR的一致性。方法根据弓形虫保守基因p30（SAG1）设计了内、外两对进行巢式PCR扩增以及B1基因设计一对引物进行单一PCR扩增，将DNA样本进行10倍倍比稀释，以检测巢式PCR反应的灵敏度；并对医学生物学研究所自繁猕猴共150只进行了弓形虫检测。结果巢式PCR检测法检测限度可达10^-3ng/uL，而且方法特异。两种PCR法检测结果基本一致，其中巢式PCR检测阳性率（10％）稍高于单一PCR检测阳性率（8．67％）。结论巢式PCR和一次PCR方法都可应用于猕猴弓形虫的常规检测中，并提示巢式PCR比单一PCR更敏感、检出率更高。     

PCR方法检测单核细胞增多性李斯特菌的实验研究

目的建立一种快速、简便、准确，适合于基层应用的检测鉴定Lm的方法。方法选取iap基因作为靶序列设计一对引物，用该引物对4株标准株及4株无关茵进行PCR扩增，得到进一步验证。采用PCR和常规方法同时对人工感染的牛奶进行检测鉴定。结果4株标准株获得了预期700bp左右的扩增片段，而同属的L.welshimefi、L．grayi、粪肠球菌和蜡样芽孢杆菌均没有这一特异性条带。检测人工感染牛奶20份，检出率为90％，高于传统分离培养法（60％）。结论建立的PCR法可用于单增李斯特氏菌的快速、特异、敏感诊断。     

扩增插入序列IS986检测痰中的结核杆菌

应用聚合酶链反应（PCR）技术建立了扩增结核杆菌（TB）特异重复序列IS986部分基团的方法，对7种抗酸分枝杆菌、6株非结核菌进行检测，结果仅人型结核杆菌、牛型结核杆菌及BCG扩增出245hp特异条带。用50μll％TritonX－100裂解废液中结核杆菌，而快速制备TB－PCR样品，应用此法检测了106份肺结核痰标本，总阳性事为56．6％，明显高于抗酸染色的阳性率互7．9％（P＜0．005），也高于BACTEC460TB系统培养结核杆菌阳性率44．3％．此结果表明，PCR具有较好的敏感性和特异性，可辅助结核病的早期快速诊断．     

PCR技术的新进展

聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑,以其特异性强、灵敏度高、快速、准确、重复性好等优点很快地成为临床实验诊断学的一个技术热点。目前,已广泛用于涉及到核酸的科学研究以及临床疾病的诊断和治疗监测。但十多年的临床实践表明,传统的PCR技术本身还存在着一些问题,如产物污染导致的假阳性、不能准确定量等。为了解决上述问题,使PCR技术更适用于临床检测,经国内外学者的不懈努力,目前众多PCR衍生技术和相关技术已应运而生。本文将…