结核分枝杆菌Ag85B mRNA定量检测作为化疗监测指标的初步研究

目的 探讨痰标本中结核分枝杆菌Ag85B mRNA分子作为肺结核患者化疗反应监测指标的可行性和临床价值.方法 应用定量逆转录聚合酶链反应（RT.PCR）对15例初治涂阳肺结核患者应用标准短程化疗方案治疗过程中2、4、7、14、30、60 d痰标本的结核分枝杆菌Ag85B mRNA进行系列检测,并与培养法（CFU）作比较.结果 痰标本中结核分枝杆菌Ag85B mRNA在治疗的前2 d下降明显且与CFU的下降基本一致,治疗7 d Ag85B mRNA检测阴性11例,治疗14 d阴性的12例,治疗30 d除1例阳性外,其余均为阴性,治疗60 d时全部阴性.结论 结核分枝杆菌Ag85B mRNA在接受治疗的肺结核患者的痰标中快速下降,是活菌数量下降的反映,痰标本中mRNA的变化可作为快速评价化疗反应的分子指标.     

结核分枝杆菌Ag85B mRNA定量检测作为化疗监测指标的初步研究

目的探讨痰标本中结核分枝杆菌Ag85BmRNA分子作为肺结核患者化疗反应监测指标的可行性和临床价值。方法应用定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）对15例初治涂阳肺结核患者应用标准短程化疗方案治疗过程中2、4、7、14、30、60d痰标本的结核分枝杆菌Ag85BmRNA进行系列检测，并与培养法（CFU）作比较。结果痰标本中结核分枝杆菌Ag85BmRNA在治疗的前2d下降明显且与CFU的下降基本一致，治疗7dAgS5BmRNA检测阴性11例，治疗14d阴性的12例。治疗30d除1例阳性外，其余朝为阴性，治疗60d时全部阴性。结论结核分枝杆菌Ag85BmRNA在接受治疗的肺结核患者的痰标中快速下降，是活菌数量下降的反映，痰标本中mRNA的变化可作为快速评价化疗反应的分子指标．     

PCR-SSCP技术快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%。结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。     

rDNA探针杂交检测病人痰标本中结核杆菌的研究

目的 应用结核分枝杆菌特异的rDNA探针杂交检测痰标本中的结核杆菌rDNA,评价其在临床标本检测中的应用价值。方法 用引物b对结核分枝杆菌16S-23SrDNA间隔区序列进行扩增,同时加入生物素标记,制成250bp的rDNA探针。对该探针的敏感性、特异性进行了研究,并对90份结核病人,30份非结核病人痰标本的PCR产物进行了斑点杂交检测。结果 rDNA探针检测引物bPCR扩增产物的敏感性为100pg。rDNA探针与受试24种分枝杆菌和11种非分枝杆菌引物bPCR扩增产物杂交只有结核分枝杆菌、胃分枝杆菌为阳性杂交,特异性较高。而rDNA探针对90份结核病人痰标本引物b扩增产物检测的阳性率为80.2%,高于PCR扩增产物电泳检测结果 (64%)。rDNA探针与30份非结核病人痰标本杂交结果均为阴性杂交。结论 rDNA探针与引物bPCR扩增相结合能提高结核病人痰标本检测的敏感性与特异性。     

PCR－SSCP技术快速检测结核分枝杆菌 rpoB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%。结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。     

应用蛋白芯片技术快速诊断肺结核病的研究

目的评价结核分枝杆菌蛋白芯片在检测临床标本中结核分枝杆菌抗体的应用价值。方法应用结核分枝杆菌蛋白芯片检测117例结核病患者的血清标本、103例肺部其他疾病患者和健康人的血清标本,并与痰涂片镜检法相比较。结果在菌阳肺结核、菌阴肺结核中,结核分枝杆菌抗体芯片检测的阳性率分别是100%(26/26)、49.6%(45/91),在肺部其他疾病患者和健康人中,结核分枝杆菌抗体芯片检测的阴性率是98.1%(101/103)。结论结核分枝杆菌抗体检测蛋白芯片是一种集基因工程技术、芯片技术和免疫学技术的检测一体化的新型结核病快速诊断方法,具有简便、快速、大量、敏感性高和特异性强、检测成本较低的特点,是结核病、尤其是菌阴结核病辅助诊断的有效方法。     

初治空洞肺结核54例临床分析

目的　探讨初治空洞性肺结核的临床特点及短程化疗效果。方法 回顾性分析54例初治空洞性肺结核的临床资料。结果 54例患者中发热49例,咳嗽50例,乏力、盗汗32例,白细胞总数升高40例,痰涂片结核菌阳性17例。X线胸片表现为单发、薄壁、干酪性空洞46例,病变累及3个以上肺野40例。完成6个月化疗后,病程10～30d者空洞治疗有效率77.8%(28/36),病程30～60d者空洞治疗有效率44.4%(8/18)。结论 初治空洞肺结核多有典型的结核中毒症状,X线胸片以单发、薄壁、干酪性空洞为主,病变累及多个肺野,早期治疗有利于空洞吸收。     

难治性肺结核的外科治疗

目的　探讨外科治疗难治性肺结核的效果及方法。方法 对 1996～1998年收治的96例进行手术治疗的难治性肺结核病人进行回顾分析。结果 在应用氟嗪酸方案治疗有效的同时行外科治疗,93.8%术后痰菌持续阴转,且随访两年无复发;5.2%术后继续化疗痰菌阴转;1.0%痰菌持续阳性。结论 应用氟嗪酸方案化疗的同时手术切除病灶,是一种有效的根治难治性肺结核的方法。     

95例活动性肺结核免疫检测结果分析

目的　探讨活动性肺结核患者体液免疫与细胞免疫之间的相关性。方法 对95例活动性肺结核患者进行血清T淋巴细胞亚群以及结核抗体的测定,同时做结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)试验。结果 与阴性患者比较,痰菌阳性患者血清结核抗体及PPD试验的阳性率显著升高。而T细胞亚群变化与痰菌关系不大。血清结核抗体阳性者,T细胞亚群异常率升高。当PPD呈较强反应时,T细胞亚群正常的概率高。结论 T细胞亚群的检测能间接了解结核抗体及PPD试验的变化,反映机体的免疫状况。     

荧光定量PCR测定支气管肺泡灌洗液中TbDNA对涂阴肺结核的诊断价值

目的探讨纤支镜肺泡灌洗液中结核分枝杆菌DNA在涂阴肺结核诊断中的价值。方法应用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）技术对300例涂阴肺结核,178例菌阳肺结核及119例肺炎或肺癌患者的纤支镜肺泡灌洗液标本进行结核分枝杆菌DNA检测。结果3种病因肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA阳性检出率分别为：74.3%（223/300）、94.9%（169/178）、17.6%（21/119）。结论荧光定量聚合酶链反应检测肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA,用于肺结核诊断可提高肺结核诊断的敏感性和准确性,明显优于痰抗酸染色,亦较痰结核菌培养诊断灵敏、快速,可作为肺结核诊断较可靠指标。     

Measurement of sputum Mycobacterium tuberculosis messenger RNA as a surrogate for response to chemotherapy.

Effective treatment regimens for pulmonary tuberculosis are difficult to assess because of the slow growth rate of Mycobacterium tuberculosis in culture and its protracted clearance from sputum. A rapid method that reflects effective antimicrobial activity would markedly advance evaluation of treatment and promote the assessment of new antituberculosis drugs. Conventional methods measure the progressive reduction of numbers of acid-fast bacilli in the sputum smear and the clearance of organisms in sputum culture. In this study, we measured levels of M. tuberculosis 85B (alpha antigen) messenger RNA (mRNA), 16S ribosomal RNA (rRNA), and IS6110 DNA in patients' sputa to ascertain whether they could serve as potential surrogate markers of response to chemotherapy. Sputum specimens were sequentially collected for up to a year from 19 smear-positive pulmonary tuberculosis patients receiving an optimal drug treatment regimen. Nucleic acids were isolated from these specimens, and two M. tuberculosis molecular targets (mRNA, DNA) were quantified, using the ABI Prism 7700 Sequence Detection System. The Mycobacterium genus-specific 16S rRNA was quantified with a limiting dilution RT-PCR assay. Results show that levels of 85B mRNA declined after initiation of therapy, as did viable M. tuberculosis colony counts, with 90% of patients becoming negative for both markers after 2 mo of treatment. The rapid disappearance of M. tuberculosis mRNA from sputum suggests that it is a good indicator of microbial viability and a useful marker for rapid assessment of response to chemotherapy.     

Ag85A/B嵌合DNA疫苗治疗小鼠敏感结核病疗效的实验研究

目的研究结核分枝杆菌Ag85A/B嵌合DNA疫苗治疗小鼠敏感结核病的效果。方法用结核分枝杆菌标准株H37Rv尾静脉注射50只雌性BALB/c小鼠后,将小鼠随机均匀地分为5组,感染后第3 d开始,分别用生理盐水(A组)、pVAX1载体(B组)、利福平(C组)、草分枝杆菌F.U.36注射液(D组)、Ag85A/B嵌合DNA疫苗(E组)治疗,每2周肌肉注射1次DNA疫苗,共3次。在治疗结束后2周,杀鼠,取小鼠肺和脾观察病理改变、称取重量、做菌落计数。结果与A组比较,D组、E组肺脏病变有不同程度减轻,病变局限,3/5区域肺泡结构完整,清晰,细胞分布均匀。与A组相比,C、D、E组肺脏菌落数依次减少2.11 log、0.76 log、0.81 log;肝脏菌落数依次减少2.11 log、0.74 log、1.11 logs(P0.01)。结论 Ag85A/B嵌合DNA对小鼠敏感结核病具有较好的治疗效果。     

DNA疫苗治疗小鼠耐多药结核病的研究

目的研究结核分枝杆菌DNA 疫苗治疗小鼠耐多药结核病的效果。方法用结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼临床分离株HB361尾静脉注射60只雌性BALB/c小鼠后,将小鼠随机均匀地分为6组,感染后第3d开始,分别用生理盐水（A组）、pVAX1载体（B组）、利福平（C组）、HSP65 DNA疫苗（D组）、Ag85A DNA 疫苗（E组）、Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗（F组）治疗60d,DNA疫苗每隔15d肌肉注射1次,共5次。治疗结束后3周,分别取肺和脾观察病理改变、称取重量、做菌落计数。结果治疗结束后3周,与对照组比较,D组、E组和F组肺脏病变有不同程度减轻,病变局限,2/3区域可见正常的肺泡结构,肺泡轮廓相对清晰,细胞分布均匀。与A组相比,D组、E组和F组肺脏菌落数分别减少了0.34、0.50 和0.26 logs;脾脏菌落数依次减少了0.37、0.46 和0.28 logs（P<0.05,P<0.01）。结论Ag85A DNA 疫苗治疗小鼠耐多药结核病效果优于HSP65 DNA和Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗。     

新疆地区结核分枝杆菌北京/W系和非北京/W系间五种重要蛋白表达差异的初步研究

目的 检测北京/W系和非北京/W系结核分枝杆菌HspX、Hsp65、38kDa、Ag85B和MPT64在基因、mRNA和蛋白水平有无差异,探讨5个重要蛋白对于北京/W系菌株广泛流行的可能作用。方法 收集结核分枝杆菌临床分离株,其中北京/W系与非北京/W系菌株各30株,运用DNA直接测序法检测北京/W系和非北京/W系菌株HspX、Hsp65、38 kDa、Ag85B和MPT64对应编码基因的PCR扩增产物,采用实时定量PCR技术检测细菌在对数生长期5个重要蛋白的编码基因mRNA的表达水平,使用Western blot技术检测细菌感染巨噬细胞24 h后5个蛋白在不同菌株中的表达水平。结果统计分析采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果 HspX、Hsp65、38kDa、Ag85B和MPT64对应编码基因的PCR扩增产物测序均未发现突变。HspX、Hsp65在北京/W系菌株中的mRNA在对数生长期的表达差异均无统计学意义(P>0.05),而在感染巨噬细胞24 h后,细菌中两个热休克蛋白的表达高于非北京/W系菌株,差异有统计学意义(P<0.05)。在细菌感染细胞前后,北京/W系菌株中38 kDa、Ag85B的mRNA和蛋白水平的表达均低于非北京/W系菌株,差异有统计学意义(P<0.05)。MPT64在mRNA和蛋白水平的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 与非北京/W系菌株比较,北京/W系菌株中HspX、Hsp65高表达,38 kDa、Ag85B表达较低,推测这几个蛋白表达的改变可能与北京/W系菌株的流行有一定的关系。     

Ag85B核酸疫苗的免疫原性和保护性研究

扩增结核分枝杆菌的Ag85B基因并克隆于真核表达载体 pJW4 30 4 ,转染COS - 7细胞后 ,Westernblot检测表明该基因在细胞内得到了正确表达。用该质粒免疫C5 7BL/ 6小鼠 ,免疫三次后 ,用纯化的重组蛋白Ag85B检测小鼠血清中的抗体 ,抗体滴度达到 1:10 2 4 0 0 ,(γ -干扰素测定表明 ,免疫动物的干扰素含量达到 116 0 3± 10 4 pg /ml。实验结果说明Ag85B核酸疫苗在实验动物体内引起了较强的免疫应答。三次免疫后经静脉强毒攻击 ,免疫组小鼠肺脏和脾脏的细菌数比对照空载体组分别减少了 1 5和 15倍以上。本研究表明 ,该核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞和体液免疫应答并获得较高的保护效率。     

结核分枝杆菌DNA三价苗的细胞与体液应答研究

本文构建了含分枝杆菌抗原Ag85B(30kDa) ,MPT - 83(2 6kDa)和ESAT - 6 (6kDa)分泌蛋白的真核表达载体pJW 4 30 3,酶切鉴定和序列分析 ,确定含有正确的读码框。重组表达质粒导入COS7细胞内并瞬时表达 ,证明上述三种重组质粒能在COS7细胞中表达出特异蛋白。三种重组表达质粒同时肌注免疫小鼠 ,首免 ,二免和三免小鼠后 2 1dAg85B抗体平均滴度分别为 1∶32 0 0 ,1∶5 12 0 0和 1∶10 2 4 0 0 ,MPT - 83抗体平均滴度二次免疫和三次免疫后 2 1d测得为 1∶2 5和 1∶5 0 ,三次免疫后均未检测到ESAT - 6特异性抗体。在三免后 2 1dAg85B和MPT - 83的特异性细胞因子γ -干扰素的浓度分别 2 75 pg/ml±16 5 ,2 2 0 pg/ml± 19 8;而ESAT - 6的γ -干扰素浓度为 2 2 0 pg/ml± 9 9。本研究表明 ,多价核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答 ,可能有利于增强疫苗对抗结核病的抗性。     

Lung and blood mononuclear cell responses of tuberculosis patients to mycobacterial proteins.

The differences in specificity of human lung and peripheral lymphocytes for mycobacterial antigens (Ag) need to be evaluated in order to identify vaccine candidates against pulmonary tuberculosis (TB). Therefore, the present study examined the response to low molecular weight secretory proteins of Mycobacterium tuberculosis in bronchoalveolar lavage (BAL) and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from minimal pulmonary TB and non-TB patients. Ag85A, Ag85B, culture filtrate protein (CFP)-31, CFP-22.5, CFP-21, M. tuberculosis protein-64 and an as yet uncharacterised 19 kDa protein were found to be predominantly recognised by BAL cells of TB patients on the basis of lymphocyte proliferation and significant interferon-gamma release. However, recognition of CFP-8, 6-kDa early secreted antigenic target, CFP-10, CFP-14.5, M. tuberculosis secretory protein-17 and five other as yet uncharacterised low molecular weight polypeptides was found to be high on the basis of lymphocyte proliferation at the level of PBMCs. Furthermore, BAL macrophages, and not blood monocytes, were found to produce nitric oxide (NO) in response to mycobacterial Ags. Among polypeptides predominantly recognised by BAL lymphocytes, only Ag85A and Ag85B were found to induce both NO and interleukin-12 (p40) by alveolar macrophages. In conclusion, the present results indicate heterogeneity in antigen recognition by bronchoalveolar lavage cells and peripheral mononuclear blood cells of minimal tuberculosis patients, and also suggest the utility of antigen 85 complex polypeptides for the development of a future mucosal antituberculous vaccine.     

Prior BCG vaccination improves survival of Gambian patients treated for pulmonary tuberculosis

The protection provided by BCG against pulmonary tuberculosis ranges from nil to over 90%. While BCG protects against the more serious forms of tuberculosis, it is not known whether or not it protects patients with pulmonary tuberculosis from death. In a study designed to look at the effects of immunotherapy with M. vaccae as an adjunct to chemotherapy in 285 adult Gambian patients treated for proven pulmonary tuberculosis, we examined the association between the presence or absence of a BCG scar and mortality. The data showed that subjects who had a BCG scar were significantly younger than those who did not, and were less likely to have nutritional oedema. During the course of treatment, none of the 85 patients who had a BCG scar died compared to 35 of 200 patients (17.5%) who did not (P < 0.001). In these Gambian patients with pulmonary tuberculosis, prior vaccination with BCG may have provided substantial protection against death. However, there is the possibility that this finding is the result of confounding by other factors or has arisen from bias. Researchers with similar data need to investigate this question as this association, if true, could have major implications for BCG vaccination.