动物模型中人骨形态发生蛋白2重组腺病毒活性观测

目的：利用基因工程技术构建人骨形态发生蛋白2重组腺病毒，并进行体内表达，测定活性；为深入开展的基因治疗研究创造条件。方法：实验于2000—05／2002—06在西安交通大学第一附属医院骨科实验室完成。应用PcR技术扩增出人骨形态发生蛋白2全长基因，体外同源重组构建重组腺病毒后，随机将30只SD大鼠分为治疗组和对照组，每组15只，将纯化后的重组腺病毒50μL注入sD大鼠股部肌肉陷窝病损处，通过组织学染色、X射线片对动物模型的组织变化进行观测。结果：6周后治疗组可见明显骨诱导形成，2周时治疗组碱性磷酸酶活性明显高于对照组，重组腺病毒治疗组有明显的诱导成骨活性。结论：应用于动物实验中目的基因表达，并具有生物学活性。本研究是在骨缺损基因治疗的一次尝试，且人骨形态发生蛋白2重组腺病毒的构建成功，也为国内骨科疾病基因治疗的进一步研究提供了基础。     

人骨形态发生蛋白7重组腺病毒的构建及鉴定

目的：采用多聚酶链反应及酶切鉴定，拟构建人骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体，以便利用局部基因治疗方法进一步在体内获得重组人骨形态发生蛋白7。 方法：实验于2004-05／2005-10在解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所完成。含人骨形态发生蛋白7基因全长cDNA质粒pUC118．BMP-7由第一作者构建并保存。将人骨形态发生蛋白7基因克隆至pcDNA3．1／CT-GFP质粒中。酶切回收的BMP-7／GFP基因片段，克隆人pAxCAwt腺病毒载体后，共转染大肠杆菌LE393，获得腺病毒重组质粒，大量扩增后转入293细胞包装，获得重组腺病毒。用病毒上清液感染293细胞及Hela细胞，293细胞受病毒感染而Hela细胞无明显病毒感染现象的克隆初步判定为重组腺病毒株。 结果：①骨形态发生蛋白7基因的获得：KpnI及XbaI双酶切、琼脂凝胶电泳检测可见2条带，略小于500bp的条带是长度为430bp的骨形态发生蛋白7基因，略大于2500bp的条带是长度约为2600bp的pUC118。②重组质粒pcDNA3．1BMP-7／GFP的构建：所挑选的5个转化子均可见略大于1000bp的条带，全部为阳性克隆。③重组粘粒pAxCAwT．BMP-7．GFP的构建：所挑选的5个转化子中2个可见大于1000bp的条带，为正向插入的阳性克隆。 结论：多聚酶链反应及酶切鉴定证明骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体的成功构建，并包装出重组腺病毒，为骨损伤疾病进行原位组织工程修复奠定基础。     

人骨形态发生蛋白7重组腺病毒的构建及鉴定

目的:采用多聚酶链反应及酶切鉴定,拟构建人骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体,以便利用局部基因治疗方法进一步在体内获得重组人骨形态发生蛋白7。方法:实验于2004-05/2005-10在解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所完成。含人骨形态发生蛋白7基因全长cDNA质粒pUC118.BMP-7由第一作者构建并保存。将人骨形态发生蛋白7基因克隆至pcDNA3.1/CT-GFP质粒中,酶切回收的BMP-7/GFP基因片段,克隆入pAxCAwt腺病毒载体后,共转染大肠杆菌LE393,获得腺病毒重组质粒,大量扩增后转入293细胞包装,获得重组腺病毒。用病毒上清液感染293细胞及Hela细胞,293细胞受病毒感染而Hela细胞无明显病毒感染现象的克隆初步判定为重组腺病毒株。结果:①骨形态发生蛋白7基因的获得:KpnI及XbaI双酶切、琼脂凝胶电泳检测可见2条带,略小于500bp的条带是长度为430bp的骨形态发生蛋白7基因,略大于2500bp的条带是长度约为2600bp的pUC118。②重组质粒pcDNA3.1BMP-7/GFP的构建:所挑选的5个转化子均可见略大于1000bp的条带,全部为阳性克隆。③重组粘粒pAxCAwT.BMP-7.GFP的构建:所挑选的5个转化子中2个可见大于1000bp的条带,为正向插入的阳性克隆。结论:多聚酶链反应及酶切鉴定证明骨形态发生蛋白7重组腺病毒载体的成功构建,并包装出重组腺病毒,为骨损伤疾病进行原位组织工程修复奠定基础。     

三种不同载体对重组人骨形态发生蛋白2诱导成骨的放大效应

目的：比较牛松质骨粒、磷酸三钙、天然珊瑚载体对重组人骨形态发生蛋白2诱导成骨的放大效应。方法：实验于1998-12／2002—06在第四军医大学骨科实验室完成。①重组人骨形态发生蛋白2与牛松质骨粒、天然珊瑚和磷酸三钙按相同比例复合形成3种载体释放系统。②取昆明小鼠90只，随机分为3组，牛松质骨粒组、天然珊瑚组和磷酸三钙组，每组30只。于小鼠股部肌袋一侧植入重组人骨形态发生蛋白2载体释放系统，另一侧单纯植入0．2mg重组人骨形态发生蛋白2。③分别于植入后7，14，21d周麻醉状态下每组各处死10只，取材行组织学检查、成骨量分析和碱性磷酸酶活性测定。结果：90只小鼠全部进入结果分析。①组织学检查术后不同时间牛松质骨粒组和磷酸三钙组成软骨和成骨能力较强，而天然珊瑚组成骨能力稍差。21d的成骨量分析显示牛松质骨粒组、磷酸三钙组和天然珊瑚组分别较对照组成骨量放大了5．47倍、4．90倍和1，65倍。②牛松质骨粒组、磷酸三钙组之间碱性磷酸酶活性没有显著差异（P〉0．05），均显著大于天然珊瑚组（P〈0．05），3组的碱性磷酸酶活性高峰出现在术后第21天[依次为（285．09&;#177;52．29），（256．48&;#177;45．99），（177．92&;#177;22．69）nkat／g]。结论：比较3种不同的重组人骨形态发生蛋白2载体释放系统。异种松质骨粒表现较强的成骨能力，提出载体放大效应应成为重组人骨形态发生蛋白2载体选择标准之一。     

三种不同载体对重组人骨形态发生蛋白2诱导成骨的放大效应

目的:比较牛松质骨粒、磷酸三钙、天然珊瑚载体对重组人骨形态发生蛋白2诱导成骨的放大效应。方法:实验于1998-12/2002-06在第四军医大学骨科实验室完成。①重组人骨形态发生蛋白2与牛松质骨粒、天然珊瑚和磷酸三钙按相同比例复合形成3种载体释放系统。②取昆明小鼠90只,随机分为3组,牛松质骨粒组、天然珊瑚组和磷酸三钙组,每组30只。于小鼠股部肌袋一侧植入重组人骨形态发生蛋白2载体释放系统,另一侧单纯植入0.2mg重组人骨形态发生蛋白2。③分别于植入后7,14,21d周麻醉状态下每组各处死10只,取材行组织学检查、成骨量分析和碱性磷酸酶活性测定。结果:90只小鼠全部进入结果分析。①组织学检查术后不同时间牛松质骨粒组和磷酸三钙组成软骨和成骨能力较强,而天然珊瑚组成骨能力稍差。21d的成骨量分析显示牛松质骨粒组、磷酸三钙组和天然珊瑚组分别较对照组成骨量放大了5.47倍、4.90倍和1.65倍。②牛松质骨粒组、磷酸三钙组之间碱性磷酸酶活性没有显著差异(P>0.05),均显著大于天然珊瑚组(P<0.05),3组的碱性磷酸酶活性高峰出现在术后第21天犤依次为(285.09±52.29),(256.48±45.99),(177.92±22.69)nkat/g犦。结论:比较3种不同的重组人骨形态发生蛋白2载体释放系统,异种松质骨粒表现较强的成骨能力,提出载体放大效应应成为重组人骨形态发生蛋白2载体选择标准之一。     

重组人骨形态发生蛋白7腺病毒载体构建及在小鼠成肌细胞中的表达

目的：构建重组人骨形态发生蛋白7的腺病毒载体(AdBMP7)，并观察其在小鼠成肌细胞C2C12细胞中的表达情况。方法：实验于2004—05／10在北京大学医学部完成。RT-PCR方法从HKE293细胞中克隆出hBMP7 cDNA并亚克隆人穿梭质粒pAdtraekcmv中，构建pAdtrackcmv-hBMP7质粒。该质粒和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组后挑选阳性重组体pAd—hBMP7质粒。线性化pAd-hBMP7质粒转染293A细胞后检测病毒噬斑形成情况，并于转染后9d收获病毒，大量扩增并制备高纯度、高滴度的AdBMP7。将AdBMP7按MOI=100来感染C2C12细胞，48h后分别应用RT-PCR和免疫组化方法来检测hBMP7在mRNA和蛋白水平的表达。结果：成功克隆出hBMP7 cDNA，酶切鉴定pAdtraekcmv-hBMP7和pAd-hBMP7质粒正确重组，获得纯化后滴度达到5&;#215;10^12vp／mL的AdBMP7。AdBMP7能有效感染C2C12细胞并表达hBMP7蛋白。结论：应用AdEasy-1腺病毒载体系统可在短期内制备高滴度的携带GFP和hBMP7的重组腺病毒AdBMP7，并在为进一步研究BMP7基因治疗促进骨愈合打下基础。     

自体骨膜包绕肌腱复合人重组骨形态发生蛋白-2替代月骨的实验研究

目的：研究用自体骨膜包裹肌腱复合人重组骨形态发生蛋白-2(dHBMP-2)植入物替代月骨治疗Kienbock’s病的可行性。方法：选新西兰白兔45只，按每组15只随机分为骨膜组、rhBMP-2复合体组和对照组。将3种植人物分别植入兔膝关节腔内，术后1，3，6，12和16周时取材，组织学观察骨形成并测量骨密度值(BMD)。结果：rHBMP-2组骨和软骨形成比骨膜组明显；对照组呈玻璃样变性，无骨形成。标本BMD值经统计学分析，骨膜组、rhBMP-2组和对照组间差异有非常显著性意义(P&;lt;0．01)。结论：在骨膜和rhBMP-2诱导因子作用下rhBMP-2复合体组骨形成较强，在较短时间内形成大量骨和软骨，可用作月骨替代物。     

重组人骨形态发生蛋白2与胶原膜复合引导骨再生的特性

目的:探讨重组人骨形态发生蛋白2与胶原膜复合后的生物可吸收性促骨生成膜对修复下颌骨缺损引导骨再生愈合过程的作用及其机制。方法:实验于2005-10/2006-06在南方医科大学珠江医院神经外科实验室完成。①制备重组人骨形态发生蛋白2与胶原膜复合物:将6mg的重组人骨形态发生蛋白2溶于尿素溶液,将胶原膜浸于其中,用蒸馏水透析48h,制备复合膜12等份,每份约含骨形态发生蛋白0.75mg,经环氧乙烷消毒备用。②建立兔双侧下颌骨缺损模型:取兔12只,采用Stryker-TPS微型骨科动力系统于双侧下颌骨体部下缘各造成1.5cm×1.0cm的骨缺损。一侧缺损处覆盖1.4cm×1.4cm复合骨生长刺激因子骨形态发生蛋白的生物可吸收性促骨生成膜为实验组,另一侧未放生物可吸收性促骨生成膜为空白对照组。③于1,4,12,24周处死动物,进行标本X射线、组织学观察,并采用半自动图像数字化分析仪测量标本骨密度,比较两组缺损周围骨质形成的情况。结果:①两组标本组织学观察:4周时实验组缺损边缘与生物可吸收性促骨生成膜之间隙可见大量新生骨,而空白对照组见大量纤维结缔组织,仅见少量新生骨。12周时两者缺损边缘侧已无明显区别,实验组几乎未见生物可吸收性促骨生成膜残留,空白对照组近中心部新生骨仍明显少于实验组。②两组骨密度测量结果:4周实验组骨密度高于空白对照组[(19.8±1.5),(16.9±1.4),P<0.01];12周实验组近中心部骨密度高于空白对照组[(21.6±1.3),(20.7±0.8),P<0.05],24周二者之间的差异无显著性(P>0.05)。③实验组超微结构观察:术后12周实验组扫描电镜示新生骨小梁呈“蜂窝状”。结论:复合骨生长刺激因子骨形态发生蛋白的生物可吸收性促骨生成膜对于诱导新骨形成,防止软组织长入,促进骨缺损早期愈合有明显的作用,具有促进缺损骨质形成的功能。     

骨形态发生蛋白2在骨修复中的应用

目的：回顾分析近年来国内外有关骨形态发生蛋白2在骨修复中应用的研究近况。 资料来源：应用计算机检索Medline1999-01／2005-06相关骨形态发生蛋白2的文献，检索词“bone morphogenetic protein-2．bone tissue engineering，gene therapy”并限定文献语言种类为English。同时计算机检索CNKI中文数据库1999-01／2005-06相关骨形态发生蛋白2的文献，检索词为“骨形态发生蛋白2，骨组织工程，基因治疗”。并限定文献语言种类为中文。 资料选择：对资料进行初审，选出包含研究目的的文献，筛选与目的有关的文献。纳入标准：①骨修复与骨组织工程。②骨形态发生蛋白2。排除标准：①文献中重复研究和综述文章。②Meta分析类文章。资料提炼：共收集到中文文献67篇，英文文献55篇，另有英文摘要近百篇。符合标准的文章15篇。排除的文献多为重复研究或非骨组织工程研究。 资料综合：骨形态发生蛋白2可诱导间充质细胞分化为成骨细胞和成软骨细胞而促进新骨形成，并具有强大的异位成骨作用。载体或基因释放的骨形态发生蛋白2可有效修复骨缺损。骨形态发生蛋白2的基因治疗研究为修复骨缺损提供了新途经。 结论：应用骨形态发生蛋白2修复骨缺损是肯定可行的，但方法有待进一步研究。     

骨缺损再生修复中人骨形成蛋白2基因的克隆和序列分析

目的克隆人骨形成蛋白 2 (hBMP2)基因全长,用于临床难治性骨折和骨缺损的再生修复.方法以成骨肉瘤细胞总 RNA为模板,应用反转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)克隆 hBMP2的 cDNA全长;将获得的基因插入 pGEM-T-Easy载体质粒,并转化至大肠杆菌后挑选阳性克隆,利用限制性内切酶酶切分析鉴定重组质粒.结果通过质粒酶切分析和序列测定,获得的基因为 hBMP2全长 DNA序列.结论克隆获得 hBMP2的基因,为其进一步开发利用提供了前提条件.     

重组人骨形态发生蛋白2诱导骨修复的应用及前景

背景：重组人骨形态发生蛋白2具备诱导成骨时间更早、成骨量较天然骨形态发生蛋白2多、生物学活性好、生物相容性好、成本低等特点,已成为近年来临床骨科创伤疾病防治研究的热点。目的：总结重组人骨形态发生蛋自2在骨组织工程及骨修复领域应用中的优势、不足及目前国内外的研究进展。方法：经第一作者检索CNKI数据库及SPRINGERLINK数据库2005至2011年与重组人骨形态发生蛋白2在诱导骨再生、骨组织修复有关研究进展方面的文献,英文检索词为“rhBMP-2,bonetissueengineering,bone repair materials”,中文检索词为“重组人骨形态发生蛋白2,骨组织工程,骨修复”。共检索出98篇,最终保留30篇进行归纳总结。结果与结论：骨骼内天然骨形态发生蛋白2含量稀少、提取成本高昂,临床应用严重受限。重组人骨形态发生蛋白2有显著的成骨诱导能力,在骨组织工程及骨修复领域展现了巨大的潜在应用价值。体外试验无细胞毒性具有良好的生物相容性可供临床应用,其中重组人骨形态发生蛋白2和重组人骨形态发生蛋白7现已被应用于外科整形手术诱导骨再生,但由于重组人骨形态发生蛋白2是外源性细胞生长因子,临床应用多为超生理剂量,故潜在有软组织水肿,皮肤红疹、局部炎症反应、异位骨化和免疫反应等不良后果的危险,所以重组人骨形态发生蛋白2用于人体后的安全性研究还须长期密切关注。找到理想的载体,有效控制其在体内缓释是重组人骨形态发生蛋白2应用研究的关键问题。     

人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒的构建与鉴定

背景:骨形态发生蛋白2是诱导成骨关键物质,参与调节从细胞增殖、决定种系分化方向到细胞死亡等一系列的生物过程。目的:利用AdMax系统构建人骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法:以人cDNA为模板PCR扩增人骨形态发生蛋白2基因,转化E.coli感受态细胞,经菌落PCR鉴定阳性转化子、阳性克隆测序无误后,扩增、抽提。将带有目的基因的腺病毒表达载体和携带有腺病毒大部分基因的辅助包装质粒共转染293细胞进行病毒包装扩增,PCR检测目的基因、Western Blot检测目的蛋白及终点稀释法检测病毒滴度。结果与结论:PCR获得长度为1223bp的人骨形态发生蛋白2目的基因片段,同源重组表达载体经阳性克隆PCR及测序鉴定,结果正确。293细胞内包装、扩增,经Westernblot及PCR鉴定无误后,获得病毒滴度为5×1013pfu/L的重组腺病毒。实验成功构建携带有人骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒载体。     

人骨形成蛋白2基因成骨诱导作用研究

目的：制备一种具有成骨活性的生物材料。方法：将人BMP2-pcDNA3．1质粒添加到壳聚糖-胶原海绵支架材料中，然后将大鼠成骨细胞和成纤维细胞分别接种在该复合材料中，体外培养细胞-支架材料复合物．另外将该材料植入BALBc小鼠皮下，以添加了pcDNA3．1质粒的壳聚糖-胶原海绵支架材料为对照。10天以后．取出细胞-支架材料复合物和皮下植入物，分别检测样品的碱性磷酸酶活性和钙含量。结果：与对照相比，体外培养细胞-支架材料复合物中的碱性磷酸酶活性和钙含量均显著提高；小鼠皮下植入物的碱性磷酸酶活性和钙含量也分别提高了61．5％和16．2％。结论：添加了人骨形成蛋白2基因的壳聚糖-胶原海绵支架材料具有成骨诱导活性，这种材料为骨组织工程中的成骨诱导可能提供一种新的方法。     

基因重组人骨形成蛋白2生物学活性及其复合异种骨体内异位植入的成骨活性

目的:观察复合基因重组人骨形成蛋白2异种骨的成骨活性及其量效关系。方法:实验于2001-07/2002-05在安徽医科大学完成。以基因重组人骨形成蛋白-2与去抗原部分脱钙牛松质骨载体复合,制成复合基因重组人骨形成蛋白2的异种骨(基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨)植入小鼠右股部肌袋内。将6周龄雄性BALB/C小鼠144只,随机分成4组,植入含0.4m g基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组;植入含0.1mg基因重组人骨形成蛋白-2/脱钙牛松质骨骨粒组,单纯植入脱钙牛松质骨载体骨粒组,单纯植入基因重组人骨形成蛋白2组,每组36只。术后7,14,21d取材,通过大体观察、X射线影像学、组织学和骨计量学方法检测各组的诱导成骨活性。结果:144只实验动物在实验过程中无死亡,全部进入结果分析。①单纯植入基因重组人骨形成蛋白2组于光镜下见大量间充质细胞增殖,局部软骨组织生成,软骨细胞成熟。②脱钙牛松质骨与基因重组人骨形成蛋白2复合后,小牛骨松质结合基因重组人骨形成蛋白2呈实体性疏松绒毛结构,骨松质孔洞内填充云絮状基因重组人骨形成蛋白2物质,两者结合良好。③各组术后不同时间组织学检查结果为:植入含0.4mg基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组术后7d出现软骨分化的小鼠有5只,苏木精-伊红染色观察,标本大量间充质细胞被诱导分化为软骨细胞,14d有4只出现新骨诱导的现象,出现多处分散的骨软骨组织,多发生于植骨周围,21d见散在软骨岛和稀疏退变小软骨岛,部分小鼠有新骨形成,但无骨髓及板层骨形成。植入含0.1m g基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组术后7d出现软骨分化的小鼠有3只,见少量间充质细胞被诱导分化为软骨细胞,有零星的间充质细胞分化、过渡为软骨细胞;14d有部分标本可见骨及软骨组织,有的可见稀疏小软骨岛存在,21d有4只出现新骨诱导。单纯植入脱钙牛松质骨载体骨粒组主要表现为纤维结缔组织包绕植骨,植骨周围见组织细胞增生。单纯植入基因重组人骨形成蛋白2组以肌纤维为主,无典型软骨细胞出现。表现为正常横纹肌切面和肌间隔结构。④术后不同时间植入含0.4m g基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组和植入含0.1m g基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组的碱性磷酸酶活性和钙含量均高于对照组,前者高于后者,具有统计学意义(P<0.05)。结论:①基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨是高效诱导成骨材料,经处理的小牛松质骨是良好的缓释载体,提高了基因重组人骨形成蛋白2的骨诱导能力。②复合基因重组人骨形成蛋白2异种骨的成骨活性与基因重组人骨形成蛋白2的含量成正比。     

基因重组人骨形成蛋白2生物学活性及其复合异种骨体内异位植入的成骨活性

目的：观察复合基因重组人骨形成蛋白2异种骨的成骨活性及其量效关系.方法：实验于2001-07/2002-05在安徽医科大学完成.以基因重组人骨形成蛋白-2与去抗原部分脱钙牛松质骨载体复合,制成复合基因重组人骨形成蛋白2的异种骨（基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨）植入小鼠右股部肌袋内.将6周龄雄性BALB/C小鼠144只,随机分成4组,植入含0.4 mg基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组;植入含0.1 mg基因重组人骨形成蛋白-2/脱钙牛松质骨骨粒组,单纯植入脱钙牛松质骨载体骨粒组,单纯植入基因重组人骨形成蛋白2组,每组36只.术后7,14,21 d取材,通过大体观察、X射线影像学、组织学和骨计量学方法检测各组的诱导成骨活性.结果：144只实验动物在实验过程中无死亡,全部进入结果分析.①单纯植入基因重组人骨形成蛋白2组于光镜下见大量间充质细胞增殖,局部软骨组织生成,软骨细胞成熟.②脱钙牛松质骨与基因重组人骨形成蛋白2复合后,小牛骨松质结合基因重组人骨形成蛋白2呈实体性疏松绒毛结构,骨松质孔洞内填充云絮状基因重组人骨形成蛋白2物质,两者结合良好.③各组术后不同时间组织学检查结果为：植入含0.4 mg基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组术后7 d出现软骨分化的小鼠有5只,苏木精-伊红染色观察,标本大量间充质细胞被诱导分化为软骨细胞,14 d有4只出现新骨诱导的现象,出现多处分散的骨软骨组织,多发生于植骨周围,21 d见散在软骨岛和稀疏退变小软骨岛,部分小鼠有新骨形成,但无骨髓及板层骨形成.植入含0.1 mg基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组术后7 d出现软骨分化的小鼠有3只,见少量间充质细胞被诱导分化为软骨细胞,有零星的间充质细胞分化、过渡为软骨细胞;14 d有部分标本可见骨及软骨组织,有的可见稀疏小软骨岛存在,21 d有4只出现新骨诱导.单纯植入脱钙牛松质骨载体骨粒组主要表现为纤维结缔组织包绕植骨,植骨周围见组织细胞增生.单纯植入基因重组人骨形成蛋白2组以肌纤维为主,无典型软骨细胞出现.表现为正常横纹肌切面和肌间隔结构.④术后不同时间植入含0.4 mg基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组和植入含0.1 mg基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨骨粒组的碱性磷酸酶活性和钙含量均高于对照组,前者高于后者,具有统计学意义（P＜0.05）.结论：①基因重组人骨形成蛋白2/脱钙牛松质骨是高效诱导成骨材料,经处理的小牛松质骨是良好的缓释载体,提高了基因重组人骨形成蛋白2的骨诱导能力.②复合基因重组人骨形成蛋白2异种骨的成骨活性与基因重组人骨形成蛋白2的含量成正比.     

重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白9与骨形态发生蛋白2复合纳米羟基磷灰石/聚酰胺多孔支架修复桡骨缺损的比较

背景:课题组采用新的重组腺病毒介导的基因表达手段,与传统方法比较具有高效、方便、安全等优点,可作为进入临床基因治疗应用的潜在有力手段.目的:比较腺病毒介导的人骨形态发生蛋白9(Adv-hBMP-9)与腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2(Adv-hBMP-2)分别复合纳米羟基磷灰石/聚酰胺多孔支架材料修复重建桡骨缺损的效果.方法:新西兰白兔36只,随机分成3组,制成双侧桡骨中段13 mm骨缺损模型.分别植入Adv-hBMP-9+纳米羟基磷灰石/聚酰胺骨、Adv-hBMP-2+纳米羟基磷灰石/聚酰胺骨、Adv-GFP+羟基磷灰石,聚酰胺骨.植入后进行大体观察、X射线摄片、组织学检测.结果与结论:BMP-9组骨缺损完全修复,BMP-2组骨缺损部分修复,而GFP对照组骨缺损修复明显欠佳.提示重组腺病毒介导的BMP-9对桡骨骨缺损后的成骨修复作用强于BMP-2.     

重组人骨形态发生蛋白2对兔椎间盘成骨作用的诱导

背景:重组人骨形态发生蛋白2作为一种新药已应用于临床,但在椎间盘内诱导成骨的研究报道很少。目的:通过动物实验,观察重组人骨形态发生蛋白2对兔椎体间融合的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验多水平评估,于2003-02/07在青岛大学医学院附属医院完成。材料:24只纯种成年新西兰大白兔,体质量3.5～4.5kg,分离暴露L4～5、L5～6椎间盘;重组人骨形态发生蛋白2,1mg/支,纯度≥95%,无菌包装,购自北京市百灵克生物制品有限公司。方法:24只大白兔随机投币法分为实验组和对照组,每组12只。实验组向L4～5椎间盘的髓核中注射含200μg重组人骨形态发生蛋白2的生理盐水溶液20μL;向L5～6的髓核中注射等量的生理盐水作为自身对照;对照组动物L4～5椎间盘的髓核中注射生理盐水20μL。主要观察指标:术后10,30,60,90d应用手法检查、组织学和影像学观察注射节段的形态变化。结果:纳入新西兰大白兔24只,均进入结果分析。①实验组10dL4～5节段活动范围无明显变化;30d活动范围轻度受限;60d活动范围明显受限;90dL4～5节段皆固定。作为自身对照的L5～6节段及对照组关节活动范围无明显变化。②实验组10dL4～5椎体间隙变窄;90dL4～5椎间隙消失,椎体间形成骨性融合。对照组及作为自身对照的L5～6节段椎间隙透光度无明显改变。③实验组10d髓核细胞逐渐变小,90d部分软骨终板已转化为成熟的编织骨;纤维环的胶原纤维结构逐渐消失,10d和30d均可见大量间充质细胞在纤维环外围聚集;90d纤维环靠近软骨终板处已形成成熟的编织骨。对照组各时间点组织学形态无明显变化。结论:重组人骨形态发生蛋白2可诱导椎间盘成骨,达到椎体间融合的目的。     

人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体的构建及鉴定

背景:内部核糖体进入位点序列载体能将上下游基因共同转录,故通过此载体可使连接在一起的人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2同时高表达,可为骨缺损的治疗提供新方法.目的:实验通过引入内部核糖体进入位点序列,采用基于attLXattR的λ噬茵体位点特异性重组系统的GatewayTM技术构建带有人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因重组腺病毒载体并进行鉴定.方法:用聚合酶链反应方法扩增人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2目的基因,将两个基因亚克隆至pIRES2-EGFP载体中,构建phBMP2-IRES-hFGF2载体,通过BP反应将hBMP2-IRES-hFGF2重组到载体pDONR221中,再通过LR反应将其转移到腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST中,线性化后转染293细胞进行包装获得重组腺病毒Ad-hBMP2-IRES-hFGF2.结果与结论:phBMP2-IRES-hFGF2经酶切及测序鉴定正确,带hBMP2-IRES-hFGF2的载体在293细胞中包装成功,获得成熟的病毒颗粒,病毒滴度为2.82×1010 ifu/mL,证实成功构建了带有人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因重组腺病毒载体.     

自制人骨形态发生蛋白2复合骨修复材料诱导骨再生

背景:骨形态发生蛋白是目前发现的一类惟一可独立诱导骨再生的细胞因子,临床应用前景广阔.但它们价格昂贵,限制了在中国的应用.目的:探讨自主生产的重组人骨形态发生蛋白2的骨诱导活性及对骨缺损的修复作用.方法:通过电泳及质谱的方法检测其复性后重组人骨形态发生蛋白2的纯度,通过C2C12细胞在重组人骨形态发生蛋白2诱导下向成骨细胞分化检测其骨诱导活性.将重组人骨形态发生蛋白2与以动物骨为原料加工制成的新型骨修复材料复合,植入新西兰兔桡骨缺损实验模型观察其对骨缺损的修复作用.结果与结论:自主生产的重组人骨形态发生蛋白2纯度≥95%,能明显诱导C2C12细胞向成骨细胞分化,分化早期大量表达碱性磷酸酶,分化末期形成大量的矿化小节,诱骨活性良好.在兔桡骨修复试验中,X射线影像学及苏木精-伊红染色组织学检查结果表明,重组人骨形态发生蛋白2复合材料组在2个月时形成大量骨痂,4-6个月时载体与自体骨融合,材料大量降解,修复效果良好;单纯骨填充材料组4-6个月时只有少量新生骨桥与自体骨连接,降解量极少;空白对照组损伤部位为纤维化组织所填充.结果提示自主生产的重组人骨形态发生蛋白2促进骨修复作用明显,适合应用于临床.     

重组人骨形态发生蛋白2-肝素-人工骨复合材料的骨诱导活性

背景：已有将重组人骨形态发生蛋白2应用于骨再生及修复的报道,但由于其在生物体内半衰期短而导致诱导骨形成的能力受到限制。目的：制备具有较好缓释效果的重组人骨形态发生蛋白2-肝素-人工骨复合材料,并检测其缓释性能及骨诱导活性。方法：通过高效液相色谱法检测重组人骨形态发生蛋白2-肝素复合物对于酶解的保护作用。将重组人骨形态发生蛋白2与肝素溶液混匀后复合于人工骨材料表面,ELISA方法检测其体外释药性质,茜素红染色法检测其诱导成骨细胞的能力,应用小鼠体内实验评价其异位骨诱导能力。结果与结论：成功制备了具有良好缓释效果的重组人骨形态发生蛋白2-肝素-人工骨复合材料,具有较强的诱导骨钙蛋白及异位骨形成能力。