氧化苦参碱对人胰腺癌细胞株SW1990侵袭转移能力的影响

目的 探讨氧化苦参碱对人胰腺癌细胞株SW1990体外迁移及侵袭能力的影响及其作用机制.方法 体外培养人胰腺癌SW1990细胞株,用氧化苦参碱处理SW1990细胞后,采用MTT法检测细胞增殖;通过细胞黏附实验、细胞划痕实验及Transwell小室检测细胞的黏附、迁移及侵袭能力;RT-PCR法检测细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达;ELISA法检测细胞VEGF蛋白的含量.结果 氧化苦参碱呈剂量和时间依赖性抑制SW1990细胞的增殖.2 mg/ml氧化苦参碱处理SW1990细胞1 h后,细胞的体外黏附抑制率为(35.23 ±8.56)%;处理24 h后,细胞的过河时间为(65.46±4.25)h,较对照组的(34.50±4.12)h显著延长(P<0.05);穿膜细胞数为(91.9±9.6)个,较对照组的(144.2±17.2)个显著减少(P<0.05);细胞VEGF、MMP-2 mRNA的表达及VEGF蛋白的分泌量均显著下调[0.515 ±0.063比0.817±0.054,0.343±0.072比0.650±0.068,(265.50 ±5.45)pg/ml比(441.06±16.70)pg/ml,P值均<0.05].结论 氧化苦参碱可能通过抑制MMP-2和VEGF表达进而抑制胰腺癌SW1990细胞的增殖、黏附、迁移及侵袭能力.     

VEGFsiRNA、bFGFsiRNA对胰腺癌细胞bFGF mRNA、蛋白表达的影响

目的 观察VEGFsiRNA和bFGFsiRNA对胰腺癌sw1990、Panc-1及PCT-3细胞bFGF表达水平的影响.方法 用VEGFsiRNA和bFGFsiRNA处理胰腺癌sw1990、Panc-1及PCT-3细胞,用RT-PCR法检测bFGF mRNA表达变化,用ELISA法检测bFGF蛋白表达变化.结果 EGFsiRNA处理后PCT-3、Panc-1、sw1990细胞bFGF mRNA相对表达量分别为0.50±0.05、0.81 ±0.09、0.46±0.06,bFGFsiRNA处理后分别为0.08±0.01、0.10±0.04、0.15±0.08,对照组分别为0.42±0.02、0.62±0.03、0.22±0.03.VEGFsiRNA处理后Panc-1、sw1990细胞bFGF mRNA表达强于对照组(P均＜0.05),VEGFsiRNA处理后PCT-3细胞bFGFmRNA表达与对照组相比P＞0.05.bFGFsiRNA处理后PCT-3、Panc-1细胞bFGF mRNA表达弱于对照组(P均＜0.05),bFGFsiRNA处理后sw1990细胞bFGF mRNA表达与对照组相比P＞0.05.VEGFsiRNA处理后PCT-3、Panc-1、sw1990细胞培养液上清液bFGF蛋白浓度为(490.57±125.23) pg/mL、(77.49±10.07) pg/mL、(13.35±1.63) pg/mL,bFGFsiRNA处理后分别为(142.78±13.95) pg/mL、(11.41±8.14) pg/mL、( 2.26±0.65) pg/mL,对照组分别为(316.29±57.39) pg/mL、(36.44±12.29) pg/mL、(3.87±0.42) pg/mL.VEGFsiRNA处理后sw1990、Panc-1细胞培养液上清液中bFGF浓度较对照组显著升高(P均＜0.05),PCT-3细胞培养液上清液bFGF浓度与对照组相比P＞0.05.bFGFsiRNA处理后PCT-3、Panc-1、sw1990细胞培养液上清液中bFGF浓度较对照组显著降低(P均＜0.05).结论 bFGFsiRNA抑制胰腺癌细胞bFGF mRNA、蛋白表达;VEGFsiRNA上调胰腺癌细胞bFGF mRNA、蛋白表达.     

丙型肝炎病毒核心蛋白对低氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨HCV核心蛋白对低氧诱导因子1 α(HIF-1 α)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响. 方法 将HCV核心蛋白基因的真核表达载体flag2B-core和HIF-1 αsiRNA转染Huh7.5.1细胞;采用RT-PCR和Western blot法分别检测HIF-1 α、VEGF在mRNA和蛋白水平的表达变化,采用酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中VEGF的含量.对各组间数据进行t检验.结果 Huh7.5.1细胞转染flag2B-core后,HIF-1 α和VEGF的mRNA和蛋白表达水平升高,细胞上清液中VEGF含量明显高于对照组[(654.5±43.7) pg/ml与(365.9±26.8)pg/ml,t=653.1％,P＜ 0.01)];Huh7.5.1细胞共转染flag2B-core和HIF-1 α siRNA后,HIF-1 α和VEGF的mRNA和蛋白表达水平降低,细胞上清液VEGF含量明显低于对照组[(389.2±29.6) pg/ml与(768.8±47.3) pg/ml,t=1330.22,P＜0.01).结论 HCV核心蛋白能够上调HIF-1 α和VEGF的表达;HCV可能通过核心蛋白来调节HIF-1 α和VEGF的表达.     

MicroRNA-196a抑制序列对人胰腺癌PANC1细胞株HOXB8基因表达的影响

目的 观察microRNA-196a(miR-196a)抑制序列转染胰腺癌细胞株PANC1后对其HOXB8基因表达的影响.方法 将PANC1细胞分为对照组、miR-196a抑制序列组和siRNA对照组.采用脂质体法将miR-196a抑制序列及对照siRNA分别转染PANCI细胞.应用RT-PCR和蛋白质印迹法检测转染细胞miR-196a及其下游靶基因HOXB8 mRNA和蛋白的表达.结果 转染miR-196a抑制序列后,PANC1细胞miR-196a表达量较siRNA对照组显著减少(0.050±0.054比0.839±0.025,t=3.12,P＜0.05);HOXB8 mRNA表达量较siRNA对照组增高1.57倍(2.20 ±0.07比1.29±0.10,t=3.86,P＜0.05);HOXB8蛋白表达量也显著增强(0.90±0.03比0.40±0.10,t=3.11,P＜0.05).结论 miR-196a可以下调HOXB8基因的表达.     

RNA干扰沉默NF-κB p65基因表达抑制胰腺癌PANC1细胞增殖与侵袭的研究

目的 运用RNA干扰技术阻断人胰腺癌细胞株PANC1的NF-κB p65表达,观察该基因沉默后对细胞增殖能力及体外侵袭能力的影响.方法 采用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000将化学合成的人NF-κB p65的小干扰RNA(siRNA)转染人胰腺癌细胞PANC1作为siRNA组,另设无同源性siRNA转染细胞的阴性对照组和蒸馏水空白对照组.实验重复6次.应用RT-PCR检测转染细胞NF-κB p65 mRNA与细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA的表达.MTT结合克隆形成实验测定细胞生长抑制率.Matrigel细胞侵袭实验测定细胞体外侵袭能力.结果 siRNA组、阴性对照组和空白对照组NF-κB p65 mRNA相对表达量分别为0.227±0.045、0.381±0.038和0.404±0.031;ICAM-1 mRNA相对表达量分别为0.597±0.083、0.983±0.068和1.027±0.098;细胞生长抑制率(72 h)分别为18.3%、2.3%和0;克隆形成率分别为(14.1±3.1)%、(24.5±2.1)%和(27.2±2.6)%;侵袭细胞数分别为80.25±6.35、123.83±8.80和127.68±9.23.siRNA组均明显低于2个对照组(P＜0.01).结论 NF-κB p65的RNA干扰能抑制胰腺癌PANC1细胞NF-κB p65 mRNA和ICAM-1 mRNA的表达,抑制细胞的生长和侵袭.     

Dysadherin基因沉默对胰腺癌细胞侵袭移行能力的影响

目的 探讨靶向封闭dysadherin基因对胰腺癌细胞PANC1、BxPC3体外侵袭移行能力的影响.方法 应用脂质体转染方法将小分子RNA(siRNA)转染细胞.实验分为dysadherin-siRNA转染(dysa)组、阴性对照siRNA转染(HK)组、脂质体对照(对照)组、.采用RT-PCR、免疫组化方法检测转染细胞的dysadherin mRNA及蛋白表达;采用Transwell侵袭小室检测转染细胞体外侵袭移行能力.结果 转染dysadherin-siRNA(5 nmol/L)的PANC1和BxPC3细胞的dysadherin mRNA表达较HK组细胞分别下降95.4%、52.1%(P＜0.05);dysadherin蛋白表达亦分别降低91.2%、83.6%(P＜0.01).PANC1细胞的对照组、HK组和dysa组穿膜细胞数分别为163.2±15.5、154.4±17.3和53.6±7.9;BxPC3细胞的对照组、HK组和dysa组穿膜细胞数分别为30.7±3.2、27.5±2.8和4.7±2.4.dysa组显著低于HK组和对照组(P值均＜0.01).结论 应用RNA干扰技术沉默人胰腺癌细胞株PANC1、BxPC3的dysadherin基因可使细胞的侵袭移行能力下降.     

胰腺癌细胞TM4SF1的表达及其对细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响

目的 检测5株人胰腺癌细胞株中TM4SF1 mRNA的表达,探讨TM4SF1基因对癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响.方法 采用实时PCR方法检测人胰腺癌细胞株MPanc96、MiaPaCa-2、HPAC、PANC1、AsPC-1的TM4SF1 mRNA表达,并与人正常胰腺导管上皮细胞（HPDE）的TM4SF1mRNA表达进行比较.应用RNA干扰方法将靶向TM4SF1的siRNA及阴性对照siRNA瞬时转染MPanc96、MiaPaCa-2细胞.采用MTS法检测转染细胞的增殖能力,Transwell小室法检测细胞的迁移及侵袭能力.结果 胰腺癌细胞株MPanc96、MiaPaCa-2、PANC1、AsPC-1、HPAC的TM4SF1 mRNA相对表达量分别为1.205±0.073、1.096±0.260、1.382±0.075、1.374±0.363、0.744±0.096,均显著高于HPDE的0.020±0.003（F =22.26,P＜0.01）.与转染阴性对照siRNA的细胞比较,TM4SF1基因表达沉默的MPanc96、MiaPaCa-2细胞的增殖无显著变化,但细胞的迁移力分别降低（62.5±7.6）％、（72.8±4.0）％,侵袭能力分别下降（69.5±5.7）％、（78.6±6.3）％.结论 TM4SF1在人胰腺癌细胞中高表达,并增强胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力.     

Kangai-1抑制胰腺癌细胞转移与细胞粘附分子-1和金属蛋白酶-9关系的研究

目的 研究肿瘤转移抑制基因Kangai-1(KAI1)对胰腺癌细胞增殖功能及转移潜能的影响.方法 建立经腺病毒(Ad)成功构建的重组载体(Ad-KAI1),并转染胰腺癌PANC Ⅰ细胞.用血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子(EGF)作为诱导剂,按照不同诱导时间点(3、5、7 h)将PANC Ⅰ细胞进行实验分组,比较感染前后细胞形态.采用Transwell方法 对PANC Ⅰ细胞转染Ad-KAI1前、后的迁移作用进行比较.采用免疫细胞化学法检测细胞粘附分子-1(ICAM-1)和金属蛋白酶-9(MMP-9)在PANC Ⅰ细胞转染Ad-KAI1前、后的表达水平.结果 在VEGF和EGF诱导下,转染Ad-KAI1后与转染前相比,PANC Ⅰ细胞的迁移能力明显下降(P＜0.05).免疫细胞化学研究提示,PANC Ⅰ细胞中ICAM-1、MMP-9均呈阳性表达,转染后均呈阴性表达.结论 KAI1基因抑制胰腺癌转移可能是通过抑制ICAM-1和MMP-9的表达.     

半乳凝素3在胰腺癌细胞中的表达及对胰腺癌SW1990细胞增殖和侵袭的影响

目的 研究半乳凝素3( galectin-3)在胰腺癌细胞株中的表达及对人胰腺癌细胞株SW1990增殖和侵袭能力的影响.方法 采用免疫细胞化学法和RT-PCR方法检测胰腺癌细胞株SW1990、PANC1、AsPC-1的galectin-3蛋白和mRNA表达.分别应用1、2、3、5μg/ml galectin-3单抗处理SW1990细胞24、48、72 h,采用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖,Transwell小室检测细胞的侵袭能力.结果 胰腺癌SW1990.PANC1、AsPC-1细胞均有galectin-3 mRNA和蛋白表达.galectin-3单抗呈浓度和时间依赖性抑制SW1990细胞的增殖及穿膜细胞数.培养72 h时2、3、5μg/ml galectin-3单抗的细胞生长抑制率分别为19.8％、29.9％和42.7％,与对照组比较差异均有统计学意义(P值均＜0.05).3 μg/ml galectin-3单抗组的穿膜细胞抑制率为37.1％,与对照组的10.4％差异有统计学意义(P＜0.05).结论 galectin-3在胰腺癌细胞中高表达,用抗体中和galectin-3能抑制SW1990细胞的增殖和侵袭能力     

应用表达载体介导siRNA抑制胰腺癌STAT3基因表达的研究

目的 探讨表达载体介导小干扰RNA(siRNA)对人胰腺癌细胞系SW1990转录激活因子-3(STAT3)表达的抑制作用.方法 设计合成3种可编码后形成小发夹结构针对STAT3基因的siRNA的DNA序列,将其连入pRNAT-U6.1/Neo质粒中,构建STAT3 siRNA表达载体.表达载体进行PCR及测序鉴定,并分别转染SW1990细胞,实时定量PCR和Western blot观察SW1990细胞转染后STAT3 mRNA和蛋白表达的改变.结果 PCR和DNA测序证实携带3种STAT3 siRNA表达载体构建成功,分别转染SW1990细胞后,STAT3基因的mRNA和蛋白表达量与空质粒转染相比均明显下降(P＜0.05),其中,第二种STAT3 siRNA作用明显,可使mRNA和蛋白表达水平分别下降63%和60%.结论 本研究构建的STAT3 siRNA表达载体可有效抑制SW1990细胞STAT3的mRNA和蛋白表达,为下一步以STAT3为靶点的胰腺癌基因治疗实验研究奠定了基础.     

Transgelin在伴随糖尿病的胰腺癌中的表达及其对SW1990细胞运动侵袭的影响

目的 探讨骨架相关蛋白Transgelin在伴或不伴糖尿病的胰腺癌组织中的表达,及其对胰腺癌SW1990细胞运动侵袭的影响。方法 采用免疫组织化学法检测Transgelin在92例胰腺癌患者（其中伴糖尿病者45例）的癌组织、癌旁组织（距癌边缘＞5 cm）中的表达水平,分析其与临床病理特征的关系;设计并体外合成靶向Transgelin的小干扰RNA(siRNA),将其转染到SW1990细胞中,采用Transwell小室检测转染前后细胞运动侵袭能力的改变。结果 Transgelin在胰腺癌 组织中的表达阳性率为68.5％(63/92),显著高于癌旁组织[33.7％(31/92),P＜o.05]。伴随糖尿病的胰腺癌组织中Transgelin表达阳性率为84.4％(38/45),显著高于无糖尿病的胰腺癌组[53.2％(25/47),P＜0.05]。胰腺癌组织中Transgelin表达与胰腺癌的淋巴结转移及TNM分期密切相关(P＜0.05),与性别、年龄、发生部位、分化程度、门静脉或神经受侵犯无关(P＞0.05)。Transgelin siRNA干扰后48 h,SW1990细胞迁移能力[穿膜细胞数为(49.2±9.5)个]明显低于阴性对照组和空白组[(61.9±7.5)和(65.3±10.6)个,P值均＜0.05];SW1990细胞的体外侵袭能力[穿膜细胞数为(48.0±8.6)个]也明显低于阴性对照组和空白组[（63.5±11.4）个和(67.5±9.6)个,P值均＜0.05]。结论 Transgelin可能通过促进胰腺癌细胞的运动侵袭能力,参与伴随糖尿病的胰腺癌的转移发生。     

整合素β1基因沉默对胰腺癌细胞PANC1体外侵袭能力的影响及机制研究

目的 应用短发夹RNA(shRNA)沉默人胰腺癌细胞株PANC1的整合素α1(integrinβ1)基因表达,观察其对PNAC1细胞体外侵袭能力的影响,探讨其机制.方法 构建靶向integrinβ1基因的shRNA真核表达质粒integrinβ1-shRNA及对照真核表达质粒c-shRNA,转染人胰腺癌PANC1细胞,以未转染质粒的细胞作为对照组.应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测integrinβ1、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白的表达水平,应用Transwell侵袭小室检测细胞体外侵袭能力.结果 integrinβ1-shRNA 组、c-shRNA组和对照组细胞integrinβ1 mRNA表达量分别为0.0029±0.0004、0.0131±0.0009、0.0138±0.0005;integrinβ1蛋白表达量为0.0159±0.0062、0.3215 ±0.0126、0.3107±0.0094.integrinβ1-shRNA 组integrinβ1 mRNA和蛋白表达抑制率分别为(78.6±7.2)％和(92.9±3.2)％(P＜0.01).而c-shRNA 组与对照组差异无统计学意义(P =0.2999).integrinβ1-shRNA组穿膜细胞数由(52±5)个降低至(21 ±4)个(P＜0.01);MMP-2和MMP-9mRNA表达分别从0.592±0.073和0.847±0.069降低到0.102±0.034和0.273±0.071;MMP-2和MMP-9蛋白表达分别从0.225±0.046和0.416±0.081降低到0.059±0.013和0.106±0.022(P值均＜0.05).结论 重组质粒integrinβ1-shRNA能有效地抑制PANC1细胞integrinβ1基因的表达,并可能通过下调MMP-2和MMP-9基因表达而抑制其体外侵袭能力.     

MK886和Celecoxib抑制胰腺癌SW1990细胞生长及血管生成的实验研究

目的 观察5-脂氧合酶拮抗剂MK886、环氧化酶2拮抗剂Celeeoxib干预SW1990细胞后对细胞增殖及血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达的影响.方法 应用不同浓度的MK886、Celecoxib 以及两者联合处理SW1990细胞,采用胆囊收缩素(CCK-8)法检测细胞的增殖,RT-PCR法检测细胞白三烯B4受体1(BLT1) mRNA、前列腺素2(PGE2) mRNA、VEGF mRNA的表达.结果 10μmol/LMK886或20 mmol/L Celecoxib处理24h后,SW1990细胞的增殖受到明显抑制(1.80±0.06比1.65±0.10;2.04 ±0.03比1.86 ±0.02,P＜0.05),且随药物浓度的增加,细胞的增殖抑制更明显.两拮抗剂联合干预12h后,SW1990细胞的增殖即受到非常明显的抑制(1.72±0.05比1.52±0.05,P＜0.01).Celecoxib处理细胞48 h后,细胞BLT1、VEGF mRNA表达与对照组比较无明显变化,但PGE2 mRNA的表达明显减少(37.50比71.50,P＜0.05);MK886或MK886+ Celecoxib联合处理细胞后,细胞BLT1、VEGF mRNA表达明显减少(40.30、22.75比126.50,P＜0.05),而PGE2 mRNA的表达与对照组比较无明显变化.结论 花生四烯酸的两条代谢途径均与胰腺癌的发生及增殖有密切关系,同时抑制两条途径可显著抑制胰腺癌细胞的增殖.     

人类真核延伸因子1A2对胰腺癌细胞侵袭、转移能力的影响

目的 探讨外源性人类真核延伸因子(EEF)1A2基因导入人胰腺癌SW1990细胞株后.细胞侵袭转移能力的改变.方法 应用腺病毒载体将EEF1A2基因导入人胰腺癌SW1990细胞中,采用划痕实验、Transwell小室、细胞粘附实验检测转染前后细胞运动、侵袭、转移及粘附能力的改变.结果 Ad5/F35-EEF1A2转染后继续培养48 h的SW1990细胞,可见预期大小的特异性条带.实验组24 h后细胞迁移率为(74.43±2.12)%,与阴性对照组和空白对照组比较差异有统计学意义[(44.08±5.92)%和(48.09±3.54)%,P＜0.05].实验组48 h后穿膜细胞数为(65.42±8.24)个,与阴性对照组和空白对照组相比差异有统计学意义[(20.10±5.82)个和(23.25±5.23)个,P＜0.05].实验组48 h后穿膜细胞数为(61.30±5.68)个,与阴性对照组和空白对照组相比差异有统计学意义[(32.04±3.60)个和(32.33±2.51)个,P＜0.05],且对Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型胶原、纤维结合蛋白、粘蛋白的粘附力增强(P＜0.05).结论 腺病毒介导的EEF1A2高表达能明显增强胰腺癌SW1990细胞的运动、侵袭、转移及粘附能力.提示EEF1A2可能通过改变胰腺癌细胞的生物学特性影响胰腺癌的发生发展.     

沉默畸胎瘤衍生生长因子-1基因对胰腺癌细胞株PANC1侵袭力的影响

目的 探讨TDGF-1基因沉默对胰腺癌细胞株PANC1侵袭力的影响.方法 设计并合成3个(S1、S2、S3)靶向TDGF-1基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),筛选出沉默效果最好的siRNA.以该siRNA的不同浓度(3.125、6.25、12.5 nmol/L)转染PANC1细胞,并设对照组和脂质体组.采用实时定量PCR和Western blotting检测TDGF-1 mRNA和蛋白表达,以软琼脂集落培养试验和Boyden小室检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力,并将转染48 h的细胞接种裸鼠,观察癌细胞的体内侵袭.结果 siRNA转染组细胞的TDGF-1 mRNA和蛋白表达水平呈浓度和时间依赖性下降,且较脂质体组明显降低(P值均＜0.01).对照组细胞集落形成数和穿膜细胞数分别为19.8±2.2和49.8±2.6;siRNA组呈浓度依赖性明显减少,12.5 nmol/L转染组分别为5.6±1.2和8.1±1.1.对照组、脂质体组和12.5 nmol/L转染组接种4周后裸鼠种植瘤体积分别为(2.228±0.026)cm3、(2.186±0.028)cm3和(0.728±0.023)cm3.对照组和脂质体组种植瘤侵犯周围肌层组织,转染细胞组未见侵犯.结论 采用RNA干扰技术沉默PANC 1细胞的TDGF-1基因表达可抑制癌细胞的侵袭力.     

12-脂氧合酶在胰腺癌中的表达及其临床意义

目的 检测胰腺癌组织和胰腺癌细胞株SW1990和PANC1的12-脂氧合酶(12-lipooxygenase,12-LOX)表达,探讨其与胰腺癌临床病理参数的关系.方法 分别应用免疫组化染色、RT-PCR和蛋白质印迹法检测胰腺癌组织、癌旁正常胰腺组织及胰腺癌细胞株SW1990和PANC1中12-LOX mRNA和蛋白的表达.分析胰腺癌组织12-LOX表达与临床病理参数的相关性.结果 30例胰腺癌组织12-LOX表达阴性8例,弱阳性7例,强阳性15例,总阳性率为73.3％.SW1990和PANC1细胞均表达12-LOX.阳性表达的胰腺癌组织及两株胰腺癌细胞株均表达12-LOX mRNA,而癌旁正常胰腺组织不表达12-LOX mRNA及蛋白.胰腺癌组织12-LOX强阳性表达与肿瘤TNM分期、肿瘤病理分级和淋巴结转移相关(P＜0.05),而与患者年龄、性别无关.结论 12-LOX在胰腺癌中表达上调,与胰腺癌的恶性生物学行为有关.