甲型副伤寒杆菌ompX基因原核表达及表达产物免疫原性鉴定

目的构建甲型副伤寒杆菌外膜蛋白基因ompX的原核表达系统,确定其重组表达产物rOmpX免疫原性。方法采用PCR从甲型副伤寒杆菌标准株50001扩增目的基因并构建其原核表达系统,IPTG诱导表达目的蛋白,提取并纯化表达产物。采用免疫扩散法和Western blot鉴定其免疫原性。结果成功构建了ompX的原核表达系统,rOmpX表达量约为细菌总蛋白的28%。rOmpX免疫家兔可产生抗体并能与重组蛋白rOmpX产生阳性Western blot杂交信号。结论成功构建甲型副伤寒杆菌外膜蛋白基因ompX的原核表达系统,rOmpX具有良好的免疫原性,可作为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原之一。     

沙眼衣原体质粒蛋白pORF5原核表达及免疫原性鉴定

目的 构建沙眼衣原体(CT)pORF5蛋白基因重组质粒pGEX-6p/pORF5,表达并纯化质粒蛋白pORF5,并鉴定其免疫原性.方法 用PCR法扩增pORF5基因,定向插入pGEX-6p原核表达载体构建原核表达重组体pGEX-6p/pORF5,重组体经酶切、PCR及测序鉴定后,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达pORF5融合蛋白.融合蛋白纯化后免疫BALB/c鼠,ELISA及Western-blot分析pORF5质粒蛋白免疫原性及免疫反应性.结果 PCR扩增出795 bp基因片段,序列测定证实重组质粒插入片段与GenBank登陆的D型Ct一致;pORF5融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达;ELISA检测免疫小鼠的血清效价为1:25 600.结论 pORF5蛋白在原核细胞中可有效表达并具有较好的免疫原性,为进一步研究该蛋白的结构功能、阐明Ct的致病机制、研制基因工程疫苗提供了有利的条件.     

鸡Tie-2受体胞外片段的原核表达及目的蛋白免疫原性的研究

目的研究鸡Tie-2受体胞外片段(配体结合域)的原核表达以及目的蛋白对小鼠的抗原性。方法用PCR方法从既往构建的包含鸡Tie-2受体胞外段基因的表达质粒扩增目的片段,进而构建PQE原核表达载体并诱导其目的蛋白的表达,将目的蛋白进一步纯化、复性并免疫小鼠,获得抗血清,用ELISA和Western blotting检测抗血清中抗体的存在。结果经酶切分析及测序鉴定表明获得了鸡Tie-2受体胞外目的片段的PQE原核表达载体,能高效表达目的蛋白,将其免疫小鼠可产生抗重组蛋白的抗体。结论用原核表达的方式可成功的获得鸡Tie-2受体胞外目的片段的蛋白,并对小鼠产生免疫原性。     

人可溶性DC-SIGN的原核表达及鉴定

目的 构建可溶性DC-SIGN(sDC-SIGN)原核表达载体,获得不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白.方法 采用PCR方法,从含人DC-SIGN cDNA的重组质粒pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN胞外区基因片段,插入原核表达载体pET17b,构建重组表达载体pET17b-sDC-SIGN,经酶切图谱和测序鉴定,转入E.coli BL21 (DE3)诱导表达蛋白,用抗人DC-SIGN抗体-Sepharose 4B亲和层系纯化表达产物,以SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 从重组质粒pGM-DC-SIGN扩增获得1 300 bp目的基因片段,构建重组表达质粒pET17b-sDC-SIGN,其酶切图谱和序列与预期相符.纯化表达产物sDC-SIGN,鉴定其分子质量为38 000,Western bolt证明其可与抗人DC-SIGN抗体特异性结合.结论 获得了能高效表达重组人sDC-SIGN的大肠杆菌菌株和不带任何标签蛋白的sDC-SIGN蛋白,为深入研究sDC-SIGN的功能奠定了基础.     

人CDC2基因的克隆和原核表达及鉴定

目的：从人肝癌组织中克隆出人细胞分裂周期基因2（ CDC2）,并在大肠杆菌中表达CDC2蛋白。方法：从人肝癌组织中提取RNA,采用RT-PCR法扩增CDC2 cDNA,用DNA凝胶回收试剂盒纯化并回收RT-PCR产物,将RT-PCR产物插入pET28a(+)载体NdeⅠ和 XhoⅠ两酶切位点之间,转化大肠杆菌BL21(DE3);IPTG诱导表达人CDC2蛋白。结果：RT-PCR扩增出约894 bp的DNA片段,与GenBank中的CDC2基因序列完全一致。经限制性内切图谱和测序鉴定,成功构建了pET28a(+)/CDC2原核表达载体。SDS-PAGE分析结果显示人CDC2蛋白在大肠杆菌中得已表达。结论：从人肝癌组织中成功地扩增出CDC2基因,并在大肠杆菌中表达。     

人TRAIL胞外区原核可溶性表达及活性鉴定

目的获得具有生物活性的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)胞外段蛋白。方法根据大肠杆菌密码子偏爱性要求,设计合成编码TRAIL胞外段的DNA序列,构建成pET30a-TRAIL胞内融合表达质粒,重组质粒转化表达宿主E.coli BL21。在不同温度、不同浓度的IPTG条件下诱导表达TRAIL,SDS-PAGE分析表达产物,MTT法检测产物活性。结果构建的工程菌株表达29KD的可溶性TRAIL融合蛋白,能诱导Jurkat细胞凋亡。结论成功表达了人TRAIL胞外段蛋白,为进一步研究提供基础。     

人HT036蛋白的原核表达及鉴定

目的 原核表达人HT036蛋白并鉴定其正确性.方法 采用PCR技术,扩增人HT036蛋白编码序列,克隆至原核表达载体pET30a( )中,用IPTG诱导表达,免疫印迹鉴定.结果 PCR扩增得到了目的DNA片段,克隆至原核表达载体后经酶切与测序鉴定正确,并在大肠杆菌中获得高效表达,用抗His抗体鉴定融合蛋白表达正确.结论 成功构建了重组原核表达载体并正确表达了HT036蛋白.     

GCF2基因片段原核表达载体的构建与鉴定

目的 构建肝癌相关抗原GCF2基因片断(323～1 234 bp)原核表达重组质粒.方法 提取人肝癌组织总RNA,通过反转录酶合成cDNA;根据GenBank公布的GCF2基因cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法扩增出人GCF2基因片断(编号2-5a),将此片段连接在克隆载体pGEM-T上进行测序,通过酶切、连接将...     

粉尘螨第五组主要变应原(Der f5)的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

目的 克隆表达粉尘螨第五组变应原(Dermatophagoides farinae,Der f5)基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性.方法 提取活粉尘螨总RNA,扩增Der f5片段.PCR产物与克隆载体pMD18-T连接,转化入大肠埃希菌JM109,经酶切及测序鉴定获得pMD18-Der f5阳性菌株,再提取质粒进行双酶切,与表达载体pET-30a(+)连接,转化人大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其表达效果.Ni-IDA亲和层析柱纯化蛋白,利用尘螨病人血清鉴定其免疫原性.结果 构建了重组质粒pMD18-Der f5和pET30a-Der f5,SDS-PAGE结果表明Der f5基因在BL21中获得良好的可溶性表达,蛋白质分子量与理论值相符.纯化的蛋白与病人血清有良好的IgE结合活性.结论 获得广州地区Der f5的原核表达载体,高效表达纯化重组蛋白.初步鉴定了该蛋白的免疫原性.     

沙眼衣原体主要外膜蛋白21-387的原核表达及其免疫原性

目的:探讨沙眼衣原体(Ct)E血清型主要外膜蛋白(MOMP21-387)的原核表达及其免疫原性。方法:利用PCR方法扩增Ct E血清型MOMP第21至第387氨基酸的基因序列,克隆至p ET21a(+)原核表达载体构建重组质粒p ET21a(+)/MOMP21-387,并进行原核表达和纯化,经SDS-PAGE和Western blot法分析鉴定后,通过BALB/c小鼠免疫检测MOMP21-387蛋白的免疫原性,即通过ELISA法检测小鼠血清Ig G和生殖道分泌物Ig A抗体反应,乳酸脱氢酶(LDH)法检测其脾细胞的特异性杀伤作用。结果:在原核表达系统成功表达了MOMP21-387融合蛋白,经SDS-PAGE及Western blot法鉴定在相对分子质量(Mr)约44 000处出现特异性条带;并经NiNTA亲和层析的方法获得了纯化的MOMP21-387融合蛋白,免疫BALB/c小鼠可诱导产生特异性血清Ig G抗体和生殖道分泌物Ig A抗体,至第6周达到高峰,MOMP21-387组的Ig G和Ig A抗体较PBS组差异均有统计学意义(P<0.05);LDH检测结果显示,MOMP21-387组小鼠脾细胞对靶细胞的杀伤率,在10:1、20:1和40:1和80:1时均明显高于PBS组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Ct E型MOMP21-387融合蛋白具有良好的免疫原性,为基于MOMP21-387的Ct的ELISA法检测方法的开发和疫苗研究奠定了基础。     

锌转运体8自身抗体对1型糖尿病诊断价值及其与HLA-A基因的关系

目的：探讨锌转运体8自身抗体(zinc transporter 8 antibody, ZnT8A)在江苏地区1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus, T1DM）诊断中的价值及ZnT8A与人类白细胞抗原(HLA)-A基因的关系。方法：横断面、病例对照研究,T1DM和正常对照组均采用免疫配体法检测胰岛自身抗体：谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、蛋白酪氨酸磷酸酶抗体(IA-2A)、胰岛素自身抗体(IAA)和ZnT8A,PCR-SSO 方法进行HLA-A的分型。结果：①140例TIDM患者中65例ZnT8A阳性(阳性率46.4%),102例正常对照组中仅1例ZnT8A阳性(阳性率1.0%),差异有统计学意义(P＜0.05);②联合检测GADA、IAA、IA-2A 3个传统抗体,至少1个抗体阳性率为70.7%(99/140);联合检测GADA、IAA、IA-2A和ZnT8A 4个抗体,至少1个抗体阳性率为86.4%(121/140)(P＜0.05),ZnT8A在其他3个抗体阴性的患者中仍有15.7%的阳性率;③HLA-A*24在T1DM组较正常对照组明显升高(P＜0.05,OR=1.654),A*33与正常对照组相比明显下降(P＜0.05,OR=0.161);④HLA-A*02在ZnT8A阳性组明显高于ZnT8A阴性组(P＜0.05,OR=0.318),在校正病程、发病年龄、体重指数（BMI）等可能影响因素后,差异无统计学意义。结论：ZnT8A 使T1DM患者自身抗体阳性率提高了15.7%,有助于提高T1DM的诊断;暂未发现HLA-A与ZnT8A的相关性。     

锌转运体8自身抗体对急性起病糖尿病患者分型诊断的价值

目的 探讨锌转运体8自身抗体(ZnT8A)对急性起病糖尿病患者分型诊断的价值.方法 453例急性起病糖尿病患者根据谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)和酪氨酸磷酸酶抗体(IA2-A)阳性分为A+组276例(任一抗体阳性)和A-组177例(抗体皆为阴性);将555例2型糖尿病患者和405名健康者作为对照.分析ZnT8A在急性起病糖尿病患者和亚组中的分布规律、相关因素和ZnT8A阳性者的临床特征.抗体检测采用放射配体法.结果 (1)ZnT8A在急性起病糖尿病组的阳性率为24.3%,显著高于2型糖尿病组(1.8%)和健康对照组(1.0%)(均P＜0.01);而且ZnT8A在A+组中的检出率为29.7%,显著高于A-组患者15.8%(x2=11.318,P＜0.01).(2)ZnT8A阳性率在＜30岁各亚组高于≥30岁亚组(0～9岁,34.9%;10～19岁,26.7%;20～29岁,26.3%比≥30岁,18.3%;均P＜0.05);在体质指数(BMI)＜21.0 kg/m2和21.0～25.0 kg/m2亚组高于BMI＞25.0 kg/m2亚组(25.5%和25.9%比8.7%,均P＜0.05).(3)ZnT8A水平与IA2-A滴度间呈正相关(r=0.165,P=0.01).(4)3种抗体联合测定使自身免疫检出率从60.9%提高到67.1%.(5)与抗体阴性者相比,ZnT8A单独阳性者日胰岛素需要量较多[(35.5±9.3)U/d比(29.8±14.7)U/d,P＜0.05],而收缩压和舒张压均较低[(107±15)mm Hg比(113±16)mm Hg,(69±12)mm Hg比(73±12)mm Hg,均P＜0.05].结论 ZnT8A对急性起病糖尿病患者的免疫分型诊断有一定价值,在常见抗体(GADA和IA2-A)阴性者中可识别出一类更接近于经典1型糖尿病的临床表型.     

人cubilin蛋白功能片段原核表达系统的建立

目的构建编码白蛋白吞饮受体人cubilin(hcubilin)蛋白配体结合域CUB7-8基因片段的原核表达载体,诱导表达并鉴定表达产物.方法重组DNA技术构建原核表达载体pGEX-hCUB7-8,IPTG诱导表达,SDS-PAGE与免疫印迹法鉴定表达产物,Pull down实验验证融合蛋白是否与白蛋白结合.结果双酶切和测序鉴定表明CUB7-8片段插入正确,诱导表达后获得分子量为52×103的融合蛋白,该融合蛋白可以被抗GST抗体识别,并且可以和白蛋白结合.结论CUB7-8基因片段编码的蛋白质能在原核细胞中正确表达,并且可以和白蛋白结合,这为进一步研究该功能域的结构与功能奠定了基础.     

人类8型疱疹病毒K8.1N基因编码包膜糖蛋白的原核表达及其抗原特异性分析

目的：制备人类8型疱疹病毒（HHV-8）K8.1N基因编码包膜糖蛋白的原核表达融合蛋白,并鉴定其抗原特异性。方法：将重组质粒pET41a-K8.1N转化大肠杆菌BL21感受态细胞,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达谷胱甘肽S转移酶（GST）/K8.1N融合蛋白,经Glutathione Sepharose4B亲和层析柱纯化。采用Western blot法观察GST/K8.1N融合蛋白（作为抗原）与新疆地区、法国卡波西肉瘤（KS）患者血清以及四川健康儿童血清的血清学反应。结果：IPTG诱导后的菌体裂解蛋白,经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后,显示有一个46kD的融合蛋白表达,经Westernblot法鉴定此融合蛋白能被KS患者血清特异性地识别,新疆地区KS患者血清检出率为78.6%,法国KS为12.0%,四川健康儿童血清无一例与GST/K8.1N融合蛋白发生反应。结论：HHV-8包膜糖蛋白编码基因在大肠杆菌BL21中获得正确表达,并与KS患者血清具有特异识别性。     

人类8型疱疹病毒小衣壳蛋白ORF65基因的原核表达及其生物信息学分析

目的：构建人类8型疱疹病毒（HHV-8）小衣壳蛋白（ORF65）基因重组原核表达质粒并诱导表达,获得其重组融合蛋白。方法：软件设计引物,在引物两端添加特异性酶切位点,以pGEM-Teasy/ORF65为模板,PCR扩增基因序列,克隆入原核表达载体pET-41a中,构建原核表达质粒pET41a-ORF65,转化大肠杆菌（E.coli）DH5x,经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性,转入E.coli BL21（DE3）,并诱导表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法以及序列分析软件DNAMAN 5.0、Vector NTI Suite 6、Primer Primier 5对表达蛋白进行生物信息学分析。结果：测序结果表明所构建pET41a-ORF65原核表达质粒连接正确,SDS-PAGE表明ORF65基因获得成功表达,生物信息学分析显示该蛋白含有1个N糖基化位点,2个蛋白激酶C磷酸化位点,4个胆碱激酶Ⅱ磷酸化位点,4个N肉豆蔻酰化位点,1个酰胺化位点。BlastP数据库的相似性检索发现有与之有较高同源性的蛋白。结论：成功表达HHV-8病毒小衣壳蛋白ORF65,该蛋白与疱疹病毒衣壳蛋白的同源性较高,是疱疹病毒衣壳蛋白家族中的一员。     

稳定表达IL-8基因宫颈癌SiHa细胞株的建立及鉴定

目的 建立高效、稳定表达IL-8基因的人宫颈癌peDNA3.1-IL-8-SiHa细胞株.方法 利用pcDNA3.1(+)真核表达载体构建pcDNA3.1/IL-8表达载体,利用基因克隆技术将IL-8 cDNA基因片段通过脂质体转染入人宫颈鳞癌SiHa细胞中,经G418筛选获得稳定表达的细胞克隆,建立了高表达IL-8的pcDNA3.1-IL-8-SiHa宫颈癌细胞株,转染阳性细胞连续传代培养,传8代后用RT-PCR,ELISA,免疫细胞化学法进一步鉴定细胞中IL-8的表达.结果 成功建立了持续高表达IL-8的pcDNA3.1-IL-8-SiHa细胞株,并在细胞中检测到IL-8 mRNA及蛋白的高表达.结论 高效表达IL-8基因的SiHa细胞株的建立有助于研究IL-8基因在宫颈癌发生发展中的作用.     

Iodine deficiency up-regulates monocarboxylate transporter 8 expression of mouse thyroid gland

Background Iodine deficiency is a major factor affecting thyroid auto-regulation,the quantity of iodine may greatly influence the synthesis of thyroid hormones （THs）.It has long been believed that TH enters the cell through passive diffusion.Recent studies have suggested that several transporters could facilitate transportation of TH.The monocarboxylate transporter 8 （MCT8） was identified as a very active and specific TH transporter.The purpose of this study was to investigate whether iodine insufficient affected the expression of MCT8 in the thyroid gland.Methods Sixty BALB/c mice were randomly divided into two groups：control group was fed with standard feed （iodine concentration of 300 μg/kg）; while low-iodine （LI） group received iodine-insufficient feed （iodine concentration of 20-40 μg/kg）.After 3 months,10 mice of each group were sacrificed.The remaining 20 mice of each group were kept till 6 months.From the LI group,we randomly selected 15 mice and injected triiodothyronine （T3,100 μg/kg body weight per day） intraperitoneally for 24,48 or 72 hours （5 mice for each time-point）.Then,all the mice were sacrificed.Mouse serum thyroxine （T4）,T3,and thyroid-stimulating hormone （TSH） levels were determined by chemiluminescence immunoassay （CIA）.The protein content or messenger RNA （mRNA） level of thyroid MCT8 was measured by Western blotting analysis or real time RT-PCR respectively.MCT8 subcellular location in thyroid tissues was probed with immunohistochemistry （IHC） assay.Results We found that mouse serum T3 and T4 levels decreased and TSH level increased by the end of the third month.Consistent with these findings,there was significant goiter and hypothyroidism in the LI group.Meanwhile,the MCT8 mRNA increased to 1.36-fold of the level in the control group at the 3rd month.At 6th month,the serum T4 level in LI mice remained at a lower level,and MCT8 mRNA expression continued rising to nearly 1.60-fold compared with the control group.The protein content was al     

Cys C的原核表达载体构建和鉴定

目的:构建人胱抑素C(Cys C)的原核表达载体,为进一步表达纯化Cys C重组蛋白奠定基础.方法:从HL-60细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增Cys C基因,再将目的基因克隆至PET32a( )表达载体中,构建人Cys C原核表达质粒PET32a( )/Cys C;再将此重组子进行双酶切电泳鉴定和测序鉴定.结果:酶切电泳鉴定结果显示Cys C基因克隆入载体中,测序结果证实克隆的基因序列与GeneBank中的Cys C序列相符.结论:获得了人Cys C原核表达质粒PET32a( )/Cys C,为进一步表达和纯化Cys C重组蛋白奠定了工作基础.     

高锌对Caco-2细胞铁、锌含量及其调控基因mRNA表达的影响

目的:探讨高锌对小肠细胞铁、锌含量和铁、锌调控基因DMT1、IREG1、ZnT1及hZIP4 mRNA表达的影响.方法:以Caco-2细胞为小肠细胞体外模型,以锌浓度分别为4、50、100、 200 μmol/L的培养液培养24 h,用原子吸收分光光度计检测细胞内铁、锌含量,用RT-PCR方法检测DMT1、IREG1、ZnT1及hZIP4 mRNA表达,以GAPDH mRNA水平作为内参照.结果:高锌处理24 h后Caco-2细胞内锌含量升高,培养基锌浓度为50 μmol/L时达到高峰,而细胞内铁含量却随培养基锌浓度升高而降低.细胞内DMT1、IREG1、ZnT1 mRNA表达均出现上调,hZIP4 mRNA表达则发生下调.结论:补锌可以提高小肠细胞内锌含量,但会使细胞内铁含量下降.铁和锌在小肠中的吸收可能相互影响.     

Eotaxin原核表达载体的构建及初步表达

目的：获得人嗜酸性粒细胞趋化因子Eotaxin基因，构建其原核表达载体，并初步表达成熟的Eotaxin，为进一步构建其N-端突变体，检测其生物学活性作准备。方法：提取外周血单个核细胞细胞总RNA，经RT-PCR扩增编码人Eotaxin全长cDNA序列，并将其克隆至T载体进行序列测定，然后构建于原核表达载体pET30a^＋中，并转入大肠杆菌表达。结果：RT-PCR扩增得到了400bp左右的DNA片段，序列分析发现其中包含了GenBank中报道的编码EotaxincDNA序列，并获得了正确表达。结论：EotaxincDNA的克隆及其原核表达载体的构建及表达，为进一步构建其N-端突变体，纯化和检测其生物学活性奠定了基础。