脂联素减轻高糖诱导的人血管内皮细胞系损伤

目的 观察脂联素(APN)对高糖诱导血管内皮细胞系损伤的保护作用及NF-κB与LOX-1蛋白表达在其中的作用.方法 30 mmol/LD-葡萄糖作用于HUVEC-12(人脐静脉内皮细胞系),不同浓度的脂联素(10、20和40 μg/mL)作用48 h及20μg/mL脂联素作用不同时间(12、24、48和72 h)后,倒置相差显微镜观察内皮细胞形态,Western blot检测核转录因子NF-κB和LOX-1蛋白表达,间接免疫荧光法检测NF-κB核转位情况.结果 脂联素作用于D-葡萄糖诱导的HUVEC-12,内皮细胞形态改善,折光性增强,胞内颗粒物减少,细胞排列相对规整;同时,LOX-1蛋白表达下调(P＜0.05),NF-κB活性降低(P＜0.05),并呈现时间和浓度依赖性(n=3,P＜0.05).结论 脂联素可能通过NF-κB信号通路引起LOX-1蛋白表达下调,从而发挥其对高糖诱导血管内皮细胞损伤的保护作用.     

血管紧张素II对巨噬细胞(THP-1细胞)凝集素样氧化低密度脂蛋白受体表达的影响

目的:研究AngII对人单核/巨噬细胞(THP-1细胞)凝集素样氧化低密度脂蛋白受体(LOX-1)蛋白表达和基因转录的影响,从细胞蛋白、分子水平探讨AngII和巨噬细胞LOX-1相互之间的关系,以进一步了解两者在动脉粥样硬化中的地位。方法:将不同浓度AngII(1×10^-9-1×10^-5mol/L)与经0.1μmol/L佛波酯(PMA)诱导分化后的THP-1细胞共孵育24h,以及将1×10^-6mol/L浓度的AngII与诱导分化后的THP-1细胞作用不同时间0、3、6、12、24、48h后,用细胞酶联免疫法和半定量RT-PCR分别检测LOX-1蛋白和mRNA表达的情况。结果:未经诱导的THP-1细胞不表达LOX-1mRNA;而经PMA诱导后,THP-1细胞停止增殖,由单核细胞分化成为巨噬细胞,并表达LOX-1mRNA。不同浓度的AngII作用诱导分化后的THP-1细胞24h,细胞LOX-1蛋白和mRNA的表达呈浓度依赖性显著增加。同一浓度的AngII作用THP-1细胞,可呈时间依赖性诱导LOX-1蛋白和mRNA表达,其趋势是3h左右开始增加,24h左右至最高峰,之后逐渐减低。结论:经PMA诱导分化后的THP-1细胞表达LOX-1;AngII能明显增强分化后的THP-1细胞表达LOX-1蛋白和mRNA,并呈浓度和时间依赖性。AngII这种作用可能是促进动脉粥样硬化发生、发展的机制之一。     

霉酚酸酯对高糖培养下人肾小球系膜细胞MCP-1和FN表达的影响

目的:探讨高糖以及霉酚酸酯(MMF)对人肾小球系膜细胞(HMCs)单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和纤维连接蛋白(FN)表达的影响。方法:将培养的HMCs分为正常对照组(5 mmol/L葡萄糖);高糖组(30 mmol/L葡萄糖);甘露醇渗透压对照组(5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇);高糖+MMF-10组(30 mmol/L葡萄糖+10μg/mL MMF);高糖+MMF-100组(30 mmol/L葡萄糖+100μg/mL MMF),采用RT-PCR检测每组不同时间点(24、48、72 h)MCP-1 mRNA的表达,ELISA法检测培养上清液MCP-1及FN蛋白的表达。结果:高糖组HMCs MCP-1 mRNA、蛋白的表达及FN的分泌较正常对照组显著增加(P<0.01),且48 h表达最高;不同浓度的MMF均能下调MCP-1 mRNA、蛋白及FN的表达(P<0.01);不同浓度的MMF对MCP-1 mRNA、蛋白的表达及FN分泌的抑制程度不同,呈时间剂量依赖性(P<0.05)。结论:MMF可以阻抑MCP-1的表达及FN的分泌,可能对延缓肾小球硬化及间质纤维化有一定作用。     

氯沙坦通过ERK1/2 MAPK途径抑制高糖诱导小鼠系膜细胞CTGF表达

目的: 研究高糖环境下, 氯沙坦对CTGF的影响以及其作用机制.方法: 体外培养小鼠系膜细胞株(MMCs), 用高糖(25 mmol/L葡萄糖)刺激细胞分别作用24 h、 48 h、 72 h, 用Western blot方法检测磷酸化ERK1/2的表达.再将细胞分为低糖组(5.6 mmol/L葡萄糖), 山梨醇组(5.6 mmol/L葡萄糖+19.4 mmol/L山梨醇), 高糖组(25 mmol/L葡萄糖), 氯沙坦组(25 mmol/L葡萄糖+10-5 mol/L氯沙坦)以及 ERK抑制剂组(25 mmol/L葡萄糖+ 25 μmol/L PD98059), 48 h后采用Western blot方法检测磷酸化ERK1/2的表达, 72 h后采用Real-time PCR方法及Western blot分别检测 CTGF mRNA表达量以及蛋白的表达.结果: 高糖刺激小鼠系膜细胞后, ERK1/2磷酸化的蛋白表达逐渐增高, 呈现一定时间依赖性.与低糖组相比, 高糖组磷酸化ERK1/2、 CTGF的蛋白表达明显增加(P<0.01), 而与高糖组相比, 氯沙坦组以及ERK抑制剂组磷酸化ERK1/2的蛋白表达以及CTGF的蛋白均明显下降有统计学意义(P<0.05).与低糖组相比, 高糖组CTGF mRNA表达量明显增加(P<0.01), 而与高糖组相比, 氯沙坦组以及ERK抑制剂组CTGF mRNA表达量明显下降, 且有统计学意义(P<0.01).结论: 氯沙坦可抑制高糖对CTGF的诱导作用, 其机制可能与抑制ERK1/2 MAPK途径有关.     

葡萄糖对人脐静脉内皮细胞蛋白C受体表达的影响及吡格列酮的干预作用

目的:研究葡萄糖对人脐静脉内皮细胞蛋白C受体(EPCR)mRNA 表达的影响,以及吡格列酮的干预作用。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分别以流式细胞术和RT-PCR技术确认HUVECs膜上EPCR的表达水平和 mRNA 水平的表达。再分别以含不同浓度D-葡萄糖(5、10、30、50 mmol/L)的培养基以及含吡格列酮(5、10、20 μmol/L)或不含吡格列酮的高糖(50 mmol/L)培养基孵育HUVECs 24 h,行剂量和时间依赖性实验,并采用实时定量PCR技术测定HUVECs细胞 EPCR mRNA 的表达。结果:随着培养基D-葡萄糖浓度的增加,HUVECs培养24 h后其EPCR mRNA 的表达逐渐下调。在采用吡格列酮干预后, 50 mmol/L高糖处理的HUVECs EPCR mRNA 表达的下调得到明显改善。结论:(1)EPCR 在HUVECs上高表达,高糖可通过下调EPCR mRNA 的表达而损伤内皮细胞功能。(2)吡格列酮可阻止高糖诱导的HUVECs EPCR mRNA表达的下调,从而保护内皮细胞功能。     

同型半胱氨酸对培养的人脐静脉内皮细胞巨噬细胞炎性蛋白1α表达的影响

目的:探讨同型半胱氨酸是否诱导培养的人脐静脉内皮细胞表达巨噬细胞炎性蛋白1α。方法:在内皮细胞培养基中分别加入终浓度为0.1mmol/L、0.5mmol/L、和1mmol/L的同型半胱氨酸, 孵育8h, 用原位杂交法检测其巨噬细胞炎性蛋白1αmRNA的表达, 用细胞酶联免疫吸附实验(ELISA)检测其巨噬细胞炎性蛋白1α蛋白的表达。结果:原位杂交显示, 培养的人脐静脉内皮细胞能低水平表达巨噬细胞炎性蛋白1αmRNA, 为胞质内紫蓝色颗粒。培养的内皮细胞暴露于梯度浓度的同型半胱氨酸后其胞质内的巨噬细胞炎性蛋白1αmRNA明显增加, 并呈剂量依赖关系, 组间差异极为显著(P＜0.01);细胞ELISA显示, 随着同型半胱氨酸浓度的升高, 各实验组内皮细胞巨噬细胞炎性蛋白1α蛋白的表达逐步升高, 组间差异亦极显著(P＜0.01)。结论:同型半胱氨酸能诱导内皮细胞表达巨噬细胞炎性蛋白1αmRNA和蛋白, 可能在单核细胞向动脉内膜的募集中起重要作用。     

LOX-1介导ox-LDL诱导的血管内皮细胞MCP-1的表达

目的：观察血凝素氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）对氧化LDL（ox-LDL）诱导的人脐静脉内皮细胞(human unbilical vein endothelial cells, HUVECs)表达单核细胞趋化蛋白（monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1）基因及蛋白的影响。 方法： 用RT-PCR和Western blot的方法观察ox-LDL对培养的HUVECs表达LOX-1和MCP-1基因及蛋白的影响，然后用LOX-1的受体阻滞剂爱兰苔胶（carrageenan） 和聚肌苷酸［polyinosinic acid，poly(I)］与HUVECs预先作用后，再观察内皮细胞表达LOX-1和MCP-1基因和蛋白的变化。 结果： 用不同浓度的ox-LDL（0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L 、50 mg/L、100 mg/L）与HUVECs培养24 h后，LOX-1和MCP-1的mRNA和蛋白的表达明显增加，呈浓度依赖性；用Carrageenan 和polyinosinic acid与HUVECs预先作用2 h后，再加入50 mg/L的ox-LDL培养24 h，与未加Carrageenan和polyinosinic acid相比，HUVECsLOX-1和MCP-1的mRNA和蛋白的表达明显减少。 结论： ox-LDL可以调节培养的HUVECsLOX-1和MCP-1基因和蛋白的表达，LOX-1作为ox-LDL的特异性受体，可能介导了ox-LDL诱导血管内皮细胞分泌MCP-1，从而在动脉粥样硬化的发生发展中起着重要的作用。     

高糖诱导人肾小球系膜细胞CTGF启动子去甲基化及基因表达

目的:观察高糖刺激和甲基化抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-dCyd)对人肾小球系膜细胞(HMCs)结缔组织生长因子(CTGF)基因启动子的甲基化水平和基因表达的影响.方法:用不同终浓度的5-aza-dCyd(0、1、2、5、10 μmol/L)刺激HMCs,于48h提取细胞基因组DNA、总RNA和蛋白质;用不同浓度的葡萄糖(5 mmol/L、30 mmol/L)刺激细胞,于0、24、48、72 h收集细胞;应用甲基化特异性PCR(MSP)检测细胞CTGF基因启动子甲基化状态,RT-PCR检测CTGFmRNA表达,Western blot检测 CTGF 蛋白表达.结果:不同浓度5-aza-dCyd处理HMCs 48 h后,0、1、2、5 μmol/L 5-azadcyd组CTGF基因启动子呈半甲基化状态,均有微量CTGFmRNA和蛋白的表达,差异无统计学意义(均P＞0.05);10 μmol/L 5-aza-dCyd组甲基化条带阴性,呈完全去甲基化状态,CTGF mRNA和蛋白表达均增加,与0 μmol/L组比较差异有统计学意义(P＜0.01).5 mmol/L葡萄糖组HMCs各时间点CTGF基因启动子均呈半甲基化状态,表达微量CTGFmRNA和蛋白质,差异无统计学意义(均P＞0.05);30 mmol/L葡萄糖组CTGF启动子在0 h呈半甲基化状态,甲基化条带较强;24 h甲基化条带减弱,48 h甲基化条带阴性,呈完全去甲基化状态,24 h、48 h、72 h CTGF mRNA和蛋白质表达均增加,与5 mmol/L组相应时间点比较差异有统计学意义(均P＜0.05).结论:高糖和甲基化抑制剂5-aza-dCyd均可诱导人肾小球系膜细胞CTGF基因启动子的去甲基化并增加CTGF的表达,提示DNA甲基化可能参与了人肾小球系膜细胞CTGF基因表达的调控.     

同型半胱氨酸对人THP-1巨噬细胞IL-8 mRNA及其蛋白表达的影响

目的:探讨同型半胱氨酸(Hcy)对人THP-1巨噬细胞IL-8 mRNA的表达和IL-8分泌的影响。方法:在由0.1 μmol/L佛波脂(PMA)诱导分化的人THP-1巨噬细胞中加入不同浓度的Hcy,并孵育不同时间。用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清液中IL-8蛋白的含量,用半定量RT-PCR法检测IL-8 mRNA表达。结果:经PMA诱导后,THP-1细胞贴壁生长,分化成巨噬细胞。在一定浓度范围之内,Hcy呈剂量依赖性刺激THP-1巨噬细胞分泌IL-8蛋白,0.05 mmol/L Hcy即可促进其分泌增加为对照组的1.28倍(P<0.01);0.20 mmol/L Hcy使IL-8的产量增加到对照组的1.55倍(P<0.01)。0.10 mmol／L Hcy干预后,IL-8蛋白在3 h即高于对照组,到48 h仍明显高于对照组。半定量RT-PCR结果也显示Hcy能刺激IL-8 mRNA表达,呈剂量和时间依赖关系。结论:Hcy能促进人THP-1巨噬细胞IL-8 mRNA表达和分泌IL-8蛋白。这可能为其诱导动脉粥样硬化的重要机制之一。     

JNK信号通路介导高糖诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖

 目的 明确c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路在高糖诱导大鼠心肌成纤维细胞增殖中的作用。方法 提取大鼠原代心肌成纤维细胞,观察不同糖浓度（12、18和25 mmol/L葡萄糖）和不同刺激时间（0、12、24和48 h）对JNK通路的影响。实验分为对照组（5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖组（25 mmol/L葡萄糖）、JNK抑制剂SP600125组（25 mmol/L葡萄糖+SP600125 10、20 μmol/L）和高渗组（5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇）培养48 h,应用MTT测定细胞增殖、Weastern blot测定JNK磷酸化水平和增殖细胞核抗原（PCNA）的蛋白表达、RT-PCR检测c-jun基因表达。结果 高糖呈时间和剂量依赖性增加JNK磷酸化水平。与对照组比较,高糖显著地促进了心肌成纤维细胞的增殖（0.44±0.02 vs 0.31±0.02, P<0.01）,并上调了c-jun的基因表达和PCNA蛋白水平。 SP600125能够浓度依赖性地抑制高糖诱导的细胞增殖和JNK通路的激活。结论 JNK信号通路部分地介导了高糖诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖。     

核转录因子κB抑制剂PDTC对高糖培养大鼠肾成纤维细胞VEGF和PEDF表达的影响

目的:探讨核转录因子κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)对高糖培养大鼠肾成纤维细胞(NRK)血管内皮生长因子(VEGF)及色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响。方法:NRK按培养条件分为常糖组:5.6mmol/L葡萄糖;高糖A组:15mmol/L葡萄糖;高糖B组:30mmol/L葡萄糖;PDTC对照组:5.6mmol/L葡萄糖+5.0μmol/LPDTC;PDTCA组:15mmol/L葡萄糖+10μmol/LPDTC;PDTCB组:30mmol/L葡萄糖+20μmmol/LPT-DC。采用半定量RT-PCR方法及ELISA测定各组培养24h、48h后NRK的VEGF及PEDFmRNA及蛋白的表达。结果:与常糖组相比,高糖各组NRK的VEGF蛋白含量及mRNA表达明显升高(P<0.01,P<0.05);与高糖B组相比,PDTC干预各组NRK的VEGF蛋白含量及mRNA表达呈下降趋势(P<0.01,P<0.05)。与常糖组相比,高糖各组NRK的PEDF蛋白含量及mRNA表达明显下降(P<0.01,P<0.05);与高糖B组相比,PDTCB组NRK的PEDF蛋白含量及mRNA表达明显升高(P<0.01)。结论:PDTC能明显抑制高糖培养大鼠NRK的VEGF表达并明显上调PEDF的表达,间接提示NF-κB可能通过参与VEGF和PEDF的表达失衡导致糖尿病肾病(DN)的发生。     

糖皮质激素诱导的蛋白激酶3种亚型在高糖诱导的人肾小管上皮细胞中的表达

目的：研究高糖环境下人近端肾小管上皮细胞（HKC）中血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶（SGK）3种亚型SGK1、SGK2和SGK3的表达，探讨SGK 3种亚型在介导高糖致肾小管上皮细胞过度合成细胞外基质（ECM）中的作用。 方法: 将细胞分为对照组、高糖组和渗透压对照组。分别采用RT-PCR方法和Western blotting方法检测SGK1、SGK2和SGK3 mRNA水平和SGK1蛋白水平的表达，ELISA方法和间接免疫荧光方法检测培养液中和HKC胞内纤连蛋白（FN）含量。 结果: HKC细胞中存在SGK1、SGK2和SGK3的表达。高糖刺激下， SGK1、SGK2和SGK3 mRNA和SGK1蛋白表达明显升高（P<0.01）；同时伴有HKC FN合成和分泌的增加，这与SGK上调存在一定联系。 结论: 高糖能促进近端肾小管上皮细胞SGK1、SGK2和SGK3的表达，并可能通过SGK1、SGK2和SGK3介导的信号转导途径促进细胞外基质积聚，可能在糖尿病肾病的发生和发展中发挥致病作用。     

Snail1 siRNA 对高糖诱导肾小管上皮细胞表型转变的影响

目的： 观察Snail1 siRNA对高糖诱导的肾小管上皮细胞向间充质细胞转变（TEMT）的影响。方法: 原代培养肾小管上皮细胞分为5组：（1）对照组（含糖5.5 mmol/L）;（2）高糖组（含糖25 mmol/L）;（3）Snail1 siRNA处理组,转染Snail1 siRNA,6 h后更换为高糖（含糖25 mmol/L）培养;（4）control siRNA处理组,转染control siRNA作为siRNA阴性对照,6 h后换为高糖（含糖25 mmol/L）培养;（5）高渗组（含D-manntio19.5 mmol/L）;72 h后收集细胞,用Western blotting和半定量RT-PCR检测Snail1、TGF-β1、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、vimentin和E-cadherin蛋白和mRNA表达。结果: 与高糖组比较,肾小管上皮细胞转染Snail1 siRNA后,Snail1 mRNA和蛋白表达水平分别下降62%和68%（P<0.01）。同时,Snail1 siRNA处理组α-SMA和vimentin蛋白和mRNA表达显著下调（P<0.01）,而E-cadherin蛋白和mRNA表达显著上调（P<0.01）。结论: Snail1参与了高糖诱导TEMT的调节。     

活性氧介导高糖负荷致人系膜细胞癌胚纤维连接蛋白的表达

背景：研究发现,癌胚纤维连接蛋白系新合成细胞外基质的重要标志,而高糖环境氧化应激与癌胚纤维连接蛋白的关系尚未见报道。 目的：观察高糖作用对人系膜细胞活性氧和癌胚纤维连接蛋白mRNA表达的影响。 方法：将培养的系膜细胞分为以下各组：正常对照组(5 mmol/L D-葡萄糖);渗透压对照组(5 mmol/L D-葡萄糖+           20 mmol/L L-葡萄糖);高糖组(25 mmol/L D-葡萄糖);α-硫辛酸干预组,分为高糖+LA50组(25 mmol/L D-葡萄糖+        50 μmol/L α-硫辛酸)、高糖+LA100组(25 mmol/L D-葡萄糖+100 μmol/L α-硫辛酸)、高糖+LA200组(25 mmol/L D-葡萄糖+  200 μmol/L α-硫辛酸)。以RT-PCR法检测癌胚纤维连接蛋白mRNA表达水平,荧光显微镜和荧光酶标仪测定细胞内活性氧水平。 结果与结论：高糖促进系膜细胞活性氧的产生,亦增加癌胚纤维连接蛋白mRNA的表达,α-硫辛酸可显著降低高糖负荷下细胞内活性氧水平,同时减少癌胚纤维连接蛋白mRNA的表达,且呈浓度依赖性,提示活性氧介导高糖负荷致人系膜细胞癌胚纤维连接蛋白的表达,α-硫辛酸可部分逆转这一效应。     

PPAR-α参与高糖高胰岛素诱导的心肌细胞肥大

目的： 研究过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPAR-α）在高糖高胰岛素(HGI)诱导心肌肥大中的作用。方法: 利用乳鼠心肌细胞培养,以细胞表面积、蛋白含量和心房利钠因子（ANF)mRNA表达为心肌肥大反应指标,观察PPAR-α激动剂非诺贝特（FF）对HGI致肥大作用的影响。利用RT-PCR和Western blotting方法检测mRNA及蛋白水平的表达。结果: HGI诱导细胞表面积、总蛋白含量和ANF mRNA表达增加（P<0.01）;但PPAR-α mRNA和蛋白的表达明显降低（P<0.05）;而其下游因子环氧酶-2（COX-2）的表达则增加（P<0.05）。FF浓度依赖性地抑制HGI诱导的心肌细胞肥大（P<0.01）,并上调PPAR-α的表达,同时阻遏COX-2的表达（P<0.05）。PPAR-α阻断剂MK 886可完全取消FF的上述作用（P<0.05）,使COX-2表达增加至HGI模型组水平。结论: PPAR-α可能参与了HGI诱导的心肌肥大,同时COX-2可能是其重要下游因子。     

同型半胱氨酸对大鼠血管平滑肌细胞分泌和表达IL-6的影响

目的:探讨同型半胱氨酸(Hcy)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)分泌和表达促炎性细胞因子白细胞介素-6(IL-6)的影响。方法:在大鼠主动脉平滑肌细胞培养基中加入不同浓度的Hcy, 并孵育不同时间。用ELISA法检测培养上清IL-6蛋白含量, 用半定量RT-PCR法检测IL-6mRNA表达。结果:0.25mmol/LHcy干预后, IL-6在6h开始高于对照组; 4.达峰值, 48h仍较对照组高;并且在一定的浓度范围内, Hcy呈剂量依赖性刺激VSMCs产生IL-6, 01mmol/L及0.25mmol/LHcy分别使IL-6产量较对照增多1.4和3.4倍。RT-PCR结果显示Hcy能刺激IL-6mRNA表达, 也呈剂量和时间依赖关系。结论:Hcy能促进VSMCs产生和表达IL-6、激活血管壁炎症反应, 这可能为其诱导动脉粥样硬化的重要机制之一。     

EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞P53蛋白表达的影响

目的:研究EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)对鼻咽癌细胞P53蛋白表达的影响。方法:将LMP1基因真核表达质粒转染至鼻咽癌CNE1细胞,脂质体介导端粒酶反义核酸处理转染细胞,MTT法检测细胞增殖能力,免疫组化法检测LMP1和P53蛋白表达,原位杂交技术检测端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达。 结果:对照组,转染并表达LMP1基因的细胞的增殖能力、P53蛋白和hTERT mRNA表达水平均显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞。端粒酶反义核酸作用组,LMP1基因转染细胞的LMP1蛋白表达水平显著低于对照组(P＜0.01);LMP1基因转染细胞与未转染细胞和转染空载质粒的细胞的增殖能力、P53蛋白和hTERT mRNA表达水平均显著低于对照组(P＜0.01),但LMP1基因转染细胞的增殖能力和P53蛋白表达水平仍显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞(P＜0.01)。 结论:EB病毒LMP1可促进鼻咽癌细胞P53蛋白的表达。