PCR-ELISA检测TB DNA方法的建立及其初步应用

目的 建立灵敏，快速，特异的PCR-ELISA检测结核菌DNA的方法。方法 用一对生物素标记的上游引物和未标记的下游引物对TBIS6110的一段DNA进行快速PCR扩增，使扩增产物的一条链上带有生物素，同时PCR反应液中存在有地高辛的标记的检测探针，随着PCR的结束，探针与生物素标记的扩增产物形成特异的杂交体，该杂交体通过链霉亲和素被固定在微孔板表面，然后用标记有过氧化物酶的地高辛抗体与杂交体上的地高辛结合，漂洗后加底物显色。测定吸光度值（A450nm)。结果 该方法灵敏，特异，快速，可以检测出10copies的模板量，对临床60例痰标本进行培养法。结论 该方法适用于临床进行快速的TB基因检测，也可用于其它病原体的检测。     

荧光探针结合区序列突变对HBV DNA检测的影响

目的探讨标本荧光探针结合区序列突变对荧光定量PCR检测HBV DNA的影响。方法采用3种国产荧光定量PCR试剂对200例标本进行平行检测HBV DNA,分析3种试剂检测结果的差异,并对6例3种试剂检测结果无差异的标本和6例达安试剂检测结果明显降低或漏检标本进行测序。结果 3种试剂检测结果相差30倍以上的标本47例,且3种试剂均有不同程度的漏检;6例3种试剂检测结果无差异的标本荧光探针结合区序列无突变,6例达安试剂检测结果明显降低或漏检的标本荧光探针结合区序列均有突变。结论标本荧光探针结合区序列突变是造成达安试剂检测HBV DNA结果明显降低或漏检的原因。     

耐热AKP在高GC含量细菌染色体杂交方法中的应用

目的应用耐热碱性磷酸酶(AKP)于微孔板DNADNA杂交技术,建立高G C含量细菌染色体DNA同源性测定的特异性方法,为此类细菌的分类与鉴定奠定基础。方法细菌染色体DNA经分离纯化并变性后,直接非共价结合于固相微孔板中,与标有光标生物素的DNA探针进行杂交。借助抗生物素蛋白与生物素的特异性结合,通过与板上带有生物素的杂交体作用,使得链霉亲和素连接的耐热AKP固定于板上,根据底物加入后的酶促反应强度,定量判读杂交结果。结果微孔板中1μg/孔DNA的包被浓度与25～50ng/孔的生物素探针呈现较为理想的杂交结果,pH95TrisHcl缓冲液系耐热AKP的最佳作用条件。应用该法于高G C含量的分枝杆菌种间染色体同源性分析表明,方法具有敏感、特异、简便等优点。结论耐热AKP应用于微孔板定量杂交,可不受较高杂交和测定温度的影响,适用于高G C含量的结核杆菌等分枝杆菌属以及假单胞菌属的定性检测和同源性的定量分析。     

微流芯片定量检测血清HBV DNA

目的 选择一种能进行HBV DNA准确定量的检测方法。方法 比较内对照竞争PCR-微流芯片分析法与内对照竞争PCR-微孔板杂交法及PCR-微孔板杂交法在血清HBV DNA检测上的优劣。结果 微流芯片分析的线性范围高于两种微孔板杂交．前者标本稀释试验线性相关较好，后者则寿在滞现象。结论内对照竞争PCR-微流芯片分析法检测HBV DNA特异性强灵敏度高。     

一种HBV DNA 定量检测试剂的准确性分析

目的 评价一种新型HBV DNA 定量检测试剂的准确性。方法 将第3 代HBV DNA WHO 国 际标准品稀释为6 种不同梯度浓度样本,8.5×105、8.5×104、8.5×103、8.5×102、85 及42.5 IU/ml,用待评价 试剂careHBV PCR Assay V3.0 检测,并对实测值和理论值进行相关性分析;以Cobas Taqman HBV V2.0 为参 比试剂,用careHBV PCR Assay V3.0 检测93 份HBV 感染者标本和30 份健康者标本HBV DNA 含量,并对2 种试剂定量检测结果进行相关性和一致性分析;采用巢式PCR 扩增漏检标本的HBV S 区,直接测序法测定 其基因型。结果 careHBV PCR Assay V3.0 检测WHO 国际标准品的实测值和理论值具有线性相关;2 种定 量试剂检测93 份HBV 感染者标本结果均阳性共68 份,检测结果呈线性相关,差异无统计学意义（P >0.05）, 但careHBV PCR Assay V3.0 检测值相对偏低;careHBV PCR Assay V3.0 检测有14 份标本漏检,其中13 份标 本Cobas Taqman HBV V2.0 检测结果位于30 ～ 2 000 IU/ml 间;对1 份漏检标本的基因型检测结果为C 型。 结论 careHBV PCR Assay V3.0 与Cobas Taqman HBV V2.0 试剂检测结果有较好的相关性,但对基因型C 型 的标本可能存在漏检现象。     

猴免疫缺陷病毒(SIV)实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒(SIV)TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法 RT-PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796 bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD-SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIV QPCR检测方法,质粒DNA模板在107～102拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3.26,相关系数为0.999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV%均小于1%。结论建立的SIV QPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)核酸拷贝量。     

新型TaqMan-MB荧光探针测定古DNA模板含量

目的:设计荧光检测探针,对古DNA样本中的线粒体DNA片段进行定量分析,并对其检测效果进行评价。方法:利用分子信标的茎环结构和TaqMan的降解作用设计一种新型的TaqMan-Molecular Beacon荧光检测探针,与实时PCR仪联用,对古DNA模板进行定量检测。结果: 5个古代样本中3个测得拷贝数,1个无法观察到原始模板量,1个样本无原始模板。结论: TaqMan-MB荧光探针集中了分子信标和TaqMan的技术优势,对古DNA模板具有很好的定量检测效果。     

双内标PCR-ELISA定量检测技术的建立

目的:建立双内标PCR-ELISA定量检测方法,并进行标定评价.方法:制备了两种与HIV-1野生扩增片段等长的PCR 内参照HS和LS,设计了一对HIV-1 基因组gag区基因扩增引物,下游引物的5′端用地高辛修饰,可同时扩增115 bp左右的野生型和两种内参照片段.设计三套捕获探针,其5′端用生物素(Biotin)修饰,可分别与竞争PCR 产物中的野生片段和两种突变型片段杂交.同一反应管内,加入已知量但不同浓度的两种内参照及待测HIV-1 DNA标准品,它们将以相同的效率在同一个PCR管内被同时扩增并标记,酶联杂交法进行产物分析,结果用公式计算得出每单位体积待测标本中HIV-1的DNA含量.结果:公式计算出的HIV-1拷贝数与实验加入的HIV-1拷贝数这两组变量具有良好的线性关系,相关系数0.9998,批内变异系数9.48%,结果误差平均在12.58%,无非特异性扩增.结论:建立了双内标PCR-ELISA定量检测方法,该方法具有特异、灵敏、成本低等特点,利于在临床实验上推广.     

不对称PCR杂交显色方法的建立及其对HBV DNA的检测

目的：建立一种灵敏、快速、特异的检测ＨＢＶ ＤＮＡ ＰＣＲ产物的杂交显色方法．方法：使用一个生物素标记的上游引物对ＨＢＶ ＤＮＡ进行不对称ＰＣＲ扩增,使扩增出的单链带有生物素,并可结合在固定有链亲合素的微孔板表面．用标有辣根过氧化物酶的探针与固定的单链ＰＣＲ产物杂交,而后加底物显色测定吸光值。结果：该方法比常规的琼脂糖凝胶电泳法更特异,而且灵敏度高１０倍￣１００倍,对简便处理的标本适应性强,具有良     

实时荧光定量PCR检测沙眼衣原体的研究

目的 采用TaqMan探针建立检测沙眼衣原体的实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法.方法 根据沙眼衣原体外膜蛋白A的基因(ompA)序列设计引物和探针,以克隆的ompA部分基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量检测方法.结果 建立的荧光定量PCR检测方法的最低检出限为5 copies/反应,检测线性范围100107线性关系良好(r2=0.997),比巢式PCR敏感100倍;且与鹦鹉热衣原体、淋球菌、解脲脲原体、大肠杆菌等病原菌DNA以及人基因组DNA均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性.以巢式PCR作参比,建立的荧光定量PCR法检测沙眼衣原体的阳性符合率为100.00％,阴性符合率为95.09％,总符合率为96.81％.结论 建立的检测沙眼衣原体实时荧光定量PCR具有特异性强和敏感性高的特点,可快速检测样本中微量沙眼衣原体DNA,适用于对沙眼衣原体进行大规模筛选.     

LightCycler实时监测PCR定量分析血清HBV DNA

目的 检验LightCycler实时监测PCR（real-time detection PCR,RTD-PCR)对血清中HBV DNA定量检测的灵敏性和可重复性，探讨HBV血清标志物与HBV DNA定量的关系。方法 HBV定量按深圳匹基公司乙肝PCR荧光检测试剂盒使用说明，对乙肝标志物已明确的773例血清中HBV DNA定量结果进行统计分析。结果 实时监测PCR对血清中HBV DNA定量检测的灵敏性高，可检测低至1000拷贝／ml血清；可重复性好，批间误差＜20％；各种标志物类型的血清HBV DNA含量分布情况表明，HBV血清标志物中HBeAg与HBV DNA含量有明显的关系，一般HBeAg阳性血清HBV DNA含量较高，但也有相当一部分例外。结论 LightCycler实时监测PCR对血清中HBV DNA定量检测灵敏性高可重复性好；仅根据HBV血清标志物往往不能确定乙肝患者HBV DNA复制水平的高低，HBV DNA定量检测具有十分重要的临床意义。     

应用分子信标荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒核酸的评价

目的：分子信标(Molecular Beacon)是近年新发展的一种荧光标记发夹形寡核苷酸探针。本目的在于对国产分子信标荧光PCR定量检测HBV核酸试剂盒(厦门泰伦生物工程有限公司的“乙型肝炎病毒荧光PCR定量检测试剂盒”)的主要性能进行评价。方法：以Roche公司的乙型肝炎病毒(HVB)定量检测试剂盒AMPLICOR HBV MONITOR^TM Test Kit为参比,对分子信标定量检测临床血清标本HBV DNA的结果,进行比较和分析。结果：根据两种试剂盒定量检测34份乙型肝炎和非肝炎血清及一份系列10倍稀释血清(含高水平HBV DNA)的数据,并以Roche试剂盒的结果为参比标准,分子信标试剂盒定量检测HBV DNA的相对敏感性、特异性和符合率均为100％(分别为：19／19,15／15和34/34);其定量检测HBV DNA的线性范围和下限分别为10^3～10^3copies/ml和10^3copies/ml;两种试剂盒定量检测HVB DNA的相关系数(r)＝0．987。结论：初步结果表明：该国产分子信标荧光PCR定量检测HBV核酸试剂盒的主要性能,与Roche公司的AMPLICOR HBV MONITOR^TM Test试剂盒相似,并具有较后更宽的线性定量范围。     

乙型肝炎患者治疗后血清中e抗原与病毒DNA水平的关系

目的 通过对乙型肝炎病毒血清学标志物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBcIgG)的检测及内标、外标两种聚合酶链反应(PCR)方法 检测乙型肝炎病毒载量的比对,更好地了解人体内乙型肝炎病毒携带情况,指导临床诊治.方法对经治疗后丙氨酸氨基转移酶(ALT)/天冬氨酸氨基转移酶(AST)正常、COBAS AMPLICOR定量PCR(内标法)检测不到乙肝病毒DNA(HBV-DNA)、用Abbott AxSYM微粒子酶免分析法(MEIA)检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性、表面抗体(抗-HBs)阴性、e抗原(HBeAg)阳性(HBeAg＞4 S/CO)、抗-HBe阴性、抗-HBcIgG阳性的42例血清,再用上海复星长征医学科学有限公司提供的HBV-PCR外标法荧光定量检测试剂盒,Light Cycler实时荧光定量PCR仪检测.结果 42例ALT/AST正常,HBeAg阳性(HBeAg＞4 S/CO以上),HBeAg的平均值42.26 S/CO.COBAS AMPLICOR定量PCR(内标法)未检测到HBV-DNA(＜300拷贝/ml)的血清;用Light Cycler定量PCR仪(外标法)检测HBV-DNA,有7例为阳性,7例HBV-DNA的平均含量3.1×105拷贝/ml,,阳性率17%.结论 乙型肝炎病毒e抗原阳性并不说明体内病毒复制一定活跃.经治疗后,病毒复制下降,部分患者e抗原仍阳性,e抗原何时消失有待进一步研究.血清学标志与HBV复制状态存在不一致性,兼顾内、外标两种PCR方法检测HBV-DNA更客观.     

竞争PCR用于乙肝病毒DNA定量检测初探

目的　评估竞争PCR这种检测方法的临床有效性。方法　用竞争PCR和荧光定量PCR两种方法对同一组患者血清HBVDNA进行了定量检测。竞争PCR是通过聚合酶链反应过程中竞争子和目的乙肝病毒DNA竞争同一反应管内的同一引物 ,通过凝胶成像比较目的乙肝病毒DNA和已知量竞争子的亮度 ,推测出目的DNA的含量。再将其结果与荧光定量PCR的结果相比较。结果　竞争PCR与荧光定量PCR检测的结果一致。结论　运用竞争PCR的方法对乙肝病毒DNA进行定量检测结果精确、成本较低 ,简便快速、易于操作 ,可推广使用。     

血清中HBV cccDNA定量检测方法的建立及临床应用

目的 建立一种以TaqMan为探针检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（cccDNA）的实时定量PCR检测方法。方法 根据rcDNA与cccDNA结构差异,在缺口两侧设计引物,应用TaqMan探针分析,对实时PCR产物进行克隆、测序以证实产物为目的片段;同时对89例符合病毒性乙型肝炎诊断标准的血清样本进行HBV cccDNA和HBV DNA含量检测,3例未感染乙肝病毒的血清作为阴性对照。结果 测序结果显示扩增产物为目的片段,检出下限为500 copies/mL;89例样本检测HBV cccDNA的阳性率为55.0%,HBeAg阳性患者阳性率为67.8%,HBeAb阳性患者阳性率为30.0%,HBeAg阳性的样本的平均HBV cccDNA水平高于HBeAb阳性的样本（P<0.05）,阴性对照组未检测出HBV cccDNA。应用ROC曲线图评价HBV cccDNA在抗病毒治疗中的价值,其价值为0.927。结论 以TaqMan为探针检测血清HBV cccDNA的实时PCR检测方法的建立,具有快速、敏感、特异性高等特点,应用该方法检测HBV cccDNA含量可作为判断临床抗病毒治疗效果的重要参考指标,指导临床用药。     

乙肝病毒血清标志物与DNA定量联合检测的临床应用价值

目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）两对半抗原抗体系统、前S1蛋白（Pre-S1）和HBV脱氧核糖核酸（HBV-DNA）之间的关系及临床意义。方法用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清标志物,用荧光定量PCR检测HBV-DNA。结果A组（HBsAg^＋HBeAg^＋抗HBc^＋）HBV-DNA、Pre-S1阳性率为98.63%、86.30%;B组（HBsAg^＋抗HBe＋抗HBc^＋）HBV-DNA、Pre-S1阳性率为48.37%、22.22%;C组（其它模式）HBV-DNA、Pre-S1阳性率为4.96%、0.83%。HBV-DNA定量结果A组显著高于B、C两组（P〈0.01）;B组显著高于C组（P〈0.05）。结论正确合理地分析HBV血清学指标出现的类型,与HBV-DNA的联合动态检测有助于临床诊断、疗效观察及预后判断。     

PCR与ELISA检测乙肝病毒的对比及临床意义

目的 探讨荧光PCR法检测HBV-DNA定量ELISA定性检测乙肝病毒标志物临床价值比较.方法 取受试者空腹血清标本同时以荧光定量PCR法检测HBV-DNA和酶联免疫法捡测乙肝病毒两对半.结果 HBV-DNA定量在9.99×10^8 IU/mL～1.00×10^6 IU/mL之间的404例,大三阳比例为85.89％;HBV-DNA定量在9.99×10^5 IU/mL～1.00×10^3 IU/mL之间的416例,小三阳比例为59.38％;HBV-DNA定量在1.00×10^3 IU/ml～1.00×10^2 IU/mL的140例中,HBsAg、HBcAb阳性患者比例为71.43％;HBV-DNA定量＜1.00×102 IU/mL的992例中,HBsAg、HBeAg阴性模式比例为95.67％.结论 荧光定量PCR法检测HBV-DNA和ELISA定性检测HBV表面标记物呈正相关,即HBV-DNA拷贝数多的以大三阳居多,HBV-DNA拷贝数少的以无传染性病毒携带者和阴性者居多.荧光定量PCR可以直接反映体内乙肝病毒感染状态及病毒载量情况,较ELISA更利于判断疾病的严重程度和传染性,更有利于指导临床药物选择和疗效观察.     

乙肝病毒复制是慢性肝病活动的直接原因

聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测４８例ＨＢｓＡｇ（＋），抗ＨＢｅ（＋）慢性肝病患者血清ＨＢＶＤＮＡ，３８例阳性，１０例阴性．１０例ＰＣＲ阴性产物用狄高辛素标记探针进行斑点杂交，又检出６例ＨＢＶＤＮＡ阳性，ＨＢＶＤＮＡ总阳性率为９２％，ＨＢＶＤＮＡ阳性患者丙氨酸转氨酶（ＡＬＴ）水平均增高，而阴性患者ＡＬＴ在正常水平。结果表明，此类病人体内存在ＨＢＶ复制，导致病变持续活动甚至加重。     

用荧光探针定量多聚酶链反应技术检测乙肝病毒宫内传播的研究

目的探讨孕妇血中乙肝病毒(HBV)DNA数量与宫内传播的关系.方法用荧光探针定量多聚酶链反应(FQ-PCR)方法,检测76例乙肝病毒表面抗原(HBsAg)阳性孕妇血清中HBV DNA数量.26例HBV DNA阳性者肌注乙肝免疫球蛋白,新生儿出生后24h内取末梢静脉血检测HBV DNA.结果孕妇血中HBV DNA阳性者其宫内感染率为33.3%,宫内感染与孕妇血中HBV DNA数量有关,HBV DNA数量高易导致胎儿宫内感染,乙肝免疫球蛋白免疫注射后可降低HBV宫内感染率.结论孕妇血中HBV DNA数量高易导致胎儿宫内感染,孕期应用乙肝免疫球蛋白可减少宫内传播.     

鸭乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR方法的建立及应用

目的：建立鸭乙型肝炎病毒核酸(DHBV DNA)荧光定量的方法。方法：根据DHBV DNAS基因区的序列设计扩增所需3条引物，通过偶联反应用AmpliSensor荧光信号标记半巢式引物，经过前期不对称扩增、半巢式扩增及在线检测建立DHBV DNA阳性标准品QPCR的标准曲线，并将70份鸭血清分别用荧光定量PCR方法和地高辛标记的DHBV DNA探针斑点杂交的方法检测，比较结果的相关性。结果：DHBV DNA阳性标准品经过30次循环后，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，可以看出有180bp、70bp两个片段，与设计的片段大小相符，扩增产物的浓度与标准品的起始浓度成正比，扩增指数的数值大小与该循环时己合成的扩增产物的量成正比，起始浓度的大小与要合成的一定扩增产物的量所需的循环次数成反比。用荧定量PCR方法和斑点杂交的方法检测血清中DHBV DNA的结果有良好的相关性(r＝0．97，P＜0.01，ν＝58)。结论：荧光定量PCR方法可作为检测DHBV DNA含量的一个重要手段。