胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的雪旺氏细胞修复大鼠周围神经缺损的实验研究

目的　从转基因角度探讨治疗周围神经损伤的有效方法。方法　成年Wister大鼠 4 8只 ,平均分为 3组。切断大鼠坐骨神经并形成 10mm长缺损 ,用硅胶管桥接两侧断端 ,管腔内植入胶质细胞源性神经营养因子 (glialcell linederivedneurotrophicfactor,GDNF)修饰的雪旺氏细胞 (schwanncells,SCs) ,正常SCs修复组和单纯硅胶管修复组作为对照 ,分别于术后 4、8、12和 16周对各组动物进行大体观察 ,肌电图测量 ,组织学切片观察 ,再生神经的神经电生理检测 ,GDNF免疫组化检测 ,组织学切片 ,观察和图像分析。结果　GDNF SCs组动物的神经传导速度、有髓神经纤维密度、神经组织面积、髓鞘厚度均显著优于SCs组和硅胶管组。结论　将GDNF基因修饰的雪旺氏细胞移植修复周围神经缺损 ,使局部释放的GDNF维持神经元存活 ,加快轴突再生速度以促进周围神经再生 ,此方法为将来治疗周围神经损伤提供了线索。     

嗅鞘细胞促进大鼠坐骨神经损伤后神经功能恢复

目的研究嗅鞘细胞（Olfactory ensheathing cells,OECs）移植对大鼠坐骨神经损伤后神经再生恢复的作用。方法取SD大鼠40只随机分成对照生理盐水（SAL）组和实验（OECs）组,予离断坐骨神经后直接予神经外膜缝合修复,在神经缝合处周围充填可吸收的明胶海绵,SAL组和OECs组明胶海绵内分别给予SAL和体外培养纯化的OECs;术后4、12周分别行大体观察,电生理检查和组织学检查。结果术后4、12周,SAL组和OECs组修复神经均有不同程度恢复,OECs组在运动神经传导速度、神经肌肉动作电位幅度和直径数据上有优于SAL组,但统计学上未见明显差异,而在有髓神经纤维数目方面明显优于SAL组（P〈0.05）。结论在本实验条件下,嗅鞘细胞（OECs）对大鼠坐骨神经损伤后的神经功能恢复有部分的促进作用。     

GDNF基因修饰的嗅鞘细胞移植联合IN-1注射修复大鼠急性脊髓损伤

目的 研究胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因修饰的嗅鞘细胞(OECs)移植联合轴突生长抑制蛋白抗体(IN-1)局部持续注射对大鼠急性横断性脊髓损伤(SCI)的修复作用.方法 构建载有GDNF基因的慢病毒(Lentivirus)载体并体外转染OECs,Western Blot检测GDNF的表达.用50只成年雌性SD大鼠建立胸脊髓全横断损伤模型,随机分为A(对照组)、B(IN-1微泵注射组)、C(OECs组)、D(GDNF-OECs组)和E(GDNF-OECs+IN-1组)5组各10只.应用神经丝蛋白200(NF200)单抗免疫组化、生物素化的葡聚糖胺(BDA),顺行神经追踪对SCI区神经纤维再生进行形态学观察.采用BBB评分评估大鼠后肢功能恢复情况.结果 术后共有13只大鼠死亡.术后8周可观察到Hoechst标记的OECs在体内存活并在脊髓内迁移;E组和D组可见SCI区杂乱无序的再生轴突,有连续性神经纤维通过损伤区;C组可见少量无序的再生轴突,可疑连续性神经纤维通过损伤区;B组和A组脊髓残端萎缩,未见轴突再生.A、B、C、D和E组后肢功能运动平均BBB评分分别为7.70±0.24、7.89±0.15、10.50±0.25、11.43±0.23和12.81±0.40.结论 GDNF-OECs移植联合IN-1抗体注射可有效促进损伤脊髓神经轴突的存活、再生,促进损伤脊髓的修复.     

去细胞异种神经复合骨髓基质干细胞修复周围神经缺损的实验研究

目的 探讨去细胞异种神经(acellular xenogeneic nerve,AXN)复合骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)修复周围神经缺损的效果.方法 体外培养大鼠BMSCs;取雌性Wistar大鼠60只,随机分为3组,每组20只,建立右坐骨神经10 mm缺损修复模型.A组:BMSCs与AXN复合修复神经缺损;B组:单纯AXN修复神经缺损;C组:自体神经移植组.术后4、12周依次进行干细胞的转归、移植免疫、神经电生理检测、新生神经组织学观察和小腿三头肌肌纤维横径等检测,判断坐骨神经功能恢复情况.结果 术后移植物内均可见细胞生长,A、C组细胞数目较多,排列整齐,只有A组S-100免疫组化染色阳性细胞内可见BrdU阳性表达,术后12周再生神经已通过远端缝合口.A组、C组组织学及电生理检测指标均优于B组(P＜0.05),A组与C组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 BMSCs作为种子细胞可以在体内存活,并可分化为SCs,其与AXN复合构建组织工程神经修复神经缺损的效果接近于自体神经移植.     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的雪旺细胞对大鼠坐骨神经缺损的修复作用

目的　研究胶质细胞源性神经营养因子 (glialcellline derivesneurotrophicfactor ,GDNF)基因对周围神经断伤后促进轴突再生及神经元的保护作用。方法　应用体外获取的GDNF修饰的雪旺细胞结合细胞外基质凝胶及生物可降解聚乳酸 聚羟基乙酸共聚物管 (polyCDL lactide co glycolide ,PLGA)构建的神经移植复合体 ,修复大鼠坐骨神经的缺损。 2 0只成年Wistar大鼠按桥接物的不同随机分为 4组 ,每组 5只。A组 :细胞外基质凝胶 PLGA管桥接组 ;B组 :雪旺细胞 细胞外基质凝胶 PLGA管桥接组 ;C组 :GDNF基因修饰的雪旺细胞 细胞外基质凝胶 PLGA管桥接组 ;D组 :自体神经桥接组。术后 12周检测运动神经传导速度 ,并进行再生神经的组织形态学观察以及计量学分析。结果　术后 12周 ,坐骨神经的运动神经传导速度 ,轴突数、髓鞘的厚度、神经纤维的直径、神经组织面积的百分比和脊髓前角运动神经元存活率等 ,C组均优于A、B组 (P <0 .0 1) ,而与D组相比无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论　雪旺细胞的转基因处理可能弥补单纯细胞移植神经营养因子含量的不足 ,而达到与自体神经移植相似的效果。     

静电纺纳米聚乳酸己内酮共聚物导管修复周围神经缺损的实验研究

目的 探讨应用同轴静电纺丝技术制备的聚乳酸己内酮共聚物[Poly(1-lactide-co-epsilon-caprolactone),P(LLA-CL)]导管,移植修复大鼠周围神经缺损的效果.方法 选取健康SD大鼠54只,随机分成3组,每组18只.先造成坐骨神经1.5cm缺损段,然后分别采用P(LLA-CL)导管桥接(A组)、硅胶管桥接(B组)、自体神经逆行原位移植(C组).分别在术后4、8、12周对大鼠进行大体观察、坐骨神经功能指数检查、神经电生理检查、肌肉湿重、再生有髓神经纤维计数、电镜观察,评价各组神经再生.结果 术后4周时A组再生神经已部分生长到导管的中部;8周时再生神经已通过神经导管,但再生的神经纤细;12周时再生神经粘连较轻,直径较粗.A组的坐骨神经功能指数、神经电生理、肌肉湿重和组织学观察等各项指标均略差于C组,但明显优于B组.结论 纳米聚乳酸己内酮神经导管具有促进神经轴突再生的作用,有望成为自体神经移植的替代材料应用于周围神经缺损的修复.     

种植脂肪干细胞的去细胞神经修复坐骨神经缺损的实验研究

目的 探讨脂肪干细胞(ADSCs)应用于组织工程化外周神经修复大鼠坐骨神经缺损的效果.方法 48只体重200～220 g的雌性F344大鼠随机分成6组,每组8只,分别用下面6种不同的实验组修复15 mm长坐骨神经缺损.A组:种植ADSCs的去细胞神经;B组:种植诱导ADSCs的去细胞神经;C组:种植许旺细胞(SCs)的去细胞神经;D组:去细胞神经;E组:自体神经移植;F组:空白对照.通过神经电生理检测、荧光金逆行示踪、组织学检测和坐骨神经功能指数测定评价各组修复神经缺损的效果.结果 术后12周,F组未见桥接物,A组和B组的神经电生理等各项指标均分别优于D组(P＜0.05或P＜0.01),与C组和E组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 初步结果显示ADSCs及诱导后ADSCs作为种子细胞,与去细胞神经构建的组织工程化外周神经移植体,能够修复外周神经缺损.     

带蒂神经植入脊髓后许旺细胞的存活与迁移

目的：探讨神经组织移植后许旺细胞存活、增殖及诱导轴突再生的能力。方法：成鼠胸髓损伤后,分别移植带血管蒂正中神经（VN组）和游离正中神经（PN组）,术后8周行组织学检查和形态计量分析。结果：带血管蒂正中神经组移植神经与脊髓连接紧密,有较多新生轴突,许旺细胞大量存活和增殖,NF,S－100阳性反应均明显高于游离正中神经组。结论：带血管蒂周围神经移植较接近生理状态,许旺细胞存活并向脊髓实质内迁移和大量增殖,其诱导损伤轴突再生的能力也优于游离周围神经移植。     

小肠黏膜下层复合雪旺细胞构建组织工程化人工神经修复周围神经缺损的研究

目的小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）复合雪旺细胞构建组织工程化人工神经并探讨其修复周围神经缺损的效果。方法SD大鼠60只随机分成三组，每组20只。构建右侧坐骨神经14mm缺损，A组：单纯SIS修复组；B组：复合雪旺细胞的SIS修复组；C组：自体神经移植对照组。术后不同时间段通过大体观察、电生理检测、组织学、透射电镜、图像分析、逆行示踪和小腿三头肌称重等方法分析评价修复效果。结果术后16周，B组移植段与近远段神经外观相似，未有神经瘤形成。组织学和透射电镜检查见B组再生神经组织可顺利通过缺损区，再生神经纤维排列整齐呈束状，含有大量的有髓神经纤维，与C组相似。电生理检测见第16周B组神经传导速度和复合动作电位的波幅均较第12周有所提高，与C组相比差异无统计学意义。真蓝逆行示踪证实B组和C组再生神经轴突轴浆运输功能恢复良好。图像分析证实B组再生神经组织面积百分比、有髓神经纤维密度和髓鞘厚度与C组相比差异无统计学意义，优于A组。B组和C组患侧小腿三头肌肌肉重量和恢复率均优于A组，C组优于B组，且差异有统计学意义。结论SIS复合雪旺细胞构建组织工程化人工神经能有效修复大鼠长距离坐骨神经缺损，有望成为自体神经的替代材料应用于周围神经缺损的修复。     

胶质细胞源性神经营养因子对周围神经再生的作用

目的研究胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)对周围神经再生的作用.方法硅管套接大鼠坐骨神经,术中一次性将GDNF、生理盐水(nor-mal saline solution,SAL)分别加入硅管中.术后4周,应用溃变神经纤维染色法、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)逆行追踪技术观察GDNF对轴突再生的影响.结果与SAL组相比,GDNF组渍变神经纤维面积明显减少,溃变神经纤维面积百分率由17.3%降低到1.9%(P＜0.01);GDNF组脊髓标记胞体显著增加,HRP标记胞体数的百分率由43.5%上升到68.3%(P＜0.01).结论外源性GDNF能明显促进周围神经再生.     

嗅鞘细胞与雪旺细胞修复神经缺损的效果比较

目的 比较雪旺细胞和嗅鞘细胞修复周围神经损伤的能力. 方法体外培养异体雪旺细胞及嗅鞘细胞2周后纯化浓缩待用.60只成年雌性Wistar鼠随机分成三组,坐骨神经切除25 mm长轴突,保留神经外膜吻合于近端,分别将细胞培养液、雪旺细胞、嗅鞘细胞分别植入A、B、C组神经外膜腔内,术后3个月,通过大体形态观察、显微镜及透射电镜观察、逆行标记荧光红的运输距离、免疫荧光检测胶质纤维酸性蛋白及神经生长因子、踝关节功能评分、酶联免疫方法检测髓鞘碱性蛋白及神经丝蛋白来评估神经缺损的修复效果. 结果神经缺损再生情况,肉眼观C组最完全,B组次之,而A组最差,光学显微镜及透射电镜观察神经纤维生长情况、荧光显微镜下观察逆行标记荧光红在神经中的运行距离,C组最长,B组次之,而A组最短;免疫荧光检测神经生长因子及胶质纤维酸性蛋白浓度、酶联免疫吸附实验检测髓鞘碱性蛋白及神经丝蛋白浓度均数、踝关节运动功能评分均数的结果都是C组最高,B组次之,而A组最低,三组间差异有统计学意义(P<0.05). 结论嗅鞘细胞能促进神经缺损再生,且效果优于雪旺细胞.     

低温保存的嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的实验研究

目的:观察低温保存复苏后嗅鞘细胞(OECs)局部移植治疗脊髓损伤(SCI)的疗效,探讨低温保存对嗅鞘细胞活性的影响。方法:建立大鼠T10节段脊髓半切损伤模型56只,随机分为四组,每组12只:新鲜OECs移植组(A组),冻存OECs移植组(B组),D/F12培养液移植组(C组)和空白对照组(D组)。A组损失伤局部行新鲜OECs移植,B组将处于对数生长期的OECs冻存3个月,复苏后(用双苯亚甲胺标记)移植到脊髓半切模型大鼠脊髓损伤区。术后第1天、1、2、3、4、6、8及10周时进行联合行为学(CBS)综合评分,术后5周和10周时取材观察移植细胞存活及迁移情况;HE染色及嗜银染色观察脊髓组织病理及轴突情况;NGFRp75免疫组织化学染色情况。结果:术后第1天,2、10周时CBS评分,A组分别为85.78±1.07、58.80±5.00、6.52±2.37;B组分别为86.12±1.29、60.06±6.51、8.15±2.26;C组分别为86.4±1.03、66.28±7.00、30.65±5.60;D组分别为86.75±1.37、69.85±6.61、34.13±5.38。A、B两组间无明显差别(P>0.05);C组与D组间比较无差异(P>0.05);A组及B组较C组和D组在2周后各时段差别有显著意义(P<0.05)。组织学方面,HE染色和嗜银染色A、B两组在术后5周可见多量突起经近侧断端向损伤区域生长,10周时可见神经纤维跨越损伤区域,而C、D组未见有神经纤维跨越损伤区;NGFRp75免疫组化染色,无论5周还是10周,A、B两组在损伤部位均可见阳性染色区域,C、D组未见有阳性着色。术后5周时A、B两组可检测到荧光标记细胞,且可见细胞发生迁移。结论:低温保存的OECs脊髓局部移植治疗SCI与新鲜OECs移植治疗效果无差别。     

胶质细胞源性神经营养因子慢病毒载体体外转染嗅鞘细胞MOI值的研究

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)慢病毒载体(lentivirus vector)体外转染嗅鞘细胞(OECs)并能稳定表达目的 蛋白的最佳感染复数(MOI).方法 构建GDNF-lentivirus,体外转染293T细胞,获得高滴度的慢病毒浓缩液,测定病毒滴度达2×108 TU/ml.不同MOI的情况下,GDNF-lentivirus体外转染OECs,Western blot检测GDNF的表达.结果 相差显微镜明视野下动态观察转染后的OECs生长状态良好,荧光显微镜下见大量绿色荧光蛋白(GFP)标记的转染成功的OECs.MOI=100时,OECs的转染率最高,约为75%,MOI=50时约为68%,MOI=10和MOI=1时分别为25%和13%,阴性对照组未见有绿色荧光表达.转染后第5天,收集OECs进行Western blot检测,MOI=100和MOI=50时GDNF表达最强,两者差异无统计学意义(P＞0.05),MOI=10表达较少,而MOI=1表达最少,对照组无GDNF表达.结论 GDNF-lentivirus在体外既能高效转染OECs又不影响细胞活性,且转染后的OECs可以长期稳定表达GDNF的适宜MOI为50～100之间.     

成年鼠嗅鞘细胞的纯化培养与免疫组化观察

目的：对文献报道的嗅鞘细胞(OECs)纯化方法进行改进，为基因治疗和细胞移植修复脊髓损伤实验研究提供高纯度的种子细胞.方法：本实验综合使用了阿糖胞苷、BPE及NGFR抗体纯化了原代培养的成年wistar大鼠的OECs，并对纯化的OECs细胞免疫特性进行观察。结果：本实验得到OECs纯度可达98％，其特性与文献报道一致.结论：本实验综合使用了阿糖胞苷、BPE及NGFR抗体纯化了原代培养的成年wistar大鼠OECs，纯度可达98％。而且培养周期大大缩短，节约了时间，为进一步的实验研究奠定了基础.     

嗅球成鞘细胞在坐骨神经损伤后功能恢复中的作用

目的：探讨嗅球成鞘细胞（OECs）在坐骨神经损伤后促进神经功能恢复中的作用。方法：SD大鼠30只随机分成对照生理盐水（SAL）组和实验（OECs）组，采用硅胶管套接大鼠切断的坐骨神经，硅胶管内对照组给予SAL，实验组给予培养成活的新生大鼠OECs悬液，分别于术后30或90天，应用电生理检测，HRP逆行示踪法及轴突图像分析检测损伤的神经在电传导轴浆运输，髓鞘再生等方面的恢复情况。结果：术后30和90天，OECs组与SAL组比较：（1）OECs组损伤侧下肢复合肌肉动作电位（CMAP）的潜伏期（LAT）分别缩短了0.60ms和0.56ms;神经传导速度分别加快了6.42m/s和5.36m/s；波幅分别增加了3.92mv和5.84mv;（2）OECs组损伤侧脊髓前角HRP阳性细胞率分别增了11．63％和25．01％；（3）OECs组坐骨神经纤维数目分别增加了1047个/mm^2和1422个/mm^2，神经髓鞘厚度分别增加了0．43μm和0．63μm。结论：嗅球成鞘细胞对周围神经损伤后的神经功能恢复有积极的促进作用     

Sciatic nerve repair with tissue engineered nerve: Olfactory ensheathing cells seeded poly(lactic-co-glygolic acid) conduit in an animal model

Background and Aim:

Synthetic nerve conduits have been sought for repair of nerve defects as the autologous nerve grafts causes donor site morbidity and possess other drawbacks. Many strategies have been investigated to improve nerve regeneration through synthetic nerve guided conduits. Olfactory ensheathing cells (OECs) that share both Schwann cell and astrocytic characteristics have been shown to promote axonal regeneration after transplantation. The present study was driven by the hypothesis that tissue-engineered poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) seeded with OECs would improve peripheral nerve regeneration in a long sciatic nerve defect.

Materials and Methods:

Sciatic nerve gap of 15 mm was created in six adult female Sprague-Dawley rats and implanted with PLGA seeded with OECs. The nerve regeneration was assessed electrophysiologically at 2, 4 and 6 weeks following implantation. Histopathological examination, scanning electron microscopic (SEM) examination and immunohistochemical analysis were performed at the end of the study.

Results:

Nerve conduction studies revealed a significant improvement of nerve conduction velocities whereby the mean nerve conduction velocity increases from 4.2 ΁ 0.4 m/s at week 2 to 27.3 ΁ 5.7 m/s at week 6 post-implantation (P < 0.0001). Histological analysis revealed presence of spindle-shaped cells. Immunohistochemical analysis further demonstrated the expression of S100 protein in both cell nucleus and the cytoplasm in these cells, hence confirming their Schwann-cell-like property. Under SEM, these cells were found to be actively secreting extracellular matrix.

Conclusion:

Tissue-engineered PLGA conduit seeded with OECs provided a permissive environment to facilitate nerve regeneration in a small animal model.     

Influence of cryopreserved olfactory ensheathing cells transplantation on axonal regeneration in spinal cord ofadult rats

Objective: To observe the effects of cryopreserved olfactory ensheathing cells (OECs) transplantation on axonal regeneration and functional recovery following spinal cord injury in adult rats. Methods : Twenty-four rats were divided into experimental and control groups, each group having 12 rats. The spinal cord injury was established by transecting the spinal cord at T10 level with microsurgery scissors. OECs were purified from SD rat olfactory bulb and cultured in DMEM ( Dulbecco‘s minimum essential medium) and cryopreserved (-120~C) for two weeks. OECs suspension I (1-1.4) x 105/ul ] was transplanted into transected spinal cord, while the DMEM solution was injected instead in the control group. At 6 and 12 weeks after transplantation, the rats were evaluated with climbing test and MEP ( moter evoked potentials) monitoring. The samples of spinal cord were procured and studied with histological and immunohisto chemical stainings. Results: At 6 weeks after transplantation, all of the rats in both transplanted and control groups were paraplegic, and MEPs could not be recorded. Morphologyof transplanted OECs was normal, and OECs wereinterfused with host well. Axons could regrow into gap tissue between the spinal cords. Both OECs and regrown axons were immunoreactive for MBP. No regrown axons were found in the control group. At 12 weeks after transplantation, 2 rats (2/7) had lower extremities muscle contraction, 2 rats (2/7) had hip and/or knee active movement, and MEP of 5 rats (5/7) could be recorded in the calf in the transplantation group. None of the rats (7/7) in the control group had functional improvement, and none had MEPs recorded. In the transplanted group,histological and immunohistochemical methods showed the number of transplanted OECs reduced and some regrown axons had reached the end of transected spinal cord. However, no regrown axons could be seen except scar formation in the control group. Conclusions: Cryopreserved OECs could integrated with the host and promote regrowing axons across the transected spinal cord ends.     

嗅鞘细胞联合VEGF对大鼠损伤脊髓的保护作用

目的探讨嗅球源性嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)移植联合鞘内重复注射VEGF对损伤脊髓功能恢复的促进作用,以及二者对神经元和神经纤维的协同保护作用。方法取新生2～3 d大鼠嗅球分离纯化培养OECs,于培养9 d用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞。将75只成年雌性Wistar大鼠(体重200～250 g)随机分为5组,A组为假手术组,仅行椎板切除术。B、C、D、E组采用重力打击法制作脊髓损伤模型后,B组术后1 d于脊髓损伤部位分4点共注射DMEM-F12无血清培养基10μL,并每天2次鞘内注射生理盐水10μL,持续1周;C组同上法分别注射DMEM-F12培养基10μL及重组大鼠VEGF165(recombined rat VEGF165,rrVEGF165)25 ng;D组注射含1×105个OECs的DMEM-F12培养基10μL及生理盐水10μL;E组注射含1×105个OECs的DMEM-F12培养基10μL及rrVEGF165 25 ng。术后1 d及术后1～8周每周采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分标准评定大鼠后肢功能恢复情况;术后8周处死实验动物,取材行透射电镜、HE染色观察,并行p75NGF受体(p75 NGF receptor,p75NGFR)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspases-3)、血管性假血友病因子(von Willebrand factor,vWF)免疫组织化学染色,评价损伤脊髓修复情况。结果术后E组大鼠后肢功能恢复较快,8周时BBB评分显著高于其余各组(P<0.05)。透射电镜和HE染色显示:B组有髓神经纤维和神经元受损严重;C、D组损伤轻于B组;E组受损最轻,断端间残存组织较多,有髓神经纤维髓鞘较完整,神经元呈多角形,有少量空泡化的线粒体。免疫组织化学染色示,B、C、D、E组Caspase-3阳性细胞数显著多于A组(P<0.05),B、D组明显多于C、E组(P<0.05),C、E组间差异无统计学意义(P>0.05)。C、E组vWF阳性血管数多于A、B、D组(P<0.05),但C、E组间差异无统计学意义(P>0.05)。D、E组均可见p75NGFR阳性OECs。结论 OECs移植联合鞘内重复注射VEGF可显著促进大鼠脊髓损伤修复,部分恢复损伤神经功能,对受损神经纤维和神经元的变性有保护作用,且二者有协同作用。