Aβ42重组多价DNA疫苗的构建及诱导Aβ抗体的产生

目的: 构建β-淀粉样蛋白(Aβ42)的多价重组DNA疫苗,确定是否诱导较高滴度Aβ抗体的产生.方法: PCR法从Tg2576转基因鼠基因组DNA中扩增人Aβ42基因片段;在Aβ42基因的5′端引物延伸连接IgG к轻链信号肽序列;利用GSGGSG linker基因串连两段Aβ42基因片段;将产物克隆入pcDNA3.1表达载体,分别构建pcDNA3.1-Aβ42,一价分泌型pcDNA3.1-sAβ42,二价分泌型pcDNA3.1-s2×Aβ42载体;转染COS-7细胞,免疫印迹检测Aβ42的表达;im接种BALB/c鼠,ELISA法测定抗体效价;免疫组织化学和Aβ42肽抗原的中和实验检测抗体与Tg2576鼠脑切片中的老年斑的结合.结果: 测序证实所构建的pcDNA3.1-Aβ42,pcDNA3.1-sAβ42,pcDNA3.1-s2×Aβ42载体插入序列正确;Western Blotting证实在COS-7细胞中表达相应的蛋白.经6轮,22 wk加强免疫后,pcDNA3.1-Aβ42疫苗不能产生Aβ抗体、pcDNA3.1-sAβ42接种后产生较低的Aβ抗体(<1:1000),pcDNA3.1-s2×Aβ42第1次加强免疫后即产生抗体,抗体滴度随接种次数增多而升高,22 wk时抗体平均滴度达1:5000以上,可以与转基因鼠Tg2576脑切片中的老年斑结合,并能被Aβ42肽抗原特异性中和.结论: 二价分泌型pcDNA3.1-s2×Aβ42疫苗,可在动物体内产生高效价的特异Aβ抗体.     

铝佐剂Aβ42及其亚单位疫苗可有效诱导大鼠产生特异性抗体

[目的] 探讨铝佐剂 Aβ 42及其 C端亚单位肽 Aβ 36～ 42疫苗接种大鼠能否产生特异性抗 Aβ 42抗体.[方法] 24只 SD大鼠随机分为 Aβ 42肽疫苗、 Aβ 36～ 42肽疫苗和对照组,每组 8只.将 Aβ 42肽疫苗及 Aβ 36～ 42与七聚赖氨酸耦联制成的亚单位疫苗分别接种于 SD大鼠,对照组用等体积 PBS加铝佐剂.用间接 ELISA法检测大鼠血清和脑匀浆上清液中特异性抗体的滴度;用 Morris水迷宫测试大鼠的行为学变化;用 HE染色观察大鼠的脑、肝、脾和肾组织学变化;用接种后血清与老年性痴呆患者的脑片作免疫组织化学染色.[结果]第 3次接种后 Aβ 42和 Aβ 36～ 42组鼠的血清均开始有抗 Aβ 42抗体产生,抗体滴度随接种次数的增多而增高,第 6次接种后两组鼠血清的抗 Aβ 42抗体滴度均达到 1∶ 1 600以上,同时脑匀浆上清液也检测到低滴度的抗 Aβ 42抗体,血和脑匀浆的抗体滴度与对照组相比,差异有显著性 (P< 0.01);对照组、 Aβ 42组和 Aβ 36～ 42组鼠逃避潜伏期分别为 54.81± 17.06、 43.18± 18.70和 52.27± 15.13,差异均无显著性( P >0.05);对照组、 Aβ 42组和 Aβ 36～ 42组鼠平台象限游泳距离占总游泳距离百分比分别为 59.78± 5.68、 65.14± 4.98和 61.34± 4.19,各组间差异也无显著性( P >0.05); 3组鼠的脑、肝、脾和肾均未出现病理性变化; Aβ 42组鼠的血清能结合 AD患者脑组织中的老年斑,而 Aβ 36～ 42组鼠的血清则不能结合老年斑.[结论] 铝佐剂 Aβ 42和 Aβ 36～ 42疫苗均有效诱导 SD大鼠产生特异性的抗 Aβ 42抗体,但两者与老年斑结合的特性不同;实验证实两种疫苗均有良好的安全性.     

人Aβ42重组抗原的融合表达及Aβ抗体的检测

OBJECTIVE: To clone and express the recombinant amyloid beta-protein (Abeta(42)) antigen and develop a method for detecting Abeta antibody. METHODS: Two partially complementary fragments of Abeta(42) gene were chemically synthesized for constructing the Abeta(42) gene by PCR. The resultant Abeta(42) gene fragment was subcloned into pGEX-2T expression vector for inducing the expression of GST-Abeta(42) fusion protein, which was purified by affinity chromatography. The antigen specificity and reactivity of the purified GST-Abeta(42) fusion protein to Abeta monoclonal antibody were identified with Western blotting. Using either GST-Abeta(42) fusion protein or Abeta(42) peptide as the coating antigen, an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was established for detecting Abeta antibodies in the serum of Abeta(42) polypeptide-immunized SD rats. RESULTS: GST-Abeta(42) fusion protein was successfully expressed as an soluble protein, which, after purification, was found to have a relative molecular mass of 31 kD. About 800 mg of GST-Abeta(42) fusion protein were obtained from l L cell culture with a purity over 95%. Western blotting demonstrated specific reaction of this purified GST-Abeta(42) fusion protein with Abeta monoclonal antibody. The sensitivity of the indirect ELISA for detecting Abeta antibody was about 2 ng/ml using GST-Abeta(42) fusion protein as the coating antigen. There was no significant difference in the results of Abeta antibody detection using either GST-Abeta(42) or Abeta(42) as the coating antigen (P>0.05). CONCLUSION: GST-Abeta(42) fusion protein may serve as a substitute for the expensive Abeta(42) peptide for detecting Abeta antibody.     

淀粉样蛋白Aβ1-42在阿尔茨海默病中的意义

目的 :探讨老年人阿尔茨海默病 (Alzheimer’sdisease ,AD)脑脊液淀粉样蛋白Aβ1 - 42 的含量及其意义。方法 :采用ELISA法检测 30例AD ,非AD痴呆患者 2 5例和对照组 2 1例患者脑脊液中Aβ1 - 42 的浓度。结果 :AD患者脑脊液中Aβ1 - 42 水平明显低于非AD痴呆和对照组。结论 :Aβ1 - 42 在AD的发病中起重要作用 ,脑脊液Aβ1 - 42 值对AD的诊断具有一定的临床应用价值     

淀粉样蛋白Aβ1—42在阿尔茨海默病中的意义

目的：探讨老年人阿尔茨海默病（Alzheimer‘s disease,AD)脑脊液淀粉样蛋白Aβ1－42的含量及其意义。方法：采用ELISA法检测30例AD，非AD痴呆患者25例和对照组21例患者脑脊液中Aβ1－42的浓度。结果：AD患者脑脊液中Aβ1－42水平明显低于非AD痴呆和对照组。结论：Aβ1－42在AD的发病中起重要作用，脑脊液Aβ1－42值对AD的诊断具有一定的临床应用价值。     

人Aβ42重组抗原的融合表达及Aβ抗体的检测

目的 原核表达β-淀粉样蛋白(Aβ₄₂)抗原,建立检测Aβ抗体的间接ELISA技术。方法 化学合成Aβ₄₂基因两个互补片段,通过PCR构建人Aβ₄₂基因,克隆至pGEX-2T表达载体中,原核表达并亲和纯化GST-Aβ₄₂融合蛋白。Westernblotting检测其抗原特异性。以GST-Aβ₄₂和Aβ₄₂肽分别为包被抗原,间接ELISA法检测Aβ₄₂免疫的大鼠血清中Aβ抗体。结果 原核表达的可溶性GST-Aβ₄₂融合蛋白相对分子质量为31000,经亲和纯化后,融合蛋白产量为800mg/L菌液,纯度大于95%;Westernblotting证实纯化的融合抗原与Aβ单抗特异反应;以GST-Aβ₄₂为包被抗原,间接ELISA法检测Aβ抗体灵敏度为2ng/ml;以GST-Aβ₄₂和化学合成的Aβ₄₂分别为包被抗原,间接ELISA法检测Aβ₄₂肽免疫大鼠血清中Aβ抗体滴度,两者比较差异无显著性(P>0.05)。结论 原核表达的GST-Aβ₄₂融合蛋白可替代昂贵的化学合成的Aβ₄₂肽抗原,用于检测Aβ抗体。     

阿尔茨海默病Aβ免疫治疗研究进展

血脑屏障是大脑特殊的免疫保护屏障,使得大脑免受外周免疫系统的影响.因而,当最初针对阿尔茨海默病(Alzheimer's Diseases,AD )模型老鼠的Aβ免疫治疗被认为有效的时候,引起了人们相当大的惊讶和一些怀疑.现在,许多研究已经证实了针对Aβ的免疫和抗Aβ抗体在对AD模型动物的治疗是有效的,包括Aβ免疫治疗在内的AD临床治疗试验也在进行中,给AD发病的Aβ淀粉样变机制提供了大量的信息.     

阿尔茨海默病Aβ40人单链抗体在毕赤酵母的表达

目的 重组表达抗Aβ40的人单链抗体,为被动免疫治疗阿尔茨海默疾病提供研究材料。方法 将从人噬菌体单链抗体文库中筛选获得的抗Aβ40人单链抗体基因,突变BamHI酶切位点,克隆连接到T载体,经过PCR和酶切鉴定。EcoRI和NotI双酶切pT-scFvAβ40质粒,连接到经过同样酶切的pPIC9K载体构建pPIC9K-scFvAβ40质粒,经过基因测序验证。线性化pPIC9K-scFvAβ40,转化GS115毕赤酵母,经0．5％甲醇诱导表达抗Aβ40的人单链抗体。结果 基因测序证实pPIC9K-scFvAβ40序列正确,转化GS115获得重组菌株。经过0．5％甲醇诱导,重组菌株分泌表达分子质量大小约为33kD的蛋白质。结论 成功构建pPIC9K-scFvAβ40质粒,Aβ40的人单链抗体在毕赤酵母系统得以重组表达。     

针刺百会穴对阿尔茨海默病模型大鼠海马区Aβ42影响

目的:通过针刺阿尔茨海默病(AD)模型大鼠百会穴,观察海马区Aβ42的表达变化,揭示针刺头部百会穴是否能改善大鼠的学习记忆能力,是否可以减轻海马区神经元的损害。方法:选用雄性SD大鼠48只随机分为4组:空白组、假手术组、模型组、针刺组(模型+针刺组),用链脲佐菌素(STZ)进行脑室内注射,取得模型,选择针刺百会穴的方法,观察相关蛋白的表达。于造模成功后针刺,在4周后进行水迷宫检测,连续测试5 d,测试后24 h内取材,采用免疫组化分析法(IHC)观察脑组织内Aβ42的阳性细胞数。结果:(1)定位航行实验显示:各组大鼠的逃避潜伏期随着训练天数的增加,出现时间缩短,其中模型组所用时间最长。空白组与假手术组比较无统计学意义;模型组与空白组比较,模型组与假手术组比较均有显著性差异(P0.01);针刺组与空白组及假手术组比较在1、2、3、4 d时有统计学意义(P0.05);针刺组与模型组比较2、3、4、5 d有显著性差异(P0.01)。(2)空间探索实验显示:通过分析大鼠游泳的轨迹来统计其穿越原平台所在区域的次数,模型组次数最少。假手术组与空白组比较无统计学意义;模型组与空白组和假手术组比较均有显著性差异(P0.01);针刺组与空白组比较有统计学意义(P0.05);针刺组与模型组比较有统计学意义(P0.05)。(3)空白组及假手术组的海马神经元各层细胞排列紧密整齐,形态正常,模型组海马区神经元形态结构异常,伴有神经元缺失,针刺组各层细胞排列异常,但优于模型组。(4)空白组和假手术组大鼠脑组织神经细胞结构及形态正常,Aβ42阳性细胞表达较少,模型组表达高于其他3组。空白组和假手术组比较无统计学意义(P0.05);模型组的阳性细胞数明显高于空白组和假手术组(P0.01);刺组与空白组及假手术组比较有显著性差异(P0.01);针刺组与模型组比较均有显著性差异(P0.01)。结论:针刺百会穴可以改善大鼠的学习记忆能力,减轻海马区神经元损害症状,起到了脑保护作用。     

Aβ42与Aβ42寡聚体的生物学性质比较研究

目的 比较Aβ42和Aβ42寡聚体的细胞毒性.应用原子力显微镜(AFM)观察比较Aβ42和Aβ42寡聚体的聚集状态.方法 应用MTT检测Aβ42和Aβ42寡聚体的细胞毒性;TUNEL法测定Aβ42和Aβ42寡聚体的细胞凋亡作用.制备终浓度为50μmol/L的AB 42寡聚体和Aβ42溶液.在云母片上制作Aβ样品,用原子力显微镜的轻敲模式观察不同时间、温度条件下的Aβ42寡聚体状态,比较Aβ42寡聚体与Aβ42聚集形态的差异.结果 MTT、TUNEL结果 表明Aβ42和Aβ42寡聚体均可降低PCI2细胞的生存率,均有致细胞凋亡作用.10μmol/L Ap 42寡聚体较20μmol/L Aβ42能引起更多细胞凋亡,凋亡率差异有显著性(P<0.05).4℃、48 h内经HFIP作用的Aβ42以单体、寡聚体形式存在;室温、72 h时未经六氟丙醇作用的Aβ42以纤维聚集态存在.结论 Aβ寡聚体是Alzheimer病神经细胞损伤过程中的重要因素.相同浓度Aβ42寡聚体较Aβ42细胞毒性大.Aβ 42寡聚体纤维随时间延长,室温条件下更利于纤维聚集;Aβ42寡聚体与Aβ42相同条件下聚集状态完全不同.利用原子力显微镜可观察不同Aβ的聚集情况,AFM是研究Aβ的有效手段.     

阿尔茨海默病Aβ人抗体可变区片段基因的克隆和表达

目的 筛选出β淀粉样蛋白40 (Aβ40)的人源抗体单链可变区片段,克隆单链抗体的基因并在原核生物大肠杆菌表达,为阿尔茨海默病的诊断和治疗开辟新的途径。方法 先将Aβ40包被在免疫反应板上,后用来自正常人外周血淋巴细胞的单链抗体文库结合。经过5轮的生物淘金法筛选,从最后一轮噬菌体感染的大肠杆菌TGl中随机挑选55个克隆进行ELISA测试,筛选出Aβ40特异的单链抗体并对其进行基因测序。将人源抗体单链可变区片段基因克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,转化大肠杆菌BL21表达谷胱甘肽-s-转移酶(GST)融合的单链抗体。结果 ELISA测试表明,55个克隆中有33个克隆能结合Aβ40,Aβ40对10个克隆的竞争抑制率达到50％以上,而其中5个克隆的抗原结合表位在Aβ40的氨基端1-16个氨基酸之间。DNA测序结果发现,Aβ40单链抗体基因由768bp组成,推导得到的氨基酸序列具有典型的抗体可变区结构。将单链抗体基因克隆到原核表达系统中诱导表达,得到相对分子质量为55000的GST融合抗体表达产物。结论利用非免疫途径筛选出阿尔茨海默病发病中起关键神经元毒性作用的Aβ40的人源抗体单链可变区片段,为该抗体的表达和临床应用打下了基础。     

Aβ_(1-42)寡聚体诱导阿尔茨海默病动物模型的研究

阿尔茨海默病(AD)是一种世界性疾病,建立AD动物模型对于研究和治疗AD有重要意义。可溶性Aβ1-42寡聚体来自源淀粉样前体蛋白,与其他Aβ进行比较,Aβ1-42的神经毒性更强,在诱导AD动物模型时更接近于AD的病理状态,其能更全面地诠释AD的发病机制,该模型的建立为今后AD药物研究以及治疗奠定了基础。     

Aβ1-42单克隆抗体对阿尔茨海默病大鼠认知能力及脑组织Aβ和ChAT表达的影响

目的:探讨经颅内注射β-淀粉样蛋白(Aβ)142单克隆抗体(mAb)对阿尔茨海默病(AD)大鼠的疗效及机制.方法:30只SD大鼠分3组:AD模型组和治疗组各12只,生理盐水组6只.AD模型组和治疗组于侧脑室注入Aβ1-42蛋白片段建立AD大鼠模型,治疗组大鼠在注射后第14天于侧脑室内注入Aβ1-42 mAb,连用3 d...     

阿尔茨海默病患者血清C3、Aβ1-42测定及意义

目的 测定并分析阿尔茨海默病 (Alzheimer's disease ,AD )血清中C3和Aβ1-42的变化规律。方法 收集AD 患者与正常老年人的血清,并利用夹心ELISA技术测定补体C3与Aβ1-42浓度。结果 AD患者血清中补体C3浓度较正常老年人虽有所增加,但差异无统计学意义（P>0.05）;AD患者血清中Aβ1-42浓度较正常老年人增加,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 血清Aβ1-42浓度可以作为AD诊断的参考指标之一。     

MK-801对转Aβ42基因果蝇阿尔茨海默病模型的神经保护作用

目的:探讨N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂MK-801拮抗阿尔茨海默病(AD)果蝇模型中Aβ42诱导的神经毒作用。方法:建立转Aβ42基因果蝇AD模型,用NMDA受体拮抗剂MK-801分别干预正常对照果蝇和转Aβ42基因AD模型果蝇,在整体动物水平上进行果蝇行为学检测,分别检测各组果蝇的嗅觉短期记忆能力、攀爬能力和平均寿命。结果:与Aβ42转基因组果蝇相比,Aβ42转基因果蝇喂食MK-801组的学习记忆能力、攀爬能力、平均寿命均有显著改善(P<0.05),正常对照组和正常对照 MK801组的行为学检测无统计学差异。结论:在转Aβ42基因AD果蝇模型中,NMDA受体拮抗剂MK-801的干预有明显的神经保护作用,能减轻Aβ42诱导的神经毒作用。     

阿尔茨海默病患者血清Aβ42、胆红素及MnSOD与认知损害的相关性

目的 探讨阿尔茨海默病（alzheimer’s disease,AD）患者β淀粉样蛋白42(amyloid β-protein,Aβ)、胆红素、锰超氧化物歧化酶（Mn-superoxide dismutase,MnSOD）水平变化及与患者认知损害的相关性。方法 选取2020年8月至2022年8月于河南大学第一附属医院接受治疗的106例AD患者作为观察组,另入选与观察组年龄、性别相匹配的110名老年健康体检者作为对照组。分析所有研究对象的一般资料,采用蒙特利尔认知评估量表（montreal cognitive assessment,MoCA）对观察组患者认知功能进行评估,通过酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunoSorbent assay,ELISA）测定血清Aβ42、胆红素及MnSOD水平,同时对比不同脑电（electroencephalogram,EEG）监测结果下血清Aβ42、胆红素及MnSOD的差异,分析AD患者血清指标与EEG异常、MoCA评分之间的关系。结果 与对照组相比,观察组血清Aβ42、胆红素、MnSOD均显著低,差异具有统计学意义（P <0.0...     

百草枯通过Wnt/β-catenin信号通路调控Aβ产生导致大鼠阿尔茨海默病样病变

目的 阿尔茨海默病在中国的年发病率逐年升高,早期大量使用的除草剂百草枯可能是诱发阿尔茨海默病的因素,本研究通过构建百草枯中毒动物模型,分析其诱发阿尔茨海默病的机制。方法 给SD大鼠灌喂百草枯,观察其行为,通过伊文思蓝染色观察血脑屏障的完整性,使用免疫印迹法检测脑组织中Aβ42的表达水平,同时使用ELISA检测炎症因子白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α和诱导型一氧化氮合酶的表达水平。结果 百草枯能显著增加脑组织中Aβ42的表达水平,同时破坏血-脑脊液屏障的完整性,增加血-脑脊液屏障中糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)的表达水平。使用GSK-3β抑制剂能显著缓解百草枯导致的血-脑脊液屏障损伤和Aβ42的水平。结论 百草枯可以通过上调GSK3β破坏血-脑脊液屏障的完整性,从而进入脑内,使Aβ42的表达水平升高。     

阿尔茨海默病发病机制Aβ假说的研究进展

阿尔茨海默病（Alzheimer＇s disease,AD）是一种发生在老年期或老年前期的慢性渐进性中枢神经系统退行性疾病。AD的初始症状表现为记忆力缺失,症状会随着病情进展逐渐加重,认知和记忆功能不断恶化,日常生活能力进行性减退,并有各种神经精神症状和行为障碍。