p16 mRNA在乳腺癌中的表达及临床病理意义

目的探讨ｐ１６ｍＲＮＡ在原发性乳腺癌的表达情况及其临床病理意义。方法体外转录法生物素标记ＲＮＡ探针,用原位杂交技术检测ｐ１６ｍＲＮＡ在１２０例乳腺癌标本中的表达。结果ｐ１６ｍＲＮＡ的阳性表达率７０８％（８５／１２０）,与患者年龄、肿瘤大小及雌、孕激素受体状态无相关性;淋巴结转移组的阳性率５４％（３１／５７）,未转移组８６％（５４／６３）（Ｐ＜００１）;ｐ１６ｍＲＮＡ表达阳性组的３年以上病死率为２５％（２１／８５）,阴性组为５７％（２０／３５）（Ｐ＜００１）。结论ｐ１６ｍＲＮＡ的异常表达在乳腺癌的发生发展中可能起重要作用。     

重组人单链白细胞介素12融合基因（rhscIL—12）的构建和真？…

目的 克隆人ＩＬ－１２（ｈＩＬ－１２）ｐ４０和ｐ３５亚单位ｃＤＮＡ，构建人单链ＩＬ－２（ｒｈｓｃＩＬ－２）融合基因，并在哺乳动物细胞中进行表达。方法从经ＰＤＢｕ刺激的ＥＢＶ转化的人Ｂ淋巴细胞株ＮＣ３７中提取ｍＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ分别获得ｈＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５亚单位编码序列的ｃＤＮＡ，运用重组ＰＣＲ技术将两段基因通过一疏水性多肽接头（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ＤＮＡ序列进行体外基因重组，构建ｒｈｓｃＩ     

联合应用IL-2和IL-3的基因疗法增强骨髓移植后骨髓细胞毒活性及抗肿瘤效果的实验研究

目的：探讨联合应用成纤维细胞介导ＩＬ２和ＩＬ３的基因疗法对骨髓移植（ＢＭＴ）后荷瘤小鼠抗肿瘤作用的效果及机理。方法：将分别转染ＩＬ２基因及ＩＬ３基因的ＮＩＨ３Ｔ３细胞以单独或联合方式移植至ＢＭＴ的荷瘤小鼠腹腔内８ｄ后，取出小鼠骨髓细胞检测杀伤活性的变化以及ＩＬ２受体的表达，并观察荷瘤小鼠的存活期。结果：ＩＬ３基因治疗虽然可加速ＢＭＴ后造血重建过程，但对骨髓细胞的ＮＫ、ＬＡＫ活性具有一定的抑制作用；ＩＬ２基因治疗可明显提高骨髓细胞的杀伤活性；联合应用基因治疗后荷瘤小鼠骨髓ＮＫ、ＬＡＫ活性及骨髓细胞ＣＤ２５表达升高，明显延长大剂量化疗后接受ＢＭＴ的荷瘤小鼠的存活期。结论：联合应用ＩＬ２和ＩＬ３的基因疗法能协同提高骨髓细胞ＩＬ２受体表达水平，提高骨髓细胞毒活性，增强ＢＭＴ后的抗肿瘤效果。     

核因子-κB调控白细胞介素1β刺激人肾小球系膜细胞表达细胞间粘附分子

目的研究核因子κＢ（ＮＦκＢ）对白细胞介素１β（ＩＬ１β）引起的体外培养的人肾小球系膜细胞表达细胞间粘附分子（ＩＣＡＭ１）的基因调控机理。方法采用凝胶迁移率法观测ＮＦκＢ的活化，以Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交方法检测细胞间粘附分子的基因表达，用细胞ＥＬＩＳＡ法检测ＩＣＡＭ１蛋白水平的表达。结果ｒｈＩＬ１β１０ｎｇ／ｍｌ刺激肾小球系膜细胞１、２、４小时，均引起ＮＦκＢ活化，且１小时为最强。４小时，ＩＣＡＭ１ｍＲＮＡ表达水平上调０３５（刺激前为０１４）。结论细胞因子ＩＬ１β刺激人肾小球系膜细胞表达细胞间粘附分子是通过ＮＦκＢ调控，ＮＦκＢ可能参与调节肾小球疾病的免疫炎症的过程。     

杀菌-通透性增加蛋白对烫伤大鼠脂多糖结合蛋白和CD14 mRNA表达的影响

目的观察烫伤后重组杀菌通透性增加蛋白（ｒＢＰＩ２１）对内毒素增敏系统脂多糖结合蛋白／脂多糖受体ＣＤ１４（ＬＢＰ／ＣＤ１４）及肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）ｍＲＮＡ表达的影响及其意义。方法采用大鼠３５％Ⅲ°烫伤模型,动物分为正常对照组（８只）、烫伤组（１２只）和ｒＢＰＩ２１治疗组（１２只）。烫伤组和ｒＢＰＩ２１治疗组动物分别于伤后１２和２４小时活杀。留取组织和血标本采用半定量ＲＴＰＣＲ方法,分别检测组织ＬＢＰ、ＣＤ１４、ＴＮＦαｍＲＮＡ表达及器官功能指标。结果ｒＢＰＩ２１治疗可明显抑制局部组织ＬＢＰ／ＣＤ１４ｍＲＮＡ表达（Ｐ＜００５００１）,并不同程度抑制肝、肺及肾组织ＴＮＦαｍＲＮＡ表达水平（Ｐ＜００５００１）。同时,ｒＢＰＩ２１治疗组动物血清谷丙转氨酶水平明显降低（Ｐ＜００１）,而小肠组织二氨氧化酶活性显著高于烫伤组（Ｐ＜００５）。结论烫伤早期应用ｒＢＰＩ２１可部分减轻肠源性内毒素移位诱发的病理损害,其作用机理可能与ｒＢＰＩ２１对体内多种组织ＬＢＰ／ＣＤ１４ｍＲＮＡ表达的下调效应有关。     

体内直接导入转基因IL—2包装细胞的抗瘤作用

利用构建分泌人ＩＬ－２的逆转录病毒的包装细胞，直接体内注射，观察了对Ｂ１６小鼠黑色素瘤生长影响及转基因效果。狭缝印迹分析结果显示，Ｂ１６细胞在体内获得ＩＬ－２ｍＲＮＡ表达。同时，肿瘤生长受到抑制，表现在小鼠成瘤与存活时间延长，免疫功能也获得增强，ＩＦＮ－γ水平升高。本结果与本室以往报道的体外基因转移的动物实验结果相符，提示直接体内注射病毒包装细胞可转移外源基因及显示抑癌作用。     

脐血单个核细胞IL—12和IFN—γ表达的观察

本文探讨新生和脐血单个核细胞（ＣＢＭＣ）白细胞介素１２（ＩＬ－１２）和γ－干扰素（ＩＦＮ－γ）基因表达水平；观察重组ＩＬ－１２地ＣＢＭＣＩＦＮγ基因表达的影响。采用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ＿ＰＣＲ）测定８例新生儿ＣＢＭＣＩＬ－１２ｐ４９ＲＮＡ和ＩＦＮ－γｍＲＮＡ表达，用ＥＬＩＳＡ法测新一儿ＣＢＭＣ细胞培养上清液中ＩＦＮ－γ浓度。结果显示：新生儿ＣＢＭＣ一外受刺激后表达的Ｉ国２ｐ４０ｍＲＮＡ、Ｉ     

门静脉高压症大鼠断流术后胃粘膜内皮素-1及一氧化氮合酶mRNA的表达

目的研究肝硬化门静脉高压性胃病（ＰＨＧ）大鼠断流术后胃粘膜内皮素１（ＥＴ１）、一氧化氮合酶（ＮＯＳ）的基因表达，探讨ＥＴ１、ＮＯ是否参与断流术后ＰＨＧ局部微循环改变。方法取Ｗｉｓｔａｒ大鼠３６只，分正常对照组１２只；肝硬化合并ＰＨＧ组１２只，模型复制是硫代乙酰胺６０ｍｇ·ｋｇ１，腹腔注射，每日１次连续１６周；断流手术组１２只，按上述复制出模型，作联合断流术，术后饲养３个月。采用Ｄｏｔｂｌｏｔ杂交技术定量研究３组胃粘膜ＥＴ１、ＮＯＳｍＲＮＡ表达。结果大鼠在肝硬化合并ＰＨＧ时，ＥＴ１ｍＲＮＡ较正常减少（Ｐ＜００１），断流术后其变化更加明显（Ｐ＜００１）；ＮＯＳｍＲＮＡ在肝硬化ＰＨＧ时含量轻度增加（Ｐ＞００５），断流术后增加明显，差异有显著意义（Ｐ＜００１）。结论断流术后胃粘膜ＥＴ含量不足使缩血管能力下降、ＮＯ释放过多使血管过分扩张，ＥＴ／ＮＯ表达比例失调可能至少部分是断流术后ＰＨＧ微循环紊乱再出血的重要原因。     

IL—12对新生IFN—γ产生的影响

白细胞介素１２（ＩＬ－１２）是一种重要的细胞因子，由单核／巨噬细胞，Ｂ细胞产生，诱导Ｔ细胞和ＮＫ细胞产生γ干扰素（ＩＦＮ－γ）在细胞免疫反应发挥多种作用，新生儿产生ＩＬ－１２的能力鲜见报道，本用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法检测８例新生儿脐血单个核细胞（ＣＢＭＣ）ＩＬ－１２Ｐ４０ｍＲＮＡ和ＩＦＮ－γｍＲＮＡ表达，及ＥＬＩＳＡ法新生儿ＣＢＭＣ培养上清ＩＦＮ－γ浓度；并观察重组ＩＬ－１２     

外源金属硫蛋白基因表达对NIH3T3细胞耐寒力的影响

目的：研究金属硫蛋白基因对细胞耐寒力的影响．方法：通过将金属硫蛋白基因（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ,ＭＴ）的表达载体ｐＢＡｃＮｅｏ－ＭＴⅡＡ转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞（小鼠胚胎成纤维细胞系）,筛选获得了高表达ＭＴ的细胞克隆ＭＴ１（ＭＴ阳性细胞百分比为２９．４％）,用四唑盐（ＭＴＴ）比色实验观察了该细胞的生长曲线以及不同低温条件下的存活能力,并通过电镜观察超微结构以进一步证实．结果：与转染ｐＢＡｃＮｅｏ空载体的细胞克隆Ｎｅｏ相比,常温下二者的增殖能力无显著差别．在不同的低温条件下,存活能力都受到一定程度的影响,细胞克隆ＭＴ１的存活细胞数明显高于阴性对照（Ｐ＜０．０１）,超微结构改变不明显．结论：上调金属硫蛋白基因表达可能具有增强耐寒的能力．     

过表达IL-12的恶性黑色素瘤细胞在肿瘤免疫微环境重建过程中抑制T细胞表面PD-1的表达

目的 探讨过表达IL-12的恶性黑色素瘤细胞B16对肿瘤免疫微环境重建过程中T细胞表面PD-1表达水平的影响。方法 利用慢病毒感染小鼠黑色素瘤细胞B16以构建稳定过表达IL-12的B16细胞株;利用qRT-PCR、ELISA检测IL-12的表达情况;通过平板细胞克隆形成实验验证转染病毒对B16细胞增殖能力的影响;利用ELISA检测B16/IL-12细胞在体内表达IL-12的能力;将健康的C57BL/6小鼠随机分为2组,分别接种B16细胞及B16/IL-12细胞,14 d后用流式细胞术检测肿瘤引流区淋巴结中高表达PD-1的T细胞比例;利用650cGy剂量的放射线照射C57BL/6小鼠以构建免疫重建模型,并将造模后的小鼠随机分为2组,分别接种B16细胞及B16/IL-12细胞,将未接受放疗处理的小鼠作为对照组接种B16细胞,记录各组小鼠肿瘤生长情况,接种细胞14 d后用流式细胞术分别检测肿瘤引流区淋巴结以及肿瘤组织中PD-1+T细胞比例。结果 B16/IL-12细胞相比于B16细胞显著增加IL-12的表达（P<0.001）;转染IL-12过表达慢病毒并未对B16细胞增殖能力造成显著影响（P>0.05）;接种B16/IL-12细胞的何瘤小鼠在其肿瘤组织中含有更高水平的IL-12（P<0.01）;常规荷瘤小鼠模型中,B16/IL-12组小鼠较B16组小鼠具有更低比例的CD4+PD-1+T细胞（P<0.01）,而CD8+T细胞群中,PD-1表达水平差异不显著（P>0.05）;免疫重建小鼠模型中,接种B16细胞的小鼠肿瘤引流区淋巴结和肿瘤组织中的CD4+PD-1+T细胞（P<0.05）及CD8+ PD-1+T细胞比例（P<0.01）均高于正常B16组小鼠,接种B16/IL-12细胞的免疫重建小鼠肿瘤引流区淋巴结及肿瘤组织中的CD4+PD-1+T细胞比例（P<0.01）和CD8+ PD-1+T细胞比例（P<0.001）相比于接种B16细胞的免疫重建小鼠均有显著降低;在小鼠肿瘤生长过程中,接种B16/IL-12细胞的免疫重建小鼠的肿瘤生长受到明显抑制（P<0.001）。结论 肿瘤区域过表达IL-12后可减少免疫重建过程中肿瘤区域T细胞表面PD-1 的表达,达到良好的肿瘤控制效果。     

共刺激信号B7—1表达对小鼠肿瘤细胞生长和转移的影响

为Ｂ７１分子基因在肿瘤免疫基因治疗中的应用提供实验依据。方法通过逆转录病毒介导的基因转移技术，将Ｂ７１ｃＤＮＡ导入具有不同免疫原性的小鼠肿瘤细胞获得表达，并观察转基因细胞在纯系小鼠体内生长和转移的改变。结果由于Ｂ７－１基因的转导表达，使具有免疫原性的ＥＬ４Ｔ淋巴瘤细胞致瘤性丧失；使非免疫原性的Ｂ１６黑色素瘤、Ｐ８１５肥大细胞瘤和ＭＡ８９１乳腺癌细胞的致瘤性减弱；使Ｂ１６细胞的实验性转移和ＭＡ８９１细胞的自发肺转移能力降低。通过转导Ｂ７－１基因的Ｂ１６细胞的免疫接种，可使再次接种的亲本Ｂ１６细胞的致瘤性减弱：但对已生长的亲本Ｂ１６细胞影响不明显。结论Ｂ７１基因导入不同的肿瘤细胞后，可引起机体产生不同程度抗肿瘤免疫反应，使肿瘤细胞在体内的生长和转移能力丧失或减弱，这种反应的强弱与肿瘤细胞本身的特性有关。     

高强度聚焦超声抑制小鼠黑色素瘤细胞B16-F10在体内的转移

目的在黑色素瘤的小鼠模型上,探讨高强度聚焦超声（HIFU）处理对黑色素瘤细胞体内转移的影响。方法皮下注射小
鼠黑色素瘤细胞B16-F10以构建小鼠黑色素瘤皮下移植瘤模型;待肿瘤最长径长至7~10 mm时进行HIFU处理,并设置实验对
照组（荷瘤鼠辐照HIFU但保持治疗头功率源开关关闭,即假照组）;治疗后每3 d测量肿瘤长径和短径,共观察3周,绘制肿瘤曲
线,统计生存率和转移率,并通过实时荧光定量PCR测定血液中黑色素瘤细胞3个标志物的相对表达量以监测血液中循环黑色
素瘤细胞的数量,它们分别是黑色素瘤相关抗原A3（MAGE-A3）、T细胞1识别的黑色素瘤抗原（MART1）以及同源转化成对框
基因转录因子PAX3);在HIFU治疗后14 d,通过尾静脉注射再次移植B16-F10细胞,观测其肺转移率。结果（1）各自的中位生
存时间及95 %可信区间（CI）：假照组分别为19.00 d和17.14~20.86 d,HIFU组则分别为26.00d和24.76~27.25 d,生存率差异显
著（P<0.01）;从治疗后第20天起,两组小鼠的肿瘤体积差异明显,从HIFU处理后第20天开始,包括处理后第23、26天,辐照组
小鼠肿瘤体积明显小于假照组（P<0.05）;（2）实时荧光定量PCR结果显示HIFU组小鼠在治疗后第7天的MAGE-A3、MART1
和PAX3三个指标都明显低于假照组（P<0.05）,在治疗后第14天其MAGE-A3的表达量仍然明显低于假照组（P<0.05）;（3）在
HIFU治疗后14 d通过尾静脉再次移植相同肿瘤细胞,HIFU组肺转移灶的数量明显低于假照组（P<0.05）,肿瘤转移抑制率为
42.4%。结论HIFU处理能够抑制黑色素瘤细胞在体内转移的发生,其机制可能涉及减少肿瘤细胞从原发灶的脱落和瘤细胞在
肺部的定植能力。
     

重组鼠白细胞介素12与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因联合治疗小鼠B16黑色素瘤

目的：研究重组鼠白细胞介素12（AdCMVIL-12）与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（AdCMVGM-CSF）的腺病毒载体联合应用对B16黑色素瘤的抗肿瘤作用。方法：将B16黑色素瘤细胞接种于C57/BL6小鼠右侧背部皮下后,待瘤体直径达5mm时将荷瘤小鼠随机分为4组,分别为AdCMVIL-12组、AdCMVGM-CSF组、AdCMVIL-12加AdCMVGM-CSF组（联合治疗组）和AdC MVLacZ组（对照组）,每组12只,并于肿瘤组织局部分别多点注射相对应剂量的腺病毒载体,观察各组小鼠肿瘤的生长情况及其诱导的细胞免疫反应,检测各组小鼠血清IL-12和GM-CSF表达水平的变化。结果：病理学观察,联合治疗组肿瘤组织内可见大片凝固性坏死,有大量的淋巴细胞、巨噬细胞浸润。治疗30 d后,联合治疗组肿瘤平均体积为（60.73±11.36 ）mm³,与对照组、AdCMVIL-12组和AdCMVGM-CSF组［分别为（675.18±80.59）、（1 86.91±19.15）和（223.45±23.11）mm³］ 比较差异均有显著性（P>0.01）。同时,AdCMVIL-12与AdCMVGM-CSF联合基因治疗可有效延长IL-12和GM-CSF的表达时间,并且对B16黑色素瘤细胞具有很强的特异性杀伤作用,杀伤率为（69.53 ± 9.20）%。 结论：IL-12与GM-CSF联合基因治疗可增强荷B16黑色素瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应,并能有效降低单独应用AdCMVIL-12的毒副作用。     

黄芪多糖对小鼠B16-BL6黑色素瘤肺转移的影响

目的 探讨不同剂量的黄芪多糖对小鼠B 16-BL6黑色素瘤肺转移的影响及机制.方法 采用B 16-BL6小鼠人工肺转移模型研究不同剂量黄芪多糖对黑色素瘤肺转移的影响;测量给药后小鼠免疫器官指数的变化探讨其可能的机制.结果 高剂量组的黄芪多糖能够显著抑制小鼠B16-BL6黑色素瘤肺转移,并能增加小鼠脾脏指数.结论 高剂量黄芪多糖可能通过增强免疫达到抗黑色素瘤细胞肺转移的作用.     

Anti-tumor effects of pNEgr-mIL-12 recombinant plasmid induced by X-irradiation and its mechanisms

Objective To study the effect of gene radiotherapy combining injection of recombinant plasmid pNEgr-mIL-12 with local X-irradiation on cancer growth and to elucidate the mechanisms of tumor inhibition. Methods Alkaline lysis was used to extract the plasmid and polyethylene glycol 8000 (PEG 8000) was applied for further purification of plasmids. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the expression of IL-12 protein. C57BL/6J mice were subcutaneously inoculated with B16 melanoma cells and the plasmid was injected directly into the tumor. Gene-radiotherapy combining pNEgr-mIL-12 recombinant plasmid with X-irradiation was given three times to C57BL/6J mice bearing B16 melanoma. Changes in immunologic parameters of tumor-bearing mice were detected with relevant immunologic assays. Results Results showed a significant decrease in tumor growth rate (P<0.05-0.001) after 3 times of gene-radiotherapy with IL-12 and X-irradiation. Immunologic studies showed a significant increase in CTL and NK cytolytic activity (P<0.05-0.001) and an up-regulated secretion of IFN-γ and TNF-α (P<0.01-0.001). Moreover, the expression of mIL-12 in B16 melanoma cells of the treated tumor-bearing mice was found to be higher than that of control. Conclusion pNEgr-mIL-12 plasmid combined with X-irradiation can increase tumor control and the mechanism of increased tumor inhibition is related to the enhancement of anticancer immunity in tumor-bearing mice.     

白细胞介素12基因修饰的Lewis肺癌瘤苗的抗肿瘤免疫作用

目的：研究白细胞介素12（IL-12）基因修饰的Lewis肺癌瘤苗的抗肿瘤免疫作用。方法：用含IL-12基因的腺病毒载体,在体外以不同感染系数感染Lewis肺癌细胞,并分别接种于C57BL/6小鼠皮下,观察其致瘤性的变化;并用Lewis肺癌细胞及B16黑色素瘤细胞再 次攻击免疫后的C57BL/6小鼠,观察肿瘤发生情况。 结果：以各种感染系数AdCMVIL-12制备的瘤苗,接种于小鼠皮下后,无肿瘤生长,完全消除了Lewis肺癌细胞的致瘤性;瘤苗注射6 d后,用Lewis肺癌细胞再次攻击,仍无肿瘤生长,抑瘤率达100%;用B16黑色素瘤细胞攻击,10~12 d均有肿瘤生长,说明此瘤苗具有肿瘤特异性。结论：AdCMVIL-12能消除Lewis肺癌细胞的致瘤性,并能诱导显著的抗肿瘤免疫反应,对肿 瘤的复发及转移有较好疗效。     

CD3AK和黄芪多糖联合治疗荷瘤动物的实验研究

目的　探讨CD3AK和黄芪多糖 (APS)对荷瘤动物的治疗作用。方法　将黑色素瘤B1 6细胞移植到C57BL/ 6小鼠腹腔建立动物模型 ,分别用APS、CD3AK及二者联合治疗荷瘤鼠 ,检测荷瘤鼠脾NK细胞活性和脾淋巴细胞IL - 2诱生水平以及荷瘤鼠生存期。结果　单纯APS和单纯CD3AK细胞能延长荷瘤鼠的生存期 ,分别为 1 8.64± 1 .2 1天和 2 5 .34± 3 .68天 (荷瘤鼠对照组为 1 4 .67± 2 .82天 ,P <0 .0 1 ) ;二者联合应用 ,APS能显著增强CD3AK细胞的抗肿瘤作用 ,延长荷瘤鼠的生存期 ,其生存期为 35 .65± 3 .74天 (P <0 .0 0 1 )。通过对荷瘤鼠进行细胞免疫功能观察发现 ,CD3AK细胞和APS均具有抵抗荷瘤鼠NK细胞活性、IL - 2产生能力下降的作用 ;APS对CD3AK仍有显著增强效应。结论　APS是一种实用而有效的生物反应调节剂 ,CD3AK和APS联合应用对晚期肿瘤有一定治疗效果     

IL-2基因转染细胞激活非特异性免疫杀伤细胞的抗肿瘤作用

以NIH3T3细胞作为载体细胞，用基因转染的方法建立了持续分泌白细胞介素2（IL－2）的细胞株。在体外此细胞上清可以增强小鼠脾细胞和腹腔巨噬细胞对黑色素瘤B16细胞的杀伤作用（与对照组比较，均为P＜0．01）。体内注射基因转染细胞则可以抑制黑色素瘤细胞在体内的生长（与对照组比较，均为P＜0．01）。结果表明，分泌IL-2的成纤维细胞可以通过激活非特异性免疫杀伤细胞而达到抗肿瘤的作用，是一种有较大潜力的肿瘤生物治疗的新途径。