豚鼠心房肌细胞的分离及其离子流记录

为探讨豚鼠心房肌细胞的分离方法及其离子流记录,采用酶解技术分离豚鼠心房肌细胞,应用膜片钳全细胞记录技术,记录细胞膜L型钙流(L-I_(Ca))及延迟整流性钾流(I_K)。结果获得了具正常电生理活性的单个细胞及高阻封接的形成,成功记录了L-型钙流和延迟整流性钾流。认为本方法分离的单个心房肌细胞具正常的电生理活性,可用于研究心房肌细胞离子通道活性。     

犬心房肌细胞分离的方法学探讨

目的建立稳定的适于膜片钳实验研究的犬心房肌细胞分离方法。方法取健康成年犬心脏12个,采用Langendorff灌流,行回旋支插管,正常台式液灌流10 s,使心脏自主收缩排除残留余血。持续高钾液灌流,同时结扎其他血管及分支,剪去其余心脏组织,待左房及左心耳充盈,无钙台氏液灌流5 min,125 U/ml胶原酶Ⅱ200ml反复灌流消化约30~45 min,后用无钙台氏液冲洗心脏5 min,剪下心房肌组织,KB液中室温下剪碎,吹打,孵育5 min后,用200目筛网过滤,逐步复钙法复钙后,室温静置1 h,应用于膜片钳记录。结果分离的活性心肌细胞比率约90%,形态呈杆状、横纹清晰、膜周边光滑完整。结论采用本方法可以获得高产量与高质量的用于膜片钳离子流检测的心房肌细胞。     

卡维地洛对豚鼠心室肌细胞离子流的研究

卡维地洛是临床上广为应用的非选择性 β受体、选择性α1受体阻滞剂 ,在动物实验和临床研究中都显示具有抗心律失常作用 ,本研究系统地观察卡维地洛对豚鼠心室肌细胞离子流的直接影响 ,探讨其细胞电生理作用。1 材料与方法 :选用 2 0 0～ 3 0 0g的健康豚鼠 ,酶解法分离获得单个左心室肌细胞 ,采用膜片钳全细胞记录技术 ,膜片钳放大器为美国AxonInstruments公司产Axopatch 2 0 0B型 ,电压钳制脉冲发放和数据采集由Pclamp 6 0 4软件控制 ,根据所记录离子流的不同采用相应的电极外液和电极内液。卡维地洛 (山东齐鲁制药厂提供 )以浓度递增方…     

单个人心房肌细胞的分离、鉴定及影响因素分析

目的 探讨分离、鉴定单个人心房肌细胞的最佳方法及其影响因素.方法 人心房肌组织取自5例先天性心脏病(PCHD)、8例冠心病(CHD)、15例瓣膜性心脏病(VHD)手术患者,采用两步酶解法分离制备心房肌细胞,光学显微镜下观察细胞形态,全细胞膜片钳技术记录乙酰胆碱敏感钾电流(I K,Ach)情况.结果 两步酶解法分离所得杆状、横纹清楚、折光性好、静止、贴壁良好的心肌细胞产率为30%～50%.PCHD记录I K,Ach成功率最高(9/10个细胞),其次为CHD(6/10个细胞),VHD最低(3/10个细胞).结论 两步酶解法可用于人心房肌细胞的分离,全细胞膜片钳技术有助于细胞活性的鉴定,其分离数量和活性受酶解情况、年龄、病种等因素影响.     

采用膜片钳技术记录心室肌细胞离子流

本文报告了心室肌细胞分离方法,采用膜片钳技术,成功地记录了细胞膜钾、钙、钠离子流,初步显示背景钾离子通道活性的电压依赖性,钙、钠离子通道活性为电压和时间依赖性,钠离子通道开放速率最快,电压在-30mV。钠离子流达峰电流仅需1ms,其活性也表现电压和时间依赖性。     

大蒜素对小鼠心房肌细胞多种钾电流的阻滞效应

目的 探讨大蒜素对小鼠心房肌细胞多种钾电流的作用及其机制。方法 采取双酶消化法将单个小鼠心房肌细胞分离出来,灌流法将药物作用于细胞,采用全细胞膜片钳技术,分别记录心房肌细胞的外向钾电流(I_K,peak)、瞬时外向钾电流(I_to)和超极化激活延迟整流钾电流(I_KUr)。结果 钳制电压在+70 mV时,30μmol/L大蒜素可使小鼠心房肌细胞I_K,peak、I_to和I_KUr峰值显著降低,对I_to表现出抑制作用,该作用还呈现出一定的浓度依赖性和电压依赖性,半数抑制浓度(IC₅₀)为(21.0±3.8)μmol/L。深入研究门控机制结果显示,I_to通道稳态失活曲线在大蒜素的作用下发生左移,且失活后再次激活的时间有所延迟,对于通道的关闭态失活过程影响不大,提示大蒜素主要通过抑制通道稳态失活和失活后恢复过程,减少I_to电流密度,同时对I_KUr也有阻滞作用,进而...     

心房颤动对心房肌细胞电生理的影响

阵发性心房颤动(房颤)常会发展为慢性房颤,其发生率与基础疾病显著相关[1],同时有18%的特发性房颤会发展为持续性房颤[2]。阵发性房颤的持续时间也很重要,房颤持续时间短于2天的患者中,有31%的患者转变为慢性房颤,而房颤持续时间超过2天的患者,有46%转为慢性房颤[1]。从这些流行病学资料可以看出,不依赖于基础心脏病,房颤本身就是一种进行性疾病。　　临床上发现当房颤存在时间较短时,药物转复或直流电转复的成功率较高。在新近出现的房颤(<24h),静脉注射氟卡胺的转复率为76%～93%,而持续时间较长时转复成功率为0%～83%[3,4]。胺碘酮对于持…     

异丙肾上腺素对犬心房肌细胞动作电位及L型钙电流的影响

目的研究两种浓度的异丙肾上腺素（Isoproterenol，ISO）对犬心房肌细胞（AP）及L型钙电流（ICa，L）的作用。方法采用离体灌注和消化的方法获取心房肌细胞，用全细胞记录技术记录单个心房肌细胞AP以及ICa，L。结果低浓度ISO（10nmol／L）可延长APD，可使90％AP时程（APD90）延长34．4％，并降低AP平台期水平。高浓度ISO（1μmol／L）可减少APD，APD90减少32．1％。两种浓度的ISO均可诱发AP后除极及触发活动。10nmol／L和1μmol／L ISO分别增加ICa，L 36．7％和49．3％。结论两种浓度的ISO对心肌细胞ICa，L均有促进作用，Ca^2＋内流引起的肌浆网Ca^2＋释放可能是房性心律失常的发生机制之一。     

人心房肌细胞的培养与鉴定

目的　探索人心房肌细胞的原代及传代培养方法。方法　取心外科手术患者 (1 5～6 0岁 ,平均 2 5岁 )常规切除的右心耳 ,利用组织贴块法原代培养心房肌细胞并进行传代培养 ,对培养细胞 (取第 3代 )进行光镜、透射电镜形态学观察和免疫细胞化学鉴定 ,并绘制生长曲线。结果原代培养 1 0d左右时细胞数目可达 1 0 6～ 1 0 7/ml;此后每 4～ 5d可传代一次 ,大多可传至第 8代。透射电镜观察到典型心肌细胞的超微结构 ,免疫细胞化学分析显示 90 %以上的细胞呈α 肌动蛋白及心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ抗体染色阳性。细胞生长曲线显示第 3代细胞在密度为 1× 1 0 6～ 8× 1 0 6/ml呈对数生长 ,倍增时间约 2 4h。结论　利用组织贴块法成功培养出人心房肌细胞 ,所得心房肌细胞纯度高并能传代培养 ,为深入研究人心房肌细胞的病理生理及分子生物学奠定了基础。     

心房颤动心房肌细胞短暂外向钾电流的特点

观察心房颤动 (AF)心房肌细胞的电生理特点 ,探讨短暂外向钾电流 (Ito)与AF电重构的关系。采用组织块酶消化法分离 7例AF(AF组 )和 14例非AF(非AF组 )患者的右心耳心房肌细胞 ,利用全细胞记录技术观察单个心房肌细胞的Ito。在各钳制电位下 ,AF组的Ito值均明显低于对照组。钳制电位在 + 60mV时AF组的Ito值 ( 14 2 .87±4 2 .2 5pA)与非AF组 ( 4 80 .12± 3 9.2 4pA)相比 ,减少 70 .2 4 %(P <0 .0 0 1)。在各钳制电位下 ,AF组的稳态电流 (Isus)均高于非AF组。钳制电位在 + 60mV时AF组的Isus值 ( 83 1.88± 72 .90pA)与非AF组 ( 5 4 3 .93± 65 .3 4pA)相比 ,增加 5 2 .94 %(P <0 .0 1)。随着刺激频率的增加 ,AF与非AF患者心房肌细胞在钳制电位 + 60mV时的Ito强度逐渐降低 ,与非AF组不同的是 ,AF组心房肌细胞的Ito在刺激频率 1～ 2Hz间电流改变的差异具有显著性。结论 :AF心房肌不应期的缩短与Ito的降低有关 ,Ito可能是AF电重构的离子机制 ,Isus可能也参与了电重构的发生。     

大蒜素对兔心房肌细胞超速激活延迟整流钾电流的作用

目的 研究大蒜素对兔单个心房肌细胞超速激活的延迟整流钾电流（IKUr）的作用,探讨其抗房性心律失常的机制。方法 采用双酶法分离兔单个心房肌细胞,应用细胞外局部灌流法给药,采用全细胞膜片钳技术记录电流,以观察大蒜素对IKUr的作用。结果 大蒜素200μmol/L对正常兔心房肌细胞IKUr有显著的抑制效应,使IKUr峰值由（14.5±3.2）pA/pF降至（7.9±1.2）pA/pF (P＜0.01,n＝15）。大蒜素可使IKUr的电流-电压曲线降低,且随着除极化电位的增加,作用更加明显,提示其作用具有电压依赖性。同时,发现大蒜素对IKUr的抑制效应存在浓度依赖性,半数抑制浓度（IC50）为149.6μmol/L。门控动力学机制研究发现,大蒜素可以使通道激活曲线右移,延迟激活;使通道稳态失活左移,加速失活;使通道失活后恢复时间延长,减缓通道失活后的再次激活。从不同环节减少IKUr通道的开放,降低电流密度。结论 大蒜素抑制心房肌细胞膜上IKUr,这可能是其治疗房性心律失常的细胞电生理基础。     

大鼠乳鼠心房肌细胞的分离和培养

目的探讨Wistar大鼠乳鼠心房肌细胞的原代分离及培养方法,为细胞电生理或房性心律失常的研究提供心房肌细胞。方法取出生1~3 d的Wistar大鼠的乳鼠,分离心室和心房,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化分离的心房肌组织,差速贴壁法分离心房肌细胞与成纤维细胞,并加入0.5ml Brd U纯化心房肌细胞。高糖培养基培养心房肌细胞,显微镜下观察心房肌细胞形态,通过免疫荧光法测定心房肌细胞纯度。结果成功分离培养心房肌细胞并观察其形态,纯度为94.3%±1.4%,3~4 d出现同步搏动。结论应用差速贴壁法并加用Brd U,可以进一步纯化胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分离的心房肌细胞。     

异丙肾上腺素对犬心房肌细胞动作电位及L型钙电流的影响

目的研究两种浓度的异丙肾上腺素(Isoproterenol,ISO)对犬心房肌细胞(AP)及L型钙电流(ICa,L)的作用。方法采用离体灌注和消化的方法获取心房肌细胞,用全细胞记录技术记录单个心房肌细胞AP以及ICa,L。结果低浓度ISO(10nmol/L)可延长APD,可使90%AP时程(APD90)延长34.4%,并降低AP平台期水平。高浓度ISO(1μmol/L)可减少APD,APD90减少32.1%。两种浓度的ISO均可诱发AP后除极及触发活动。10nmol/L和1μmol/LISO分别增加ICa,L36.7%和49.3%。结论两种浓度的ISO对心肌细胞ICa,L均有促进作用,Ca2+内流引起的肌浆网Ca2+释放可能是房性心律失常的发生机制之一。     

成年家兔心房肌细胞的分离和电生理记录

目的建立一种简单稳定的成年家兔心房肌细胞的分离、培养方法并进行电生理记录。方法麻醉后取出成年家兔心脏,采用Langendorff灌流装置及急性酶裂解法分离心房肌细胞,差速贴壁法进行纯化后培养于DMEM培养基。在倒置显微镜下观察细胞形态,利用透射电镜观察细胞超微结构,用免疫荧光染色法对心房肌细胞进行鉴定,利用全细胞膜片钳技术记录动作电位和内向钙电流和外向钾电流。结果本方法分离的心房肌细胞纯度和细胞存活率较高,并使用膜电钳技术成功记录了L-型钙电流和瞬时外向钾电流。结论该方法简便有效,细胞存活率高且为进一步进行各种电生理实验打下了基础。     

大鼠乳鼠原代心房肌细胞培养的方法及鉴定

目的:介绍大鼠乳鼠心房肌细胞的分离、纯化,以及培养和鉴定方法. 方法:取1d龄SD大鼠心房组织,用0.1％胰蛋白酶和0.025％Ⅱ型胶原酶消化,将心房肌细胞收集在含10％胎牛血清的DMEM培养基中,用差速贴壁和5-溴脱氧尿嘧啶核苷纯化心房肌细胞.观察细胞形态,结合α-横纹肌肌动蛋白抗体免疫荧光鉴定心房肌细胞.结果:细胞培养24 h已完全贴壁,成梭形或三角形,无细胞搏动,细胞体积可逐渐增大.培养细胞经免疫荧光鉴定,95％为心房肌细胞 结论:该研究是一种较好的乳鼠心房肌细胞原代培养及鉴定方法.     

花生四烯酸对冠心病患者心房肌细胞钠电流的抑制作用

目的探讨花生四烯酸对冠心病患者心房肌细胞钠电流的作用.方法膜片钳全细胞记录技术记录应用花生四烯酸前后人心房肌细胞钠电流.结果花生四烯酸对人心房肌钠电流的抑制作用表现为电压依赖性和浓度依赖性,IC50为10.3μM.用药前后,钠电流的激活曲线几乎重叠,50%的通道激活点分别为(-40.8±2.7)mV和(-42.5±3.2)mV(n=10,P＞0.05);钠电流失活曲线左移,50%的通道失活点分别为(-94.5±3.4)mV和(-116.6±4.1)mV,即左移(21.2±3.2)mV(n=11,P＜0.01);钠通道失活后恢复时间显著延长,50%钠通道复活时间分别为(5.9±0.4)ms和(27.3±1.7)ms(n=8,P＜0.01).结论花生四烯酸对冠心病患者心房肌细胞钠电流具有抑制和延长复活时间作用.     

快速起搏心房肌细胞中MAPKs表达的变化

目的 研究快速起搏后心房肌细胞超微结构和丝裂原激活蛋白激酶（MAPKs）表达的变化。方法 原代培养大鼠的心房肌细胞,并建立快速起搏细胞模型。实验分为对照组和快速起搏组,采用Western-blot检测细胞外信号调节激酶（ERK）和p38MAPK的蛋白表达及其磷酸化水平的变化;用透射电镜观察快速起搏24 h后心房肌细胞超微结构的变化。结果 快速起搏24 h后,ERK和磷酸化ERK的表达均较起搏前明显升高(P<0.01);p38MAPK在快速起搏前后的表达无明显变化,而磷酸化p38MAPK的表达则较起搏前明显升高(P<0.01)。经过24 h的快速起搏,心房肌细胞出现糖原聚集、核固缩、空泡样变以及肌浆网扩张、线粒体肿胀、部分线粒体嵴轻度溶解等超微结构的改变。结论 快速起搏早期,原代培养的心房肌细胞超微结构发生了明显改变,同时ERK和p38MAPK被激活,这可能是心房纤颤早期心房肌细胞结构重建发生的重要机制。     

异丙肾上腺素诱导钙离子激活氯电流在兔心房肌细胞电重构中的意义

目的探讨在异丙肾上腺素(ISO)诱导下,兔心房肌细胞L型钙电流(ICa,L)与钙离子激活氯电流(ICl,Ca)之间的变化以及心房肌细胞动作电位(AP)复极相的特征性变化。方法用酶解法分离兔心房肌细胞。全细胞膜片钳技术记录所需离子电流和AP。结果(1)在记录到ICa,L后,加入1μmol/LISO5min,可引出一个非常明显的外向电流,并随着钳制电压的增加,ICa,L峰值逐步减小,而外向电流峰值逐步增加。3mmol/L的4氨基吡啶对这种外向电流不起作用。但150μmol/L的4,4异二硫氮氐2,2′二磺酸可抑制这种外向电流,而几乎只剩下ICa,L。200μmol/L钙通道阻滞剂CdCl2可阻断ICa,L和外向电流。表明该实验在加入ISO后引出最初的内向电流ICa,L之后,被激活的外向电流为ICl,Ca,诱发率为91.67%(P<0.05)。(2)在电流钳制下引出AP后,1μmol/LISO可使正常情况下的AP平台没有,AP呈三角形的尖锥峰形。AP时程的APD50和APD90明显缩短,与对照组相比,分别缩短了80.46%和71.87%,差异有统计学意义。3mmol/L的4氨基吡啶对该AP三角形的尖锥峰几乎没有作用;但4,4异二硫氮氐2,2′二磺酸(150μmol/L)使AP平台得以恢复,与对照组相比,差异无统计学意义。表明正常的心房肌细胞在ISO作用下,与形成AP复极相有关的1相和2相的离子转运发生了改变,Ito2对心房肌细胞AP1相形成起着重要作用。结论兔心房肌细胞在原本只被记录ICa,L情况下,经ISO干预后,细胞内某离子浓度发生了改变,细胞膜上离子通道的开放发生了重新变化,钙离子激活Cl-通道,Ito2表现出了明显优势,使AP时程明显缩短,AP呈三角形的尖锥峰形而无明显平台,心房肌细胞发生了离子通道电重构。离子通道电重构可能起自于ISO诱导的L型钙通道激活氯离子通道开放增加,并且ICa,L降低。这可能揭示离子通道电重构发生的一种机制。也为探讨实验性房性心律失常发生机制提供了又一证据。     

原代心房肌细胞培养及快速起搏细胞模型的建立

目的:利用原代培养的心房肌细胞建立快速起搏模型,对心房颤动(房颤)早期的重构现象进行初步研究。方法:原代培养大鼠心房肌细胞,并建立快速电场刺激起搏细胞模型,利用全细胞膜片钳技术记录刺激前后心房肌细胞的动作电位周期,透射电镜观察细胞超微结构的变化。结果:培养至第4天,细胞生长密度可以达到瓶底70%左右,数目可达(2~3)×109/L,经免疫细胞化学鉴定,90%以上培养细胞α-肌动蛋白抗体染色阳性;全细胞膜片钳记录了培养心房肌细胞及经电场刺激(600次/min,1·5V/cm)24h后的心房肌细胞的动作电位周期,动作电位周期分别为(64·2±4·6)ms和(56·6±4·1)ms,刺激前后差异有统计学意义(P<0·05)。透射电镜观察到刺激后心房肌细胞超微结构发生去分化改变。结论:经快速起搏24h后,心房肌细胞发生了电及结构重构;利用原代培养的心房肌细胞建立快速起搏的房颤模型,可以对房颤早期的重构机制进行研究。