大鼠线粒体ATPase8基因的多态性与表达的研究

目的探讨正常与休克大鼠线粒体ATPase8基因的多态性及基因表达的变化,为休克的防治提供理论基础.方法用透射电镜观察大鼠小肠线粒体形态学变化.用PCR扩增与PUCm-T质粒重组、转入JM109大肠杆菌、Pst1酶切、提取.用PCR扩增、纯化后测序,进行正常与休克组大鼠线粒体突变分析.用RT-PCR检测正常与休克组大鼠mRNA表达的变化.结果电镜观察证明在正常组未见大鼠小肠细胞线粒体的异常改变,休克组可见线粒体肿胀,嵴减少,髓样结构出现.线粒体ATPase-8基因多态性分析发现参照"Rattusnorvegicus,Wistarrat”mtDNA分析,正常大鼠小肠上皮细胞mtDNA第7868位碱基A突变为G(A7868G,)占2/6;C7871T,6/6;7767-7768之间插入G,1/6.失血性休克5h大鼠小肠上皮细胞线粒体突变分析C7871T,2/3;T7772C,占2/3;T7863C,占1/3.7772位氨基酸不变,仍为苯丙氨酸;编码的第7863位氨基酸由苏氨酸变成丙氨酸.RT-PCR显示休克5h大鼠小肠上皮细胞mtDNAATPase-8基因mRNA表达比正常大鼠显著减弱(P＜0.01).讨论近年文献报导,肠道是休克的重要靶器官,休克时肠道线粒体呼吸功能明显下降,但其分子机制尚需探讨.本研究发现休克时大鼠小肠上皮细胞线粒体肿胀、嵴消失,提示休克时线粒体损伤是肠道细胞损伤的关键.ATPase6-8基因是F1F0-ATPase复合物的编码基因,本文检测了6个转化菌落的肠道线粒体正常DNAATPase-8的突变点及突变率,证明本Wistar大鼠和Rattusnorvegicus,Wistarrat存在差异,7871位C变为T,7868位存在中性突变,本结果为探讨缺血缺氧时ATPase-8基因的改变提供了基础.本文报告了失血性休克缺血缺氧大鼠肠上皮细胞线粒体基因及基因表达的改变,证明失血性休克5h大鼠肠上皮细胞线粒体ATPase8基因的多点突变,及由此突变引起的氨基酸的改变.此改变必然导致蛋白质结构的变化,使ATPase-8功能降低.研究还发现,休克时大鼠小肠上皮细胞线粒体ATPase-8基因的mRNA表达显著下降.提示休克时ATP下降、ATP酶活性下降与ATPase-8基因改变和基因表达显著减少有关.结论正常大鼠肠上皮细胞线粒体ATPase8基因存在多态性,休克时小肠上皮细胞线粒体ATPase-8基因改变及表达水平的下降是导致ATPase酶的质和量发生改变以及能量合成下降的重要原因.     

失血性休克肠上皮细胞线粒体形态与功能变化的研究

目的定量分析大鼠失血性休克肠上皮细胞线粒体形态与功能的改变,探讨失血性休克缺血缺氧时肠上皮细胞线粒体结构和功能的改变。方法Wistar大鼠随机分为对照组、失血性休克2h和5h组,采用计量电镜法观察、生物体视学测量线粒体形态,用clark氧电极测线粒体呼吸功能。结果失血性休克2h,线粒体平均截面周长、长径、平均直径及其面密度、体密度分别较对照组增加24%、27%、25%、26%、44%,失血性休克5h,平均截面面积、周长、长径、短径、平均直径及其面密度、体密度分别较对照组增加100%、45%、45%、50%、45%、47%、122%,嵴和基质破坏明显。休克2h组线粒体比表面与正常组比较下降14%。休克5h组线粒体比表面和数密度与对照组比较分别下降32%、24%。休克2h、5h组线粒体呼吸控制率（RCR）与对照组比较均有显著性改变,休克5h组线粒体呼吸控制率比对照组减少32%。结论和讨论失血性休克时大鼠肠上皮细胞线粒体形态发生显著改变。对休克大鼠肠线粒体形态学改变的定量分析表明,休克发生发展过程中,线粒体形态主要改变是,线粒体截面积、周长、长径、短径、平均直径、面密度、体密度、比表面显著增加,数密度下降。定量说明休克缺血缺氧时肠上皮细胞线粒体肿胀发展较快。休克2h后,线粒体膜尚完整,部分线粒体嵴紊乱,有髓样小体、小空泡形成。休克5h后,线粒体显著肿胀,嵴不规则、溶解、断裂和消失,在有嵴存在的线粒体,嵴内腔扩大较2h重,可见较大空泡形成。休克5h线粒体数量明显减少。形态变化是功能改变的基础,体视学方法准确反映了休克时线粒体形态变化过程。 呼吸控制率是表达线粒体功能最灵敏的指标。休克2h后,线粒体呼吸控制率已开始下降,至休克5h已下降32%,说明线粒体状态已明显改变,合成ATP能力下降。线粒体为细胞能量代谢的重要细胞器,三羧酸循环位于基质内,电子传递链和氧化磷酸化的部位在内膜,两者紧密相连。线粒体的结构与其呼吸功能及能量合成功能密切相关。嵴和基质的破坏,引起线粒体三羧酸循环破坏,电子传递受阻,氧摄取困难,加上基质内pH改变,ATP合成酶数量减少,这些因素都影响了线粒体合成ATP的功能。线粒体对缺血缺氧非常敏感,是细胞损伤最早累及的细胞器之一,是细胞保护的重点。保护线粒体,消除细胞内能量代谢障碍,可减轻细胞损伤。预防休克后肠屏障功能破坏对继发的脓毒血症、MODS有重要意义。     

急性缺血性氧大鼠肠上皮细胞线粒体ATPase6基因的表达研究

目的探讨大鼠失血性休克肠上皮细胞凋亡的发生情况,阐述肠道靶学说的分子机理.方法采用DNA凝胶电泳、电镜、光镜以及流式细胞仪分析(FACS)等方法测定了大鼠缺血缺氧后肠上皮细胞凋亡和坏死情况.(1)动物模型Wistar大鼠随机分为正常对照组与失血性休克缺血再灌流组.用戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔麻醉,右侧股动脉插管.按Wigger法放血至平均动脉压5.33kPa,分别在休克2h、3h、5h活杀动物.(2)光镜动物活杀后立即取回盲部小肠5cm,3%戊二醛固定,常规脱水包埋,切片,光镜观察.(3)电镜动物活杀后立即取回盲部小肠5cm,10%甲醛固定.脱水后石腊包埋,切片厚度为2μm,HE染色后光镜下观察.(4)细胞DNA凝胶电泳按戴纪纲等方法分离肠上皮细胞,提取DNA,肠上皮细胞悬液经PBS洗涤2次后,将细胞数调至1×109/L,加annexmv-FITC和碘化丙啶(PI)避光反应10min后,流式细胞仪分析.结果失血性休克缺血再灌流组细胞凋亡主要发生于肠上皮细胞,并可见大量坏死组织;DNAladder呈明显的梯型条带;FACS检测肠上皮细胞凋亡比例明显增多,其最大凋亡率(MAR)较对照组明显增加,与DNAladder结果一致.而对照组未发现附着在小肠上皮细胞的凋亡细胞.讨论大鼠失血性休克后小肠细胞凋亡特征是凋亡细胞主要发生于上皮细胞,凋亡细胞的数量以休克3h后最为明显,最先分布于绒毛顶端,逐步扩散至绒毛中下部,固有层和隐窝也有部分凋亡出现;值得注意的是小肠细胞凋亡出现在休克后早期,说明凋亡过程可能与缺血缺氧和氧自由基有关.严重创伤休克后,大量过度的粘膜细胞凋亡,必然导致粘膜屏障的损伤,导致肠源性感染的发生.因此进一步研究失血性休克后小肠上皮细胞的凋亡机制及药物防治,无疑对临床救治肠源性感染具有十分重要意义.结论失血性休克可诱导肠粘膜上皮细胞凋亡和坏死,其机理可能与缺血缺氧及氧自由基有关.     

失血性休克大鼠肠上皮细胞凋亡的实验研究

目的:探讨大鼠失血性休克肠上皮细胞凋亡的发生情况,阐述肠道靶学说的分子机理.方法:采用DNA凝胶电泳、电镜、光镜以及流式细胞仪分析(FACS)等方法测定了大鼠缺血缺氧后肠上皮细胞凋亡和坏死情况.(1)动物模型:Wistar大鼠随机分为正常对照组与失血性休克缺血再灌流组.用戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉,右侧股动脉插管.按Wigger法放血至平均动脉压5.33 kPa,分别在休克2 h、3 h、5 h活杀动物.(2) 光镜:动物活杀后立即取回盲部小肠5 cm,3%戊二醛固定,常规脱水包埋,切片,光镜观察.(3)电镜:动物活杀后立即取回盲部小肠5 cm,10%甲醛固定.脱水后石腊包埋,切片厚度为2 μm,HE染色后光镜下观察.(4)细胞DNA凝胶电泳: 按戴纪纲等方法分离肠上皮细胞,提取DNA,肠上皮细胞悬液经PBS洗涤2次后,将细胞数调至1×109/L,加annexm v-FITC和碘化丙啶(PI)避光反应 10 min后,流式细胞仪分析.结果:失血性休克缺血再灌流组细胞凋亡主要发生于肠上皮细胞,并可见大量坏死组织;DNA ladder呈明显的梯型条带;FACS检测肠上皮细胞凋亡比例明显增多,其最大凋亡率(MAR)较对照组明显增加,与DNA ladder结果一致.而对照组未发现附着在小肠上皮细胞的凋亡细胞.讨论:大鼠失血性休克后小肠细胞凋亡特征是:凋亡细胞主要发生于上皮细胞,凋亡细胞的数量以休克3 h后最为明显,最先分布于绒毛顶端, 逐步扩散至绒毛中下部,固有层和隐窝也有部分凋亡出现;值得注意的是小肠细胞凋亡出现在休克后早期,说明凋亡过程可能与缺血缺氧和氧自由基有关.严重创伤休克后,大量过度的粘膜细胞凋亡,必然导致粘膜屏障的损伤,导致肠源性感染的发生.因此进一步研究失血性休克后小肠上皮细胞的凋亡机制及药物防治,无疑对临床救治肠源性感染具有十分重要意义 .结论:失血性休克可诱导肠粘膜上皮细胞凋亡和坏死,其机理可能与缺血缺氧及氧自由基有关.     

海水浸泡失血性休克大鼠肝、心肌线粒体功能的改变

目的研究海水浸泡对失血性休克大鼠心、肝线粒体功能的影响.方法雄性Wistar大鼠30只,分为3组正常对照组(n=10);平原失血性休克组(n=10);海水浸泡失血性休克组(n=10).测定血流动力学及心肌和肝细胞线粒体H+-ATPase、琥珀酸脱氢酶、Ca2+-Mg2+-ATPase、质子转运及线粒体总钙的变化.取心室肌和肝脏各6g,制备线粒体和亚线粒体,线粒体及亚线粒体制备按差速离心法;H+-ATPase采用定磷法;SDH采用氯化三苯四唑法;MDA采用国产试剂盒;Ca2+-Mg2+-ATPase活性测定采用蒋纬莹法加以改进;亚线粒体质子跨膜转运的测定采用荧光探剂ACMA(9-氨基-6-氯-甲氧基吖啶)标记法;若测定ATP引起的跨膜[H+]转运,则先加入呼吸链阻断剂氰化钾(1mmol/L)以阻断细胞色素C到氧的电子传递,测定时先进行ACMA激发波长[EX]和发射波长[EM]的扫描,记录荧光强度和荧光淬灭时间;线粒体钙含量采用原子吸收法测定.结果海水浸泡失血性休克动物血液动力学,心肌和肝细胞线粒体H+-ATPase、琥珀酸脱氢酶、Ca2+-Mg2+-ATPase活性均显著低于正常对照组和平原休克组.海水浸泡失血性休克组心、肝线粒体H+-ATPase活性分别降为对照值的78%和76%;海水浸泡SDH值降为对照值的42%;Ca2+-Mg2+-ATPase活性分别为对照组的63%和70%;肝、心肌组织钙含量分别为对照组的2.97、1.70倍;肝细胞亚线粒体测定质子跨膜线粒体内膜转运能力,ACMA最大荧光淬灭幅度△Amax稍有减少,ATP激活的荧光淬灭时间显著延长(P＜0.01),以NADH诱导的荧光淬灭时间也显著延长.亚线粒体质子转运能力与平原休克组无显著差别.结论线粒体是机体能量代谢、ATP合成和水解的重要部位.海水浸泡失血性休克心肌、肝线粒体酶活性下降,线粒体总钙升高,伤情比平原显著加重.     

休克再灌注后早期UCP—2对线粒体膜电位的影响作用

目的通过观察休克-再灌注大鼠肠上皮、骨骼肌、心肌细胞线粒体UCP-2的变化规律及其对线粒体膜电位(MP)的影响,探讨休克再灌注后不同组织线粒体功能发生差异性损伤的机制.方法取150-220gWistar大鼠,复制休克再灌注模型,差速离心法游离肠上皮、心肌、骨骼肌细胞线粒体,用Westernblot法测量UCP-2含量,用荧光分光光度计法测量线粒体膜电位.实验分组如下对照组(假手术)、单纯休克组(40mmHg90min)、再灌注(单纯休克+回输全部失血量及2倍失血量的晶体液)2h组、再灌注6h组、再灌注12h组、再灌注24h组.结果(1)失血性休克90min后,3种组织线粒体UCP-2均有升高,与对照组相比有显著差异(P＜0.05),肠上皮线粒体UCP-2在再灌注后24h内均高于对照组(P＜0.05),心肌线粒体UCP-2于再灌注后2h高于对照组,但再灌注后6h与对照组相比无显著差异(P＜0.05),骨骼肌线粒体UCP-2于再灌注后6h高于对照组,但再灌注后12h与对照组相比无显著差异(P＜0.05);(2)在测量MP的各组实验中,加入UCP-2抑制剂GDP后MP均高于无GDP处理组(P＜0.01);(3)休克及再灌注后24h内,肠上皮细胞线粒体MP均比对照组降低,心肌线粒体MP于休克及再灌注后2h低于对照组,于再灌注后6h与对照组相比无显著差异,骨骼肌线粒体MP于休克及再灌注后2h低于对照组,于再灌注后6h与对照组相比无显著差异,但再灌注后12-24h骨骼肌线粒体MP又低于对照组(P＜0.05).讨论近来认为,UCP-2使质子泄漏引起MP降低,其结果导致氧化磷酸化解偶联,ATP合成效率降低,同时能够降低4态呼吸时线粒体内ROS的产生.本实验也证实,加入GDP抑制UCP-2的质子转运活性,线粒体MP增高.休克导致线粒体UCP-2表达上调,再灌注后UCP-2水平逐渐恢复,但不同组织中UCP-2的变化规律不同,心肌细胞线粒体UCP-2水平恢复较快,骨骼肌及肠上皮恢复较慢,这可能与休克时不同组织的缺血程度不同有关,其结果与MP及线粒体功能的恢复可能有关,这可能是导致休克再灌注后不同组织线粒体功能发生差异性损伤的机制之一.结论本实验结果提示UCP-2可能介导休克-再灌注后MP的调节,休克再灌注后,不同组织中线粒体UCP-2的变化规律不同,可能与休克再灌注后不同组织线粒体功能发生差异性损伤有关.     

失血性休克与线粒体损伤及药物保护

本文就失血性休克时线粒体损伤,损伤机理及药物保护的研究进展作一概述.以进一步探讨线粒体损伤在失血性休克发病中的作用及防治措施.一、失血性休克时线粒体损伤主要表现为(1)线粒体超微病理改变动物实验已证实,失血性休克时可使心肌、肝脏、肠、胰腺线粒体肿胀、空泡、嵴减少和消失、部分线粒体膜不完整、数量减少等病理改变.(2)线粒体功能障碍表现为线粒体呼吸抑制;线粒体氧化磷酸化有关酶活性的抑制;线粒体离子调节功能的抑制;线粒体内膜脂类组成发生改变;线粒体DNA及mRNA表达的改变.线粒体发生上述一系列的功能障碍,最终导致ATP形成极度减少,细胞能量代谢衰竭.二、失血性休克致线粒体损伤的可能机理(1)溶酶体的释放是线粒体损伤原因之一,体外实验表明溶酶体酶对线粒体的呼吸、酶活性、Ca2+转运能力均具抑制作用.(2)缺氧与氧利用障碍失血性休克时线粒体氧化磷酸化功能障碍除了与组织低灌流性缺氧有关,可能与线粒体内膜呼吸链电子传递活性下降致使氧利用能力降低直接有关.(3)细胞酸中毒,细胞酸中毒时会严重抑制线粒体呼吸功能,尤其是对NADH呼吸链的抑制.(4)线粒体内膜损伤,线粒体氧化磷酸化功能取决于线粒体内膜结构的完整.而内膜损伤会丢失呼吸链的组分及酶的辅助因子,最终影响呼吸链的正常运行.(5)抑制剂或解偶联剂,机体组织内FFA、甲状腺素等能使线粒体氧化磷酸化解偶联.在失血性休克或缺血缺氧等病理情况下组织内FFA明显升高,从而抑制线粒体的呼吸功能.(6)钙超载失血性休克后H+-ATP酶活性的降低与线粒体内Ca2+含量呈显著负相关,表明线粒体H+-ATP酶活性损伤程度与线粒体内Ca2+超载的程度有密切关系.(7)氧自由基氧衍生的自由基参与了失血性休克时的线粒体损伤.氧自由基与线粒体膜上的不饱和脂肪酸反应,产生脂质过氧化物(主要是丙二醛),后者或直接损伤线粒体膜,使其通透性增加;或与溶酶体释放的酶蛋白相互作用,发生交联反应,降低膜流动性,损伤溶酶体,使其中的酶得以释放,激活,间接损伤线粒体.三、失血性休克诱导线粒体损伤的药物保护(1)糖皮质激素,它能直接稳定线粒体膜,或通过稳定溶酶体膜抑制酸性水解酶的释放而间接保护线粒体,也可能是通过改善微循环而保护线粒体.(2)钙通道阻止剂如维拉帕米、硫氮卓酮具有抗失血性休克和保护线粒体的作用.可能是通过升高MAP,从而改善各器官组织血液供应,减少缺血损伤和通过钙通道阻滞作用,阻止失血性休克所致的钙内流,减轻细胞内Ca2+超载,避免了线粒体内Ca2+的过度积聚,从而保护线粒体的功能.(3)钙增敏剂,新型钙增敏剂哒嗪酮能延缓线粒体Ca2+超载的进程,减轻线粒体H+-ATP酶活性的损伤程度,保护失血性休克大鼠肝线粒体.(4)莨菪类药物,这类药物中的盐酸莨菪碱、溴丁基东莨菪碱及氢溴酸樟柳碱已被报道具有抗大鼠失血性休克、保护线粒体的作用.(5)外原性SODSOD能清除自由基,直接或间接地稳定线粒体膜,改善细胞呼吸功能,增加能量供给,从而促使休克细胞走上良性循环.(6)丹参通过改善微循环,对抗氧自由基的反应性损伤,抑制钙内流,改善线粒体的氧化代谢,恢复组织细胞的能量供应而发挥其治疗作用.(7)人参皂甙可通过抗自由基和抑制Ca2+内流而保护失血性休克鼠心肌线粒体.(8)川芎嗪具有清除氧自由基,降低脂质过氧化反应,减轻氧自由基介导的线粒体膜结构与功能的损害,从而保护线粒体.总之,失血性休克对组织细胞线粒体的损伤是非常明显的,其损伤机理是复杂的.鉴于线粒体在细胞生命活动中特殊的功能和地位,进一步阐明线粒体的损伤机理,探索和发现具有抗失血性休克、保护线粒体的药物,无疑在防治"不可逆”性休克的理论与实践中具有重要意义.     

肠淋巴管结扎对失血性休克大鼠肺组织基因表达谱的影响

目的：应用DNA芯片技术,检测和分析肠淋巴管结扎对失血性休克大鼠肺组织基因表达谱的影响,筛选肠淋巴途径与休克肺损伤的相关基因。方法：20只Wistar雄性大鼠随机分为休克组与休克肠淋巴管结扎组,无菌手术,均复制重症失血性休克模型;输液复苏后休克肠淋巴管结扎组行肠淋巴管结扎,休克组仅在肠淋巴管下穿线;于输液复苏后3 h无菌留取固定位置肺组织,制备匀浆,提取总RNA,反转录cDNA,制备Cy3和Cy5标记的cDNA探针,与包含12 028种基因的大鼠全基因组cDNA芯片杂交,分析差异表达基因。结果：在获得的6 979个有效数据中,2组的基因转录变化在2倍以上的基因共有218个,其中肠淋巴管结扎引起失血性休克大鼠肺组织7个基因上调,211个下调。这些差异表达基因编码蛋白的功能涉及运输、转录调控、信号转导、应激、代谢、细胞发育与分化、细胞黏附、细胞凋亡等方面。结论：肠淋巴管结扎干预休克肺损伤的机制与上调或下调上述相关基因的表达有关。     

急性缺氧缺血后亚低温对新生鼠脑能量代谢的影响

目的:研究亚低温治疗对缺氧缺血脑损伤(HIBD)新生大鼠的脑组织葡萄糖、ATP水平的影响及对脑线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)、复合酶II的活性及ATP合成能力的影响,以探讨亚低温的神经保护机制。方法:将HIBD模型鼠随机分为缺氧缺血(HI)常温恢复组和亚低温干预组,同时设对照组。各组动物在HI后不同时点(0、2、6、24、48、72h)断头取脑,测定脑匀浆葡萄糖及ATP含量;用密度离心及差速离心法提取线粒体,生化法测定脑线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)和复合酶II的活性,并用酶萤光法检测脑线粒体的ATP合成能力。结果:缺氧缺血常温恢复组脑组织匀浆葡萄糖在HI后即刻明显低于HI前,HI后2h与HI前无显著差异。脑ATP的量及SDH活性在HI后2、6h先下降后恢复,72h达高峰但仍明显低于正常;脑线粒体复合酶II的活性及脑线粒体ATP合成能力在HI后2h开始恢复,6h出现第二次下降,72h与正常无显著差异。亚低温干预组各时点脑组织ATP、脑线粒体SDH活性、脑线粒体复合酶II的活性及ATP的合成能力均显著高于同一时点常温组,ATP在24h与正常对照组无明显差异,SDH在72h与正常对照组无明显差异,复合酶II在48h与正常对照组无明显差异,ATP合成能力在24h与正常对照组无明显差异。结论:亚低温可减轻HIBD大鼠脑组织ATP含量、线粒体SDH及复合酶II活性的下降,增加脑ATP的合成,改善能量代谢,从而保护脑组织。     

失血性休克后调控VSM舒缩功能的信号分子变化及意义

目的研究失血性休克后血管平滑肌细胞收缩功能的主要信号转导途径的变化及其意义.方法及结果本研究分3部分.1.调控正常VSMC舒缩功能的主要信号转导途径,以人脐动脉平滑肌细胞为实验对象,以测微网测定其长度变化为指标,在K-H液中分别观察PKC特异性激动剂PMA,特异性阻滞剂H7,CaM特异性阻滞剂W-7以及去甲肾上腺素NE为工具药,结果证明PMA可引起HVASMC收缩,H-7可明显抑制但W-7无明显影响,说明PKC活化可引起VSMC的收缩.NE引起HVASMC收缩,H-7、W-7能明显抑制NE的作用.两者伍用对NE的抑制作用更强.故说明在调控VSMC的舒缩功能存在两条转导途径,即PKC途径及Ca2+-CaM途径.2.失血性休克后VSM收缩的Ca2+-CaM途径的主要信号分子变化如同前文方法复制大鼠失血性休克模型,分离去内皮的胸主动脉,以流式细胞仪测VSMC的[Ca2+]i及CaM,进行VSM组织中CaM、CaMKII-α的Westernblot杂交,测VSM组织细胞膜及线粒体ATP酶活性,其结果为休克后VSMC胞浆[Ca2+]i显著升高,游离CaM下降及总CaMKII-α表达下降,但总CaM升高.VSM组织中Ca2+-ATPase及Na+-K+ATPase活性下降,但线粒体中上列二酶活性升高.实验结果提示休克后(1)细胞内钙超载,它可导致VSM的舒缩功能障碍;(2)VSM中总CaM升高但游离CaM下降,提示能与胞浆中结合而发挥收缩效应的CaM明显减少;(3)VSMCaMKII-α表达下降,提示其使MLCK、MLC磷酸化而导致VSM收缩的能力下降;(4)细胞膜上ATP酶活性下降更导致胞内钙超载,而线粒体ATP酶活性增强,则更进一步加重线粒体钙超载进而加重功能损伤.3.失血性休克后VSM收缩PKC途径主要信号分子变化CPKC在休克后大鼠胸主动脉平滑肌中的表达下降而calponin-α上升.Calponin-α在各器官中的表达与分布的免疫组化检测证实,在大鼠肝、肾、心实质细胞均不表达,但器官中的动静脉血管平滑肌细胞表达,上列结果提示,G蛋白-PKC途径、Ca2+依赖性CPKC及Ca2+非依赖性PKC-ζ两种机制都参与休克后VSM收缩系统的调控,前者下降表明磷酸化MLC及增加[Ca2+]i能力减弱,收缩力下降,后者上升证明抑制肌球蛋白的Mg2+-ATPase活性增加对VSM收缩的抑制能力加强.结论失血性休克VSM舒缩功能变化有Ca2+-CaM及G蛋白-PKC途径参与调控,后者有Ca2+依赖性CPKC及Ca2+非依赖性PKC-ζ两种机制都参与其调控机制.     

线粒体功能障碍致休克大鼠淋巴管低反应性的作用

<正>目的:以线粒体保护剂环孢菌素A(Cs A)作为干预因素,观察线粒体功能障碍在失血性休克淋巴管低反应性中的作用。方法:建立失血性休克大鼠模型(40 mm Hg,3 h),休克+Cs A组在低血压1 h后注射Cs A(6 mg/kg)。观察Cs A对胸导管组织淋巴管平滑肌细胞(LSMCs)线粒体超微结构的影响;制备胸导管组织匀浆,应用高效液相色谱方法检测与线粒体功能相关的     

肉苁蓉对败血症大鼠胸腺细胞的保护作用

目的：探讨肉苁蓉提取物对败血症休克大鼠胸腺细胞凋亡的影响及其可能机制。方法: 盲肠结扎穿孔术（CLP）造成大鼠败血症休克。防治组术前14 d开始给药（1.25 g/kg），分别于术后12 h、24 h取材。流式细胞仪检测细胞凋亡率和线粒体膜电位，分光光度法测定细胞线粒体ATP酶活力。结果 预先给予肉苁蓉提取物的大鼠，行CLP术后12、24 h胸腺细胞凋亡率均低于模型组（P<0.01），线粒体膜电位和ATP酶活力则显著上升（P<0.01）。结论： 肉苁蓉提取物对败血症休克时胸腺细胞有保护作用，其机制可能是提高ATP酶活力，维持了细胞线粒体膜电位。     

Rho激酶和PKC在环孢素A改善休克血管反应性中的作用及与MPTP的关系

目的：观察Rho激酶和PKC在环孢素A( CsA)改善创伤失血性休克大鼠血管反应性中的作用及与线粒体通透性转换孔(MPTP)开放的关系。方法采用创伤失血性休克大鼠模型和缺氧培养的血管平滑肌细胞(VMSC),观察了Rho激酶和PKC在CsA调节休克血管反应性中的作用,以及对血管平滑肌细胞线粒体MPTP开放的影响,同时观察CsA对休克动物炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响。结果 CsA明显改善了休克血管反应性,Rho激酶抑制剂Y27632可显著拮抗CsA恢复休克血管反应性的作用,但是PKC抑制剂staurosporine对CsA的作用无明显影响。 CsA和Rho激酶激动剂U46619都可抑制缺氧后线粒体MPTP的开放程度。休克后大鼠血液中TNF-α和IL-1β的浓度均显著增加,但CsA处理仅使其轻微减少。结论 CsA可以通过抑制线粒体MPTP开放改善休克后血管的低反应性,发挥对创伤休克的治疗作用。 Rho激酶参与了这其中的调节过程。     

基质细胞衍生因子1预处理抑制大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡

背景：研究发现基质细胞衍生因子1除参与趋化干细胞定向迁移途径,还具有抗凋亡作用。 目的：观察基质细胞衍生因子1预处理后对骨髓间充质干细胞凋亡的影响。 方法：以不同浓度H₂O₂诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡,取最适宜浓度100 μmol/L用于实验。不同质量浓度基质细胞衍生因子1干预100 μmol/L H₂O₂诱导后的大鼠骨髓间充质干细胞,选择0.2 mg/L最佳保护质量浓度用于实验。取第3代大鼠骨髓间充质干细胞,随机分组：正常对照组不进行任何处理;损伤组在培养液中加入H₂O₂作用24 h;基质细胞衍生因子1预处理组于H₂O₂损伤细胞前6 h加入基质细胞衍生因子1;基质细胞衍生因子1+AMD3100(基质细胞衍生因子1受体CXCR4的阻断剂)组于H₂O₂细胞损伤前6 h加入基质细胞衍生因子1与AMD3100共孵。 结果与结论：H2O2能体外模拟缺血缺氧环境诱导骨髓间充质干细胞凋亡,且作用呈剂量依赖性。与损伤组比较,加入基质细胞衍生因子1预处理后细胞凋亡明显减轻(P < 0.01),细胞E2F6基因表达增强(P < 0.05),E2F1基因表达减少(P < 0.05),线粒体细胞色素C转位减少(P < 0.05),Caspase-3活性降低(P < 0.05),AMD3100可阻断基质细胞衍生因子1对骨髓间充质干细胞的保护作用。提示基质细胞衍生因子1可能通过增强E2F6基因,负性调控E2F1基因抑制线粒体损伤导致的骨髓间充质干细胞凋亡。     

CD226基因敲除减轻小鼠失血性休克急性肺损伤

目的探讨内皮细胞特异性敲除CD226(CD226 CKO)对小鼠失血性休克急性肺损伤的影响及其机制。方法雄性野生型(WT)和CD226 CKO小鼠随机分为假手术组和失血性休克组,假手术组只进行心脏穿刺不抽血,失血性休克组抽取30%的总血量。HE染色观察肺脏病变情况,免疫荧光组织化学染色检测肺组织CD31、 CD226和脾脏CD3、 CD226的表达和分布;采用RNA干涉技术(RNAi)敲除人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的CD226,厌氧产气袋培养法建立细胞缺氧模型; Western blot法检测小鼠肺组织和HUVEC中Bcl2的蛋白表达; JC-1线粒体膜电位染色检测细胞早期凋亡。结果在失血性休克模型中,与WT小鼠相比, CD226 CKO小鼠急性肺损伤明显减轻,肺组织中Bcl2表达水平升高;体外缺氧细胞学模型同样发现,与siRNA阴性对照(siNC)组细胞相比,特异性敲低CD226的细胞Bcl2蛋白水平增加,细胞凋亡减少。结论敲除CD226基因减轻小鼠失血性休克的急性肺损伤,与增加血管内皮细胞Bcl2的表达、减少细胞凋亡密切相关。     

缺氧缺血损伤新生大鼠大脑海马组织线粒体DNA羟甲基化水平

目的本研究检测新生大鼠缺氧缺血大脑损伤后海马组织线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)5-羟甲基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶甲基化的修饰水平差异。方法采用右颈总动脉血管结扎的方法构建新生大鼠缺氧缺血大脑损伤模型,大鼠模型随机分成3组,对照组和分别处理24h和48h的大鼠模型。提取各组mtDNA样本并采用化学氧化法结合重亚硫酸盐转的测序技术检测5hmC和5mC的水平。qPCR和Western blot验证5hmC重要调节酶(TET1,TET2及DNMT1)及呈现5hmC修饰差异的基因的mRNA水平。结果解剖发现结扎后24h和48h大鼠模型的后海马部位出现缺血。海马组织mtDNA的oxBS-Seq结果显示模型组24h、48h海马mtDNA的5hmC和5mC的水平高于对照组(P0.05)。qPCR和Western blot结果显示模型组5hmC重要调节酶TET2,DNMT1的mRNA和蛋白表达水平高于对照组(P0.05)。此外,mtNDA中呈现5hmC修饰差异的CO1、APT6和ND2基因mRNA表达水平显著高于对照组(P0.05)。结论新生大鼠缺氧缺血大脑损伤后海马组织线mtDNA的5hmC和5mC含量与正常组织存在差异。线粒体5hmC相关酶和CO1、APT6和ND2的上调提示HIE中5hmC可能与mtDNA中CO1,ATP6和ND2基因的转录调节具有调控作用。     

微波辐射对血小板线粒体基因的影响

利用血小板作为电磁辐射的细胞学模型，用900MHz的电磁波辐照血小板，电磁波的功率密度分别为40μW／cm^2、5mW／cm^2，辐照时间为60分钟；然后选取血小板线粒体ATP合成酶6（ATPase6）及ATP合成酶8（ATPase8）基因作为观察指标。通过多聚酶链反应（polymerase chain reaction．PCR）及琼脂精凝胶电泳和基因克隆测序方法发现：频率为900MHz、功率密度为40μM／cm^2、5mW／cm^2的电磁波辐照血小板60分钟后未见ATPase6和ATPase8的基因出现断裂或突变。     

β-内啡肽及其受体对创伤失血性休克大鼠细胞免疫功能的调节作用

本文通过研究β-内啡肽对创伤失血性休克大鼠细胞免疫功能的调节作用,并进一步分析β-EP通过何种阿片受体亚型介导在创伤失血性休克后细胞免疫抑制中作用,以期从神经-内分泌-免疫网络角度探讨创伤后免疫紊乱的机制.实验以正常大鼠脾细胞为靶细胞,以代表T细胞免疫功能的conA诱导的脾细胞增殖、IL-2的分泌及IL-2R的表达为观察指标,采用离体实验的方法,分别用β-EP抗血清、δ、κ高选择性受体拮抗剂naltrindole(NTI)、Nor-BNI、及μ相对选择性受体拮抗小剂量naloxone(NAL)为工具药进行研究.实验首先通过测定创伤失血性休克不同时相血浆β-EP对脾细胞增殖功能、IL-2分泌及IL-2R表达的影响,进一步观察休克血浆经β-EP抗血清预处理后对脾细胞功能的作用,以证明β-内啡肽是否直接参与大鼠创伤失血性休克后细胞免疫受抑中的作用.实验第二部分用1-1000nmol/L的NTI、Nor-BNI及1-100nmol/LNAL体外作用于含休克血浆的脾细胞培养体系,观察脾细胞功能的变化,以探讨β-EP通过何种受体介导在创伤失血性休克后细胞免疫抑制中作用.结果表明创伤失血性休克后即刻(0h)至休克后6h血浆β-EP水平显著升高,休克血浆非常显著地抑制正常大鼠脾细胞功能,休克血浆β-EP含量与脾细胞增殖功能、IL-2分泌及IL-2R表达呈显著负相关,β-EP抗血清显著降低休克血浆对脾细胞功能的抑制,结果直接证实了β-EP在创伤失血性休克后免疫抑制中有重要的作用.δ、κ受体拮抗剂NTI、Nor-BNI剂量依赖性地显著逆转休克血浆对脾细胞功能的抑制,小剂量NAL无作用,提示创伤性休克后β-EP可能主要通过与δ、κ受体结合发挥免疫抑制作用,未观察到与μ受体有关.     

休克淋巴液对大鼠肺微血管内皮细胞凋亡相关基因表达的影响

目的：观察休克淋巴液对大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）凋亡相关基因表达的影响，探讨休克淋巴液诱导PMVECs细胞凋亡的分子机制。方法：无菌条件下复制大鼠重症失血性休克模型，引流休克时肠系膜淋巴液或收集门静脉血，同时引流正常的淋巴液或正常门静脉血作为对照。以不同处理因素与第3代原代培养的PMVECs共同孵育，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率，RT-PCR检测凋亡相关基因bcl-2、bax及fas、fas L的表达。结果：4%终浓度的休克淋巴液作用4 h后，PMVECs凋亡率为9.86%±3.24%，显著高于其它组（P<0.01）；4%终浓度的休克淋巴液作用6 h后，PMVEC的fas、fas L、bax mRNA表达高于其它组、bcl-2 mRNA表达低于其它组（P<0.01）。结论：休克淋巴液可诱导大鼠PMVECs凋亡，其机制与凋亡促进基因fas、fas L、bax表达增强、凋亡抑制基因〖STBX〗bcl-2〖STBZ〗表达降低有关。     

缺血预处理对失血性休克大鼠血管反应性及钙敏感性的影响

目的：观察缺血预处理对失血性休克血管反应性和钙敏感性的影响。方法：通过观察不同缺血预处理方法对失血性休克大鼠存活时间和24 h存活率的影响,选择最适缺血预处理方法。在体实验,观察缺血预处理对失血性休克大鼠肠系膜上动脉（SMA）血管管径对去甲肾上腺素（NE）收缩反应性和NE升压反应的影响;离体实验,应用离体血管环张力测定技术,观察缺血预处理对失血性休克后大鼠SMA环血管反应性和钙敏感性的影响。结果：确定最适缺血预处理方法为：夹闭腹主动脉1 min,开放5 min,重复3次,2 h后复制失血性休克模型,这种方法可显著增加失血性休克大鼠的存活时间和24 h存活率。在体实验,缺血预处理可显著增加休克晚期NE的升压效应和在体SMA对NE的收缩反应（P<0.01）。离体实验,与失血性休克对照组比较,缺血预处理组SMA在休克早期(休克即刻)对NE的收缩反应性和钙敏感性明显下降（P<0.05）,但与正常对照组比较无显著差异（P>0.05）;在休克后期（休克2 h、3 h、4 h）,缺血预处理组SMA对NE的收缩反应性和钙敏感性显著增加（P<0.05）,且与正常对照组比较无显著差异（P>0.05）。结论：缺血预处理可能通过改善血管钙敏感性发挥对休克后期血管反应性的保护效应。