HBV DNA定量检测方法的评价

目的协助临床检验工作者及科研人员选择适合本单位实际条件的HBV DNA定量检测方法。方法采用核酸分子杂交、荧光定量PCR、微板核酸杂交三种方法对89例乙型肝炎大三阳患者进行HBV DNA测定。结果三种方法测定结果依次为荧光定量PCR法阳性89例，微板核酸杂交法阳性8l例，斑点杂交法阳性62例，三种方法均阳性61例。结论斑点杂交法准确性和特异性较高，适合于流行病学调查和药物观察等研究。荧光定量PCR技术灵敏度较高，若能提高其检测结果的准确性，它应为临床及科研之首选方法。微板核酸杂交技术有较高的灵敏度和特异性，操作简便，可常规普及。     

HBV DNA检测阳性病人其血清学模式分析

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染的血清标志物是目前临床诊断乙肝病毒感染和观察治疗效果的重要指标;随着分子生物学技术的发展,聚合酶链反应技术(PCR)被广泛应用,对HBV感染的诊断已从免疫学检测发展到核酸检测水平,患者血清的HBV DNA定量测定对临床诊疗及预后判断均具有重要意义。本研究采用HBV DNA荧光定量PCR和酶联免疫(ELISA)对2943份检测阳性的病人中血清学标志物常见模式分布情况,及HBV DNA拷贝数与血清学模式之间的关系。探讨两种检测方法之间的相关关系、及荧光定量PCR技术检测乙肝病毒DNA的临床意义。…     

斑点核酸杂交和荧光定量聚合酶链反应检测HBV DNA方法比较

目的　评价斑点杂交 (DH)和荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)检测乙型肝炎病毒核酸 (HBVDNA)的临床应用价值。方法　用DH和FQ PCR分别检测乙型肝炎患者血清 2 39例和健康体检者血清 4 1例的HBVDNA。乙型肝炎血清学标志物用ELISA测定。结果　用DH和FQ PCR检测HBVDNA阳性率分别为 :HBeAg( )组 78.0 7%和 10 0 % (P <0 .0 1) ;抗HBe( )组 18.18%和 77.2 7% (P <0 .0 1) ;HBeAg( )、抗HBe( )组11.86 %和 4 4 .0 7% (P <0 .0 1)。健康体检者两法均为阴性。结论　FQ PCR对乙型肝炎诊断、传染性的判断和抗病毒药物疗效评价方面比DH更具有临床应用价值。     

斑点核酸杂交和荧光定量聚合酶链反应检测HBV DNA方法比较

目的评价斑点杂交(DH)和荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)的临床应用价值.方法用DH和FQ-PCR分别检测乙型肝炎患者血清239例和健康体检者血清41例的HBV DNA.乙型肝炎血清学标志物用ELISA测定.结果用DH和FQ-PCR检测HBV DNA阳性率分别为HBeAg(+)组78.07%和100%(P<0.01);抗HBe(+)组18.18%和77.27%(P<0.01);HBeAg(-)、抗HBe(-)组11.86%和44.07%(P<0.01).健康体检者两法均为阴性.结论 FQ-PCR对乙型肝炎诊断、传染性的判断和抗病毒药物疗效评价方面比DH更具有临床应用价值.     

HBV DNA定量检测方法的评价

目的　协助临床检验工作者及科研人员选择适合本单位实际条件的HBV DNA定量检测方法。方法　采用核酸分子杂交、荧光定量PCR、微板核酸杂交三种方法对89 例乙型肝炎大三阳患者进行HBV DNA测定。结果　三种方法测定结果依次为荧光定量PCR法阳性89 例,微板核酸杂交法阳性81例,斑点杂交法阳性62例,三种方法均阳性61 例。结论　斑点杂交法准确性和特异性较高,适合于流行病学调查和药物观察等研究。荧光定量PCR技术灵敏度较高,若能提高其检测结果的准确性,它应为临床及科研之首选方法。微板核酸杂交技术有较高的灵敏度和特异性,操作简便,可常规普及。     

串联重复序列信号放大液相杂交检测HBV-DNA技术的建立及评价

目的 建立串联重复序列信号放大(TRSE)液相杂交系统检测HBV-DNA技术,并初步评价其效果。方法 在前期研究构建的含24个60 bp串联重复核酸片段的重组噬菌粒中,插入4个HBV DNA片段而构建成一级检测探针,并结合12个串联重复的二级放大探针和标记的三级探针,建立检测HBV DNA的TRSE液相杂交系统。采用含HBV全基因组的重组质粒DNA对355份肝炎患者或正常人群的血清样本进行检测,评价该系统的效果。结果 在检测探针的一侧插入HBVDNA片段后,建立了HBV DNA的TRSE液相杂交检测系统。检测含HBV全基因组的重组质粒DNA的敏感性为8.33×104拷贝/ml。检测血清样本时,可区分HBeAg阳性与阴性患者间的HBV DNA水平差异。结论 TRSE液相杂交检测HBV DNA系统具有较好的敏感性、特异性和实用性。串联重复核酸序列信号放大的模式具有进一步开发利用的价值。     

实时荧光定量PCR检测HBV—DNA在诊断乙型肝炎中的价值

目的：分析实时荧光定量PCR（Real Time PCR）检测HBV—DNA在诊断乙型肝炎病毒（HBV）中的作用。方法：分别用实时荧光定量PCR和ELISA方法检测389份临床病人血清，并用t检验分析比较HBV—DNA阳性结果。结果：在血清学标志物组合模式中，多种组合都可检测出HBV—DNA含量，尤其是在传统认为没有HBV感染的血清中也可检测到一定程度的HBV—DNA含量。结论：实时荧光定量PCR检测HBV—DNA是乙肝病毒在体内复制和传染的可靠指标，特别是在反映HBeAg阴性的乙型肝炎患者是否有病毒复制的诊断中有重要意义。     

两种乙型肝炎病毒DNA定量检测方法的比较与评价

目的：评价两种定量检测乙型肝炎病毒（HBV）DNA方法的特点，方法：用美国DIGENE公司生产的Hybrid Capture-II HBV DNA试剂（HC－Ⅱ）和深圳匹基生物工程股份有限公司生产HBV DNA定量荧光PCR检测试剂（PG），定量检测HBsAg阳性的慢性乙肝患者血清中的HBV DNA，结果：HC－Ⅱ试剂的HBV DNA检测阳性率高达98．6％，PG试剂达到94．6％，两者的符合率为93．2％。用系列稀释的患者血清，测定两种定量检测方法的灵敏度，PG试剂略高于HC－Ⅱ试剂，HCⅡ在HBVDNA浓度较高时的关系精度较好，而在HBV DNA低滴度时，两者的定量误差均加大。用两种HBV，DNA定量检测方法监测抗病毒药物治疗慢性乙型肝炎的疗效，所测定的HBV DNA滴度呈相同变化趋势。结论：两种HBV DNA定量检测方法均有较高的灵敏度，在抗病毒药物疗效观察方面有较高的应用价值。     

三种HBV DNA提取方法对荧光定量PCR检测结果影响的比较

目的 研究3种核酸提取方法对黄疸、溶血和脂血标本HBV DNA荧光定量结果的影响,为进一步提高临床检验质最和改进检测技术提供理论依据.方法 采用目前临床常用的多聚糖病毒沉淀浓缩法(PEG法)、碱液直接裂解和微量核酸释放剂(Micro-Nucleic-Releaser,MNR)等3种核酸提取方法,对含有HBV的黄疸、溶血和脂血标本进行荧光定量PCR检测,研究不同标本对荧光PCR定量结果和扩增效率的影响.选择酚一氯仿提纯法作为核酸提取对照方法.结果 黄疸、溶血和脂血标本,对3种不同核酸提取方法的荧光PCR定量结果和扩增效率都产生不同程度的影响,其中完全溶血的标本对PCR扩增效率的影响最大,如定量值为4×103拷贝/ml的低拷贝完全溶血标本,MNR法测定结果为2.21×103拷贝/ml,PEG法为1.02×103拷贝/ml,碱性直接裂解法的定量值为阴性,临床自然溶血较重的标本对荧光定量检测影响较小,脂血和黄疸标本对荧光定量PCR扩增效率有明显抑制作用,但对实际定最值无明显影响;其中,MNR法在不同标本的定量重复性和荧光PCR扩增效率最好,碱液直接裂解法较差.酚.氯仿提纯法虽然获得较高的扩增效率,但存在大约有1个数量级的核酸丢失.结论 基于MNR核酸提取方法的荧光定量PCR检测,对不同的临床标本均可获得较好的扩增效率、敏感性和重复性,操作简便、快速且无核酸丢失和污染,适合临床检验应用.     

乙型肝炎病毒全长基因组的扩增

目的:探讨扩增乙肝病毒全长基因组合适的PCR反应条件。方法:设计针对负链5′末端引物,PCR一步法扩增乙肝病毒全长基因。改变PCR反应条件,决定最佳退火温度和最佳引物浓度,并观察不同乙肝病毒DNA模板量对PCR扩增效率的影响。结果:最佳退火温度为68℃,最佳引物浓度为0.5μmol/L,模板量在150拷贝以上能扩增出乙肝病毒全长基因,但模板量达到105拷贝抑制扩增效率。结论:退火温度为68℃、引物浓度为0.5μmol/L、乙肝病毒DNA模板量在150～105拷贝为乙肝病毒全长基因扩增的合适PCR反应条件。     

不同类型乙型肝炎患者HBV基因型的分布

目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）各种基因型在不同类型乙型肝炎患者中的分布.方法 用PCR结合限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法检测56例HBV感染的肝癌、58例肝硬化、60例慢性乙型肝炎患者以及60例HBV无症状携带者血清HBV基因型.结果 无症状携带者中B基因型为46.7%（28/60）,C基因型为33.3%（20/60）,D基因型为20.0%（12/60）;慢性乙型肝炎组B基因型为41.7%（25/60）,C基因型为36.7%（22/60）,D基因型为21.7%（13/60）;肝癌患者中B基因型为33.9%（19/56）、C基因型为60.7%（34/56）、D基因型为5.4%（3/56）;肝硬化患者中B基因型为31.0%（18/58）、C基因型为63.8%（37/58）,D基因型为3.5%（2/58）.结论 在慢性乙型肝炎和无症状携带者中以B基因型为优势感染毒株,而肝硬化和肝癌患者则以C基因型为优势感染毒株.     

聚合酶链反应-反向斑点杂交鉴定分枝杆菌菌种

目的 建立一种简便、快速、敏感和特异的分枝杆菌菌种鉴定方法。方法以１６ＳｒＤＮＡ为靶序列,采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）－反向斑点杂交检测２５种分枝杆菌１１种分枝杆菌标准株、１２０株分枝杆菌临床分离株和２６份痰标本。结果 分枝杆菌、非分枝杆菌标准株经ＤＮＡ扩增,分枝杆菌均出现５７８ｂｐＤＮＡ片段,非分枝杆菌除假白喉棒状杆菌可见同样片段外,其余菌种均未见扩增。敏感性试验可检测出１００ｆｇ结核分枝杆菌ＤＮ     

人乳头瘤病毒PCR产物酶标-微孔板杂交分型

目的建立聚合酶链反应（ＰＣＲ）产物直接酶标记微孔板反向分子杂交法用于人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）型别鉴定。方法利用ＨＰＶ通用引物介导ＰＣＲ（ＧＰＰＣＲ）扩增靶ＤＮＡ，然后对产物直接标记辣根过氧化物酶复合物（ＨＲＰＰＥＩＱＩ），与预先包被在微孔板上的ＨＰＶ寡核苷酸探针杂交后酶显色法检测。结果ＨＰＶ各型之间无交叉杂交；杂交灵敏度可达１３～７６个病毒ＤＮＡ拷贝，比ＰＣＲ琼脂糖凝胶电泳检测高１０倍；该法重复性好，阳性孔批内ＣＶ为６．３４％，批间ＣＶ为１０．５３％，阴性孔批内ＣＶ为１％，批间ＣＶ为５．７９％；而且杂交影响因素较少。结论该法特异性强、灵敏度高、操作简便，无放射性和ＥＢ染料污染，杂交时间短、仪器读取结果，便于大量常规临床样本定性或定量检测。     

乙型肝炎病毒表面大蛋白与HBV DNA检测的对比研究

目的 探讨检测乙型肝炎病毒表面大蛋白（LHBs）用于临床乙型肝炎诊断的实验价值及与乙肝病毒DNA定量的相关性。方法 采用酶联免疫吸附实验（ELISA）和荧光定量PCR法对600例HBeAg阳性血清标本进行LHBs及HBV DNA平行检测。结果 ①在600例HBsAg阳性血清中HBV DNA阳性率为76．17％（457／600），LHBs的阳性率为77．33％（464／600），二者无显著差异（Х^2=0．696，P〉0．05）；②300份HBeAg阳性血清中，HBV DNA、LHBs阳性率分别为95．0％（285／300）、96．0％（288／300）；300份HBeAg阴性血清中，HBV DNA、IMBs阳性率分别为57．33％（172／300）、58．67％（176／300），二者差异均无统计学意义（Х^2=0．725，P〉0．05；Х^2=0．253，P〉0．05）。③LHBs含量与HBV DNA拷贝数呈正相关性，相关系数r=0．948。结论 定量检测LHBs有助于了解乙型肝炎病毒复制情况。     

荧光定量PCR测定HBV DNA测量不确定度评定的探讨

目的探讨利用质控数据评定荧光定量聚合酶链反应(PCR)测定HBV DNA测量不确定度的可行性。方法用批内不精密度和批间不精密度数据评定A类不确定度;分别用参加卫生部临床检验中心和美国病理学家协会(CAP)的室间质评数据评定B类不确定度;最后评定合成不确定度和扩展不确定度。结果利用卫生部临床检验中心室间质评反馈结果评定的扩展不确定度(k=1.96,n=1)在检测值为104~105和106~107IU/mL时分别为0.521 6和0.529 8;利用CAP能力比对反馈结果评定的扩展不确定度(k=1.96,n=1)在检测值为104~105和106~107IU/mL时分别为0.973 1和0.977 5。结论目前用室间质评数据评定PCR测定HBV DNA的不确定度不能真实反映实验室的不确定度,使用国家标准物质评定不确定度更合适。     

上海地区部分乙型肝炎患者乙型肝炎病毒基因型分析

目的研究上海地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型分布情况。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)检测136例HBV DNA阳性的上海籍HBV感染者的基因型。结果136例HBV DNA阳性的HBV感染者中基因型B 43例,占31.6%,基因型C 92例,占67.6%,基因型D仅有1例,未发现基因型A、E、F。结论上海地区存在HBV基因B、C、D型,基因型A、E、F是否存在仍需扩大样本作进一步深入研究。     

微孔板杂交法检测结核分枝杆菌的初步临床应用

目的：对ＰＣＲ－微孔板杂交法的临床应用进行评价。方法：取临床标本２６８例分别进行抗酸染色、培养、ＰＣＲ扩增产物电泳、ＰＣＲ微孔板杂交四种方法的比较。结果：在２１６份临床高度怀疑有结核分枝杆菌感染的患者标本中,ＰＣＲ－微孔板杂交法检测阳阳性为９８例,其检出率高于ＰＣＲ－电泳法（９１／２１８）、培养法（８１／２１８）和抗酸染色法（５６／２１８）,５０份临床证实无结核分枝杆菌感染的病人标本,四种方法均未     

运用FQ-PCR技术监测亚甲蓝光化学法对血浆乙型肝炎病毒的灭活效果

目的通过荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)技术对血浆病毒灭活前后乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)浓度进行测定,判断亚甲蓝(MB)光化学法灭活乙型肝炎病毒的效果,为临床判断病毒灭活效果提供直接和客观依据。方法用4份已证实为HBV-DNA阳性的血浆,经可见光(>3000LUX)照射不同时间(0、5、10、15、30min)后,用FQ-PCR分别测定这些血浆的HBV-DNA浓度,并与未用MB处理的血浆作比较,判断随照射时间不同,HBV被灭活的效果。结果4份HBV-DNA阳性患者的血浆未经处理时,其病毒核酸浓度分别为5.6×107、3.2×106、1.8×106和3.5×105拷贝/ml,加入MB未经照射时HBV-DNA浓度即明显下降(P<0.05),可见光照射5min后HBV-DNA浓度分别下降为未经任何处理时的浓度的15.89%、11.56%、4.39%和1.23%。随照射时间的延长,病毒核酸浓度逐渐下降,照射30min后,HBV-DNA浓度均下降为零。结论用MB加光照30min处理,可达到将血浆乙肝病毒灭活的效果。