树突状细胞疫苗治疗G422胶质母细胞瘤的实验研究

目的研究G422肿瘤细胞RNA体外冲击致敏的树突状细胞(DC)回输诱导体内产生保护性免疫反应及对颅内荷瘤小鼠的免疫治疗效应,探讨以树突状细胞为基础的疫苗对脑胶质瘤治疗的可行性.方法提取G422胶质母细胞瘤RNA或肿瘤提取物冲击致敏DC制成疫苗,分别进行免疫保护和免疫治疗的体内实验,以及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)体外诱导及活性检测,并与PBS、未经致敏的DC、G422肿瘤细胞RNA组进行对照.疫苗能诱导产生针对G422肿瘤抗原特异性CTL,差异具有非常显著性(P＜0.01),接种疫苗后的小鼠能抵抗G422的再次攻击(P＜0.01),荷瘤小鼠接种疫苗后生存期较对照组延长(P＜0.05).结果疫苗能诱导产生针对G422肿瘤抗原特异性CTL,差异具有非常显著性(P＜0.01),接种疫苗后的小鼠能抵抗G422的再次攻击(P＜0.01),荷瘤小鼠接种疫苗后生存期较对照组延长(P＜0.05).结论肿瘤RNA或肿瘤提取物冲击致敏DC能诱导小鼠产生抗原特异性CTL,激活抗肿瘤T细胞,具有免疫保护和免疫治疗作用.该实验为DC疫苗免疫治疗胶质瘤提供了实验基础.     

三尖杉酯碱对小鼠G422胶质母细胞瘤的实验治疗

三尖杉酯碱对小鼠Ｇ４２２胶质母细胞瘤的实验治疗陈东玲，朱金娜三尖杉酯碱系从三尖杉属植物中提取的作用较强的抗肿瘤生物碱。我国学者对三尖杉酯碱的基础与临床研究比较全面，并已确立其在临床白血病治疗中的效用［１］。三尖杉酯碱对多种动物实体瘤有抑制效果，但临床...     

树突状细胞治疗脑胶质细胞瘤实验研究

目的研究树突状细胞疫苗瘤内注射对胶质瘤的治疗作用.方法建立大鼠C6脑胶质瘤皮下和颅内肿瘤模型,通过第一组为瘤内注射树突状细胞(DC)、第二组为腹部皮下注射DC、第三组为对照组,观察肿瘤生长情况和大鼠生存时间,比较细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活性,并进行病理学检查.结果治疗组大鼠表现为肿瘤生长部分抑制,生存时间明显延长,与对照组比较,有极显著差异(P<0.01),瘤内注射DC和腹部皮下注射C6冻融抗原致敏DC,两治疗组间无显著性差异(P＝0.60);CTL杀伤活性增强,和对照组比较有显著性差异(P<0.05).双侧皮下种植的肿瘤治疗一侧后,生长均受到抑制,并逐渐缩小.结论瘤内注射DC治疗脑胶质瘤是一种新的、有效的免疫治疗策略.     

凋亡肿瘤细胞抗原致敏的树突状细胞瘤苗治疗大鼠颅内胶质瘤的实验研究

目的观察凋亡肿瘤细胞抗原致敏的树突状细胞(dendriticcell,DC)瘤苗对颅内胶质瘤免疫治疗的效果。方法通过立体定向接种建立Wistar大鼠C6胶质瘤动物模型;从大鼠骨髓分离DC前体细胞,经重组大鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rrGM-CSF) 白细胞介素4(rrIL-4)诱导培养、扩增获得功能性DCs;DCs经采用热诱导凋亡的C6胶质瘤细胞体外致敏后皮下回输荷瘤大鼠体内,1次/周,共5次。观察荷瘤大鼠的存活期,MRI观察颅内肿瘤生长情况,循环血中CD8 T淋巴细胞水平及体外细胞毒反应、增殖反应均以流式细胞仪检测。结果经过治疗的荷瘤大鼠生存期明显延长,MRI显示实验组大鼠肿瘤被明显抑制,外周血中CD8 T淋巴细胞比例增加,体外细胞毒试验提示经凋亡肿瘤细胞抗原致敏的DC瘤苗可以诱导针对C6胶质瘤的特异性细胞毒性T淋巴细胞,并且未观察到自身免疫反应的发生。结论经凋亡肿瘤细胞抗原致敏的DC瘤苗对于颅内胶质瘤是一种安全有效的治疗方法。     

肿瘤干细胞致敏的树突状细胞对脑胶质瘤细胞免疫的影响

目的 研究肿瘤干细胞(BTSCs)致敏的树突状细胞(DCs)疫苗对颅内荷瘤小鼠的治疗作用.方法 无血清培养基中加入表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子,将C6胶质瘤细胞诱导成胶质瘤干细胞,以此致敏大鼠骨髓来源的树突状细胞制备疫苗;立体定向建立大鼠颅内C6胶质瘤模型,分为A、B、C、D四组.每组分别经尾静脉注射1×107BTSCs致敏的DCs(DCs-BTSCs)、1×107 C6胶质瘤细胞致敏的DCs(DCs-C6)、1×107DCs及PBS,Kaplan-Meier法对大鼠生存情况进行分析,大鼠脑组织标本行HE染色及免疫组化分析.结果 胶质瘤干细胞CD133+及nestin染色阳性;DCs具有典型的树突状结构,特异性标志OX62+表达阳性;生存时间A组较其他组明显延长,Log-rank检验差异有统计学意义(P＜0.05);A组HE染色炎性细胞浸润最多,免疫组化可见较多的CD8+T淋巴细胞.结论 肿瘤干细胞致敏的树突状细胞疫苗能明显提高机体对胶质瘤的免疫力,其作用优于胶质瘤细胞致敏的树突状细胞疫苗,为树突状细胞疫苗的临床应用提供了新的依据.

Abstract：

Objective To investigate the effect of dendritic cells pulsed with brain tumor stem cells which are used to treat on intracranial glioma.MethodWe obtained murine brain tumor stem cells by growing C6 cells in epidermal growth factor/basic fibroblast growth factor without serum.Dendritic cells isolated from rat bone marrow were pulsed with BTSCs.Rat brain glioma models were established by stereotactic technique.107 DCs pulsed with BTSCs and C6 were injected through tail vein in group A and group B respectively.The same number of DCs and the same volume PBS were applied to group C and group D.The survival time of rats was analyzed by Log- rank survival analysis.Tumor samples were examinedwithHE staining and immunohistochemistry.Methods BTSCs expressedCD133 + and nestin.DCs appeared typical long dentrite in morphology and expressed OX62+ markers.The survival analysis showed group A was statistically significant in constrast to the other goups (P<0.05).The tumors in group A have the most inflammation and CD8 + T lymphocytes.Concluion DCs loading with BTSCs lysates can provide a higher level of immunity protect against gliomas than those loading with C6 cells,which provide a new method in the immuntherapy of brain glioma.     

大鼠树突状细胞疫苗治疗脑胶质瘤的实验研究

目的研究树突状细胞疫苗对C6荷瘤大鼠的免疫治疗效应,并比较免疫治疗策略的异同。方法将成年健康SD大鼠40只平均分为4组,分别经RN A致敏和C6冻融抗原致敏的DC免疫以及对照组经未致敏D C和R PM I1640免疫,采用LD H试剂盒检测CTL的体外杀伤活性。建立大鼠C6脑胶质瘤颅内肿瘤模型,观察其生存期,并进行病理学检查。结果肿瘤RN A致敏的D C疫苗活性最强,与C6冻融抗原致敏的DC疫苗相比,CTL杀伤活性差异不显著(P>0.05),但与对照组相比,差异非常显著(P<0.01)。治疗组荷瘤大鼠生存时间与对照组相比,差异非常显著(P<0.01);两治疗组之间差异不显著(P>0.05)。治疗组肿瘤生长明显抑制。结论C6冻融抗原和肿瘤细胞R NA致敏的树突状细胞疫苗均是有效的免疫治疗方法。     

嵌合抗原受体T细胞治疗胶质母细胞瘤的研究进展

正胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)是成人最常见的颅内原发性恶性肿瘤,中位生存期约15个月~([1])。目前,新诊断的GBM标准治疗包括最大化安全切除、替莫唑胺化疗联合同步放疗等~([2])。即使采用综合治疗,很短时间内仍不可避免地出现复发,预后不良。由于肿瘤的异质性、化疗耐药性、血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)等因素,使得GBM的传统治疗面临巨大的挑战。     

树突状细胞瘤苗抗脑胶质细胞瘤作用体外实验研究

目的通过体外实验探讨应用树突状细胞制备的肿瘤疫苗抗脑胶质瘤的作用机制.方法培养大鼠树突状细胞,冻融法制备胶质瘤抗原,以肿瘤抗原致敏树突状细胞而制备胶质瘤疫苗.将实验动物分为4组,分别将胶质瘤疫苗、树突状细胞、生理盐水注入正常大鼠体内,到达预定时间取出大鼠脾脏,四噻唑蓝(MTT)法检测大鼠淋巴细胞活性.结果一次输入胶质瘤疫苗的正常大鼠的淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性明显低于3次输入胶质瘤疫苗的正常大鼠;比较输入培养8 d的树突状细胞和输入生理盐水的大鼠,其淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性无统计学差异.结论应用树突状细胞制备胶质瘤疫苗可明显激活体内抗肿瘤免疫反应.     

G422胶质瘤冷冻后细胞凋亡及相关基因表达的研究

目的：探讨冷冻杀伤肿瘤细胞的分子机制。方法；建立小鼠脑胶质瘤动物模型；用末端标记法（TUNEL）原位检测细胞凋亡，DNA琼脂糖电泳观察DNA梯形条带；用免疫组织化学ABC法检查bcl-2和bax表达。结果：不同冻融周期作用于G422胶质瘤后，在不同时间点、冷冻灶周边区的肿瘤细胞出现了形态学和DNA水平上的细胞凋亡变化，其峰值出现在冷冻后24-48h。重复冻融出现更多的凋亡细胞。不同冻融周期均引起冷冻灶周边区细胞bax上调，但对抑凋亡基因bcl-2表达无明显影响。结论：冷冻治疗可以诱导G422胶质瘤细胞凋亡，冷冻诱导的细胞凋亡由bax基因参与介导，而与bcl-2表达无关。诱导细胞凋亡可能 是冷冻杀伤肿瘤细胞的重要机制。     

肿瘤抗原致敏树突状细胞瘤苗治疗颅内胶质瘤的实验研究

目的　研究肿瘤抗原致敏树突状细胞瘤苗治疗胶质瘤的疗效。方法　从大鼠的骨髓中加入GM CSF和IL 4培养树突状细胞 ,采用相差显微镜、扫描电镜观察了树突状细胞的形态学特点 ;免疫组织化学双标技术、流式细胞免疫学技术观察了其特异性抗体OX6和OX62 的表达 ;微酸洗脱方法抽提C6肿瘤抗原体外致敏树突状细胞 ,建立C6胶质瘤脑内动物模型 ,体内应用抗原致敏的树突状细胞 ,观察脑内肿瘤的疗效 ,并取致敏的动物的脾脏T细胞体外加入C6肿瘤抗原 ,加入IL 2培养进行CTL活性检测。结果　培养第 8天可见有典型的树突状细胞 ;免疫组织化学双标可见有OX6和OX62 阳性细胞 ,流式细胞免疫学分析发现OX62 阳性率为 93 0 3% ,OX6的阳性率为 92 0 1% ;体外细胞毒试验发现对相应的C6肿瘤细胞有明显的杀伤作用 ;动物实验发现实验组可见肿瘤组织内有大量的坏死 ,而对照组仅有少量的坏死 ,两者相比P <0 0 1。结论　体内注射采用微酸洗脱的抗原肽致敏树突状细胞瘤苗能够引起荷瘤动物脑肿瘤大面积的坏死 ,该方法为将来临床免疫治疗胶质瘤充分调动机体的免疫系统奠定基础。     

胶质瘤氩氦冻融产物负载树突状细胞对颅内胶质瘤大鼠的免疫治疗研究

目的 观察C6胶质瘤细胞经氩氦冷冻后,冻融产物对Wistar大鼠骨髓源性树突状细胞(BM-DCs)成熟的影响,以及致敏的树突状细胞(DCs)对胶质瘤模型大鼠的抗肿瘤作用. 方法 体外常规培养C6胶质瘤细胞,双循环氩氦冷冻法冻融C6细胞悬液为实验组,只插入探针不作冷冻为阴性对照组,双循环氩氦冷冻法冻融等量PBS为空白对照组;应用重组大鼠白细胞介素-4(rmIL-4)、重组大鼠粒一巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导Wistar大鼠骨髓DCs成熟,培养第7天分别加入各组冷冻产物,48 h后光镜下观察DCs细胞形态,流式细胞仪检测各组DCs细胞表面共刺激分子CD80和CD86的表达,ELISA法检测各组上清液中IL-12含量;将C6细胞接种于Wistar大鼠建立荷脑胶质瘤模型,第3、10天分别皮下注射空白对照组、阴性对照组、实验组DCs疫苗,比较各组大鼠的中位生存期. 结果 培养第7天未成熟DCs加入冷冻产物48 h后实验组具有成熟DCs形态学特征,表面分子CD80、CD86阳性表达率、上清中[L-12的分泌量高于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组DCs疫苗治疗后荷脑胶质瘤大鼠中位生存期高于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 胶质瘤氩氦冻融产物可以诱导DCs成熟,介导大鼠脑胶质瘤的免疫治疗,为冷冻免疫机制提供一定理论基础,同时该DCs疫苗为胶质瘤个体化治疗的研究提供一种新的方法.     

树突状细胞融合瘤苗抗胶质瘤的实验研究

目的观察树突状细胞（dendritic cells，DC）融合瘤苗防治C6胶质瘤的疗效，对其抗肿瘤作用机制进行初步探讨。方法采用PEG化学融合方法制备融合瘤苗，流式细胞技术分选瘤苗，对融合瘤苗进行免疫组化和功能学鉴定；立体定向制备大鼠颅内C6肿瘤模型，荷瘤后5d经尾静脉注射10^7融合瘤苗、10^7DC以及100μl PBS，分别设为A、B、C三组，采用Log—rank对数秩检验进行生存分析，对肿瘤标本进行病理学检查。结果实验中DC具有典型的树突状结构，OX62特异性标志物阳性表达；融合瘤苗GFAP—FITC免疫荧光检查阳性；Log—rank生存分析数据对数秩检验表明A组与B、C组比较均有统计学意义（P〈0．01）；A组晚期死亡大鼠（〉31d）HE染色见较多的炎性细胞浸润，CD8^＋Mcab免疫组化染色阳性。结论PEG法可有效制备DC／C6融合瘤苗，融合瘤苗能够有效的发挥抗肿瘤效果，CD8^＋T细胞参与颅内抗胶质瘤免疫反应。     

自体肿瘤树突状融合细胞体外诱导抗人脑胶质瘤活性的研究

目的本实验使用人脑胶质瘤细胞和同一患者的外周血单个核细胞(PBMC)诱导的树突状细胞(DC)融合来制备DC-肿瘤融合细胞(FC),并研究其体外诱导抗胶质瘤的活性。方法采用PEG法将来自胶质瘤患者的肿瘤细胞和其自体DC进行融合,采用混合淋巴细胞反应和乳酸脱氢酶法(LDH)释放法来分别评价FC刺激T淋巴细胞增殖能力和FC致敏的T淋巴细胞对相同患者胶质瘤细胞的杀伤能力。结果建立了DC-人脑胶质瘤融合细胞(FC)的制备方法,通过荧光双染色证明FC具有胶质瘤细胞和DC细胞的双重标记,经过1.5Gy照射的FC致敏患者外周血T细胞,对自体胶质瘤细胞的杀伤明显高于仅用单纯DC或自体胶质瘤细胞致敏的T细胞(P<0.01),而且杀伤能力随E/T率的增加而由28%上升到90%,但对乳腺癌细胞MCF7的杀伤仅在10%左右,显著低于对自体胶质瘤细胞的杀伤(P<0.01);同时致敏的T细胞在负载患者胶质瘤细胞裂解物(lysate)的自体DC的刺激下引起的增殖高于仅用单纯DC或自体胶质瘤细胞致敏的T细胞,并具有统计学意义(P<0.05);对于已经致敏的T淋巴细胞,负载lysate的自体DC所引起的T细胞增殖明显高于自体DC或lysate的作用(P<0.01)。结论本实验所制备的FC经过1.5Gy照射后,可以有效致敏患者外周血T细胞,并在负载抗原的DC的刺激下可以在体外扩增,致敏的患者外周血T淋巴细胞是可以进行特异性杀伤的CTL,杀伤能力随效靶比增高而上升。     

靶向脑胶质瘤干细胞的树突状细胞疫苗治疗恶性脑胶质瘤的体外实验研究

目的 研究应用脑胶质瘤干细胞抗原制备的树突状细胞(DC)疫苗对胶质瘤细胞的杀伤作用.方法 反复冻融法获得源于胶质瘤细胞系U251中的肿瘤干细胞的胞溶物,和源于小鼠间充质干细胞的DC共培养,获得胶质瘤干细胞疫苗.流式细胞仪检测疫苗表面标志变化;CCK-8法检测其促T细胞增殖能力以及对胶质瘤细胞的靶向杀伤作用;ELISA法检测培养基中干扰素-γ的含量.用热处理U251细胞制备的DC疫苗作为对照组.结果 与对照组相比,脑胶质瘤干细胞疫苗的CD80、CD86、CD11c和MHC Ⅱ等表面标志表达显著提高,具有更强的促T细胞增殖能力(P＜0.01),对U251细胞特异性靶向杀伤率随效靶比的提高而增加,最高为(78.508±4.156)％,相应的干扰素-γ分泌水平也达到最高.结论 胶质瘤干细胞疫苗能更有效地诱导特异性细胞毒性T细胞,表现出更强的抗肿瘤特性.     

树突状细胞的培养及其诱导的神经胶质瘤体外杀伤作用研究

目的　研究负载肿瘤抗原的树突状细胞 (DCs)活化的特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTLs)对神经胶质瘤细胞的体外杀伤效应 ,探讨其用于临床治疗的可行性。方法　体外原代培养 12例胶质瘤细胞 ,冻融法获取胶质瘤细胞抗原 ,联合应用粒细胞 /巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素 4和肿瘤坏死因子 α等 ,对人外周血单核细胞进行体外诱导来获取DCs并负载肿瘤抗原 ,激活自体T淋巴细胞 ,制备特异性CTLs,MTT法检测对胶质瘤细胞的体外杀伤效应。结果　负载胶质瘤抗原的DCs激活的CTLs对胶质瘤细胞有明显的杀伤作用 ,显著高于K5 6 2细胞对照组 ,并且杀伤率随着效靶比的增加而增加。结论　从人外周血中诱导的DCs负载胶质瘤抗原后 ,激活的CTLs在体外对胶质瘤能产生高效的杀伤作用 ,为临床应用DCs瘤苗奠定基础     

小鼠骨髓源性树突状细胞培养与冻存

树突状细胞因其良好的抗原提呈功能及促T细胞增殖功能,成为肿瘤抗原的良好载体。获得大量的树突状细胞,对于肿瘤疫苗的研制具有重要作用。 目的：对小鼠骨髓树突状细胞进行诱导、培养、扩增及冻存,并对比冻存后复苏细胞与未冻存细胞的细胞特性,寻找一种能够大量获得树突状细胞及有效储存的方法。 方法：取小鼠骨髓细胞,在含重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(10 μg/L)和重组小鼠白细胞介素4(5 μg/L)的完全培养基中对其进行诱导、培养及扩增。培养第6天,对培养获得的树突状细胞在加有冷冻保护剂DMSO的完全培养液中冻存。复苏后,在培养基中加入脂多糖、对细胞诱导,获得大量的成熟树突状细胞,最终获得的树突状细胞与未进行冻存的细胞在细胞活力、形态学、细胞表型、混合淋巴细胞反应等方面对比。 结果与结论：复苏后,(82.2±4.73)%细胞存活,存活的细胞经脂多糖诱导后发育为成熟树突状细胞,在形态学、细胞表型及混合淋巴细胞反应等方面与未经冻存的树突状细胞差异无显著性意义。提示小鼠骨髓源性树突状细胞冻存复苏后,细胞生物学特性与未冻存的细胞无明显差别,用冻存的方法储存树突状细胞,能够避免在不同时期应用细胞时反复进行培养,可以获得大量的同质细胞。