八肽胆囊收缩素对肿瘤坏死因子α诱导的大鼠滑膜细胞株RSC-364核因子κB活性变化的影响及其受体机制

目的:观察硫酸化八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide,CCK-8)对肿瘤坏死因子α诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364核因子κB的影响,以及CCK-A/B受体是否参与这一过程。方法:实验于2003-02/2004-02在河北医科大学法医学教研室分子生物学实验室完成。取大鼠滑膜细胞株RSC-364经肿瘤坏死因子α(10 μg/L)、sCCK-8(10-8,10-7,10-6 mol/L)、CCK受体拮抗剂丙谷胺及溶剂单独或联合应用孵育:①孵育3h,用反转录-聚合酶链反应技术检测细胞CCK-A受体及CCK-B受体mRNA的表达。②孵育1h,用电泳迁移率检测核因子κB相对活性。③孵育30 min,用Western blot检测胞浆IκB蛋白表达的相对水平。结果:①细胞CCK-A受体及CCK-B受体mRNA的表达:RSC-364细胞固有表达CCK-A/B受体,肿瘤坏死因子α(10 μg/L)可使CCK-A受体和CCK-B受体mRNA的表达分别上调148%和173%(P<0.01)。肿瘤坏死因子α和CCK-8(10-8～10-6 mol/L)联合孵育细胞,CCK-A受体和CCK-B受体mRNA表达与肿瘤坏死因子α组相比分别增高47%,56%,30%和57%,13%,24%(P<0.05,0.01)。②核因子κB相对活性:肿瘤坏死因子α组明显高于对照组(294.45±36.48,0,P<0.01);肿瘤坏死因子α CCK-810-8,10-7,10-6 mol/L组高于肿瘤坏死因子α组(470.69±56.76,489.37±64.95,558.90±74.15,P<0.05,0.01);CCK-8的作用可被丙谷胺减弱(400.79±39.06)。③IκB蛋白表达的相对水平:肿瘤坏死因子α组明显低于对照组(139.43±30.76,220.79±34.58,P<0.01),肿瘤坏死因子α CCK-810-8,10-7,10-6 mol/L组低于肿瘤坏死因子α组(95.26±8.54,84.15±8.77,63.28±16.13,P<0.05),并可被丙谷胺所抑制(137.22±20.33,P<0.01)。结论:CCK-8对肿瘤坏死因子α诱导的RSC-364核因子κB活性具有正向调节作用,并能降低IκBα蛋白水平,提示CCK-8在类风湿性关节炎发病过程中可能具有调控作用,此作用可能通过滑膜细胞上的CCK受体实现。     

八肽胆囊收缩素对肿瘤坏死因子α诱导的大鼠滑膜细胞株RSC-364核因子κΒ活性变化的影响及其受体机制

目的观察硫酸化八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide,CCK-8)对肿瘤坏死因子α诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364核因子κB的影响,以及CCK-A/B受体是否参与这一过程.方法实验于2003-02/2004-02在河北医科大学法医学教研室分子生物学实验室完成.取大鼠滑膜细胞株RSC-364经肿瘤坏死因子α(10μg/L)、sCCK-8(10-8,10-7,10-6mol/L)、CCK受体拮抗剂丙谷胺及溶剂单独或联合应用孵育①孵育3 h,用反转录-聚合酶链反应技术检测细胞CCK-A受体及CCK-B受体mRNA的表达.②孵育1 h,用电泳迁移率检测核因子κB相对活性.③孵育30 min,用Western blot检测胞浆IκB蛋白表达的相对水平.结果①细胞CCK-A受体及CCK-B受体mRNA的表达RSC-364细胞固有表达CCK-A/B受体,肿瘤坏死因子α(10 μg/L)可使CCK-A受体和CCK-B受体mRNA的表达分别上调148%和173%(P＜0.01).肿瘤坏死因子α和CCK-8(10-810-6 mol/L)联合孵育细胞,CCK-A受体和CCK-B受体mRNA表达与肿瘤坏死因子α组相比分别增高47%,56%,30%和57%,13%,24%(P＜0.05,0.01).②核因子κB相对活性肿瘤坏死因子α组明显高于对照组(294.45±36.48,0,P＜0.01);肿瘤坏死因子α+CCK-8 10-8,10-7,10-6 mol/L组高于肿瘤坏死因子α组(470.69±56.76,489.37±64.95,558.90±74.15,P＜0.05,0.01);CCK-8的作用可被丙谷胺减弱(400.79±39.06).③IκB蛋白表达的相对水平肿瘤坏死因子α组明显低于对照组(139.43±30.76,220.79±34.58,P＜0.01),肿瘤坏死因子α+CCK-8 10-8,10-7,10-6 mol/L组低于肿瘤坏死因子α组(95.26±8.54,84.15±8.77,63.28±16 13,P＜0.05),并可被丙谷胺所抑制(137.22±20.33,P＜0.01).结论CCK-8对肿瘤坏死因子α诱导的RSC-364核因子κB活性具有正向调节作用,并能降低IκBα蛋白水平,提示CCK-8在类风湿性关节炎发病过程中可能具有调控作用,此作用可能通过滑膜细胞上的CCK受体实现.     

NR2B反义寡核苷酸对大鼠脊髓星形胶质细胞体外分泌TNF-α及释放谷氨酸的影响

目的:观察N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(NR2B)反义寡核苷酸对体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞(AST)分泌肿瘤坏死因子(TNF)-α及释放谷氨酸(Glu)的影响。方法:取新生2～3d新生的SD大鼠L4～6脊髓背角AST细胞原代纯化培养,C组:正常对照,除加入与干预组等量的培养液外不加任何药物;脂多糖(LPS)组:在培养液中加入LPS,终浓度为1mg/L,孵育24h;SNR2B组:在培养液中加入经lipofectamine2000处理的NR2B反义寡核苷酸,终浓度为2μmol/L,孵育48h后再加入LPS,终浓度1mg/L,再孵育24h;ANR2B组:在培养液中加入经lipofectamine2000处理的NR2B正义寡核苷酸,终浓度为2μmol/L,孵育72h后再加入LPS,终浓度1mg/L,孵育24h;5000r/min离心15min后取上清液和细胞,分别用于TNF-α、Glu和NR2B mRNA检测。应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清液中TNF-α的浓度;用高效液相色谱仪测定Glu含量,RT-PCR检测NR2B mRNA的表达。结果:与C组比较,LPS组和ANR2B组释放的TNF-α和Glu显著增加(P<0.01),而SNR2B组无显著变化;与LPS组和ANR2B组相比,SNR2B组释放的TNF-α和Glu减少(P<0.01)。与C组比较,LPS组和ANR2B组AST细胞的NR2B mRNA的表达显著升高(P<0.01),而SNR2B组差异无显著性。结论:NR2B反义寡核苷酸下调脊髓AST细胞NR2B mRNA表达,减少TNF-α和Glu的释放。     

人脐静脉内皮细胞损伤过程中核转录因子κB及单核细胞趋化蛋白1mRNA的变化

背景:既往实验表明,炎性因子与内皮细胞的功能有密切的关系,观察保护和损伤因素对体外培养人血管内皮细胞炎性因子作用的报道较少.目的:实验拟观察姜黄素和肿瘤坏死因子α对人脐静脉内皮细胞分泌核因子κB以及单核细胞趋化蛋白1mRNA的影响.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2006-12/2007-08在解放军第四军医大学组织工程实验室完成.材料:健康人脐带由解放车第四军医大学唐都医院提供.内皮细胞培养采用M199完全培养基.方法:实验分为3组,正常对照组为无血清M199培养基;肿瘤坏死因子α组:在正常细胞培养液中加入浓度为10μg/L的肿瘤坏死因子α诱导损伤1.5h;姜黄素组:先在培养液中加入10μg/L的肿瘤坏死因子α30min诱导损伤,再分别加入终浓度为6.25,12.5,25,50,100mg/L的姜黄素孵育1h.主要观察指标:①四甲基偶氮唑盐法检测不同浓度姜黄素对人脐静脉内皮细胞增殖的影响.②免疫细胞化学染色法观察胞核内核转录因子κB的表达.③反转录-聚合酶链反应检测单核细胞趋化蛋白1mRNA的表达.结果:姜黄素可以提高肿瘤坏死因子α诱导损伤的人脐静脉内皮细胞活性(P＜0.01),并呈一定剂量依赖性.肿瘤坏死因子α可刺激核因子κBp65表达的强度,姜黄素可以减少核因子κBp65的表达.与正常对照组相比,肿瘤坏死因子α作用30min后,单核细胞趋化蛋白1mRNA相对表达量明显增高(p＜0.01);加入不同浓度的姜黄素作用1h后,单核细胞化蛋白1mRNA相对表达量明显减低(P＜0.05, P＜0.01).结论:姜黄素对损伤的内皮细胞具有保护作用,其作用途径可能通过抑制核转录因子κB活性,并下调单核细胞趋化蛋白1mRNA的表达,从而阻滞了单核细胞的聚集.     

瘦素对RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α表达的影响

背景:瘦素是脂肪组织分泌的一种多肽激素,研究显示瘦素在动脉粥样硬化形成中发挥了一定重要的作用。目的:观察瘦素对鼠源性巨噬细胞系RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α表达的影响,并从核转录因子κB活性变化角度探讨其可能机制。设计:对照观察实验。单位:华中科技大学同济医学院生物化学及分子生物学系。材料:实验于2005-04/2006-02在华中科技大学同济医学院生物化学及分子生物学系及附属协和医院普外科实验室完成。将培养的RAW264.7细胞分为不同浓度瘦素处理组(12.5,25,50,100μg/L)、IkappaB激酶抑制剂组及空白对照组。每组3瓶,重复实验3次。方法:将鼠源性巨噬细胞株RAW264.7细胞以1×109L-1密度接种于6孔板中,用含体积分数为0.1的小牛血清的RPMI-1640培养基培养。待RAW264.7细胞生长至80%时,换用无血清培养基Opti-MEM继续培养24h后,将细胞分为不同浓度瘦素处理组(12.5,25,50,100μg/L)及空白对照组,瘦素孵育4h后采用反转录-聚合酶链反应检测肿瘤坏死因子α在mRNA水平的表达。上述分组细胞经瘦素分别孵育1,3,6和9h后采用双抗夹心酶联免疫吸附实验检测肿瘤坏死因子α在蛋白水平的表达。上述分组细胞经瘦素孵育不同时间后采用凝胶迁移率实验检测细胞核内核转录因子κB活性。将RAW264.7细胞分为以下4组:空白对照组、IkappaB激酶特异性抑制剂PS1145(10μmol/L)处理组、瘦素(50μg/L)处理组、瘦素(50μg/L) PS1145(10μmol/L)组,各组孵育时间均为6h,分别检测细胞核内核转录因子κB活性及肿瘤坏死因子α在mRNA水平的表达。主要观察指标:①不同浓度瘦素对RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α:mRNA表达水平的影响;蛋白分泌的影响。②不同浓度瘦素对RAW264.7细胞核内核转录因子κB活性的影响。③抑制IkappaB激酶活性对瘦素诱导RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α的影响。结果:①RAW264.7细胞经不同浓度的瘦素处理后,肿瘤坏死因子α在mRNA水平呈瘦素剂量依赖性增加,50μg/L瘦素处理组达峰值。②蛋白水平的表达呈瘦素剂量时间依赖性增加,50μg/L瘦素处理6h即可达峰值。③核转录因子κB的活性亦与瘦素浓度正相关,50μg/L瘦素处理6h后核转录因子κB活性最高(P<0.05)。④抑制IkappaB激酶活性可部分抑制肿瘤坏死因子α的表达。结论:瘦素可直接促进RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α的表达和分泌,并呈剂量时间依赖性,其机制可能与瘦素激活核转录因子κB有关。这可能是瘦素致动脉粥样硬化的机制之一。     

人参皂苷Rg1对淀粉样β蛋白诱导大鼠海马神经元损伤的保护

目的:观察人参皂苷Rg1对淀粉样β蛋白25～35诱导的海马神经元细胞损伤是否具有保护作用,并分析其作用机制。方法:实验于2004-03/2005-03在广州中医药大学临床药理研究所DME中心完成。①取新生24h清洁级SD大鼠,无菌环境下取出海马组织进行贴壁培养并以B27无血清培养基添加剂抑制非神经元细胞的生长。②海马神经元形态及细胞活力观察:细胞培养7d至分化成熟状态,然后被随机分为3组:人参皂苷Rg1预处理组(分为1,2,4,8,16μmol/L5个浓度组),首先每加入各浓度的Rg1(中国药品生物制品检定所提供,批号:0703-200221)预作用24h后,再加入40μmol/L淀粉样β蛋白25～35共孵育24h;模型组:每孔加入40μmol/L淀粉样β蛋白25～35作用24h;空白组:正常细胞培养用液;每组均为8孔。运用倒置显微镜进行海马神经元形态学观察,四甲基偶氮唑盐比色法法检测细胞活力,即吸光度(A值),该值越高说明细胞活力越强。③检测核因子κB活性:调整细胞悬液密度为2×108L-1,接种于6孔板(内置已用多聚赖氨酸包被的盖玻片),1mL/孔。随机分为5组(3孔/组):正常组,模型组,2,4,8μmol/L人参皂甙Rg1预处理组。细胞培养7d后,2,4,8μmol/L人参皂甙Rg1预处理组加终浓度为2,4,8μmol/L的人参皂甙Rg1预作用24h后,与模型组一起加40μmol/L淀粉样β蛋白,作用24h。激光共聚焦显微镜检测核因子κB在细胞内的激活程度,以图像分析仪计算核区荧光与胞浆区荧光比值,比值越高说明核因子κB活性越高。④计量结果差异比较采用单因素方差分析。结果:①神经元细胞形态:相差显微镜下可见人参皂甙Rg1预处理组细胞损伤相对较模型组轻,但较正常组严重。②海马神经元细胞活力:正常组和2,4μmol/L人参皂甙Rg1预处理组明显高于模型组(P<0.05),以4μmol/L人参皂甙Rg1预处理组最高;1,8,16μmol/L人参皂甙Rg1预处理组虽然也高于模型组,但差异不明显(P>0.05)。③神经元细胞核因子κB活性:正常组和2,4,8μmol/L人参皂甙Rg1预处理组明显高于模型组(P<0.01),以4μmol/L人参皂甙Rg1预处理组最高;4,8μmol/L人参皂甙Rg1预处理组明显高于正常组(P<0.01)。结论:人参皂甙Rg1对淀粉样β蛋白25～35诱导的大鼠海马神经元损伤具有保护作用,尤以4μmol/L人参皂甙Rg1作用效果最明显。核因子κB信号通路可能是人参皂甙Rg1对抗淀粉样β蛋白25～35细胞毒性作用的重要途径之一。     

羧甲基壳聚糖对体外培养许旺细胞增殖及核因子κB表达的影响

背景：研究表明羧甲基壳聚糖对多种细胞具有促增殖作用,但其对许旺细胞增殖的影响及具体作用机制有待进一步探索。 目的：观察羧甲基壳聚糖对许旺细胞的促增殖作用,以及其对许旺细胞内核因子κB表达及活性的影响。 方法：取对数生长期的SD乳鼠许旺细胞细胞悬液接种于96孔板,分别以PBS、0,10,50,100,200,500,1 000 mg/L羧甲基壳聚糖培养24 h,采用CCK-8法检测细胞增殖。取对数生长期的SD乳鼠许旺细胞,胰酶消化后制备成细胞悬液,接种于6孔细胞培养板内,分别加入50 mg/L羧甲基壳聚糖、100 mg/L羧甲基壳聚糖、200 mg/L羧甲基壳聚糖、PBS培养24 h,进行BrdU、Real-time PCR及Western blot法检测。 结果与结论：CCK-8及BrdU检测结果表明羧甲基壳聚糖在50-1 000 mg/L范围内可促进许旺细胞增殖,200-500 mg/L时促增殖效应最明显。Real-time PCR及Western blot结果表明50-200 mg/L羧甲基壳聚糖可促进许旺细胞内核因子κB mRNA及蛋白的表达,且具有浓度依赖性。表明羧甲基壳聚糖可促进体外培养许旺细胞的增殖及其核因子κB的表达。     

何首乌有效成分二苯乙烯甙对神经细胞保护作用的机制

目的:观察2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖甙对两种拟痴呆细胞模型的作用,探讨何首乌主要有效成分二苯乙烯甙神经保护作用的机制,为阐明何首乌及以其为主要成分的中药复方的功效机制提供实验依据。方法:不同浓度二苯乙烯甙(5～400μmol/L)分别与SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞共孵育6,24h,加入工具药β-amyloid25-35(终浓度25μmol/L)孵育24h或500μmol/L过氧化氢孵育2h。MTT法测定细胞存活率,细胞膜损伤测定乳酸脱氢酶漏出率(LDH%)。结果:①50～400μmol/L二苯乙烯甙与细胞预孵育6h可明显拮抗β-amyloid25-35引起的细胞存活率下降,随剂量增加,保护作用上升,至200μmol/L保护作用最强。200,400μmol/L二苯乙烯甙能拮抗β-amyloid25-35引起的细胞乳酸脱氢酶漏出率增高。5～200μmol/L二苯乙烯甙与细胞预孵育24h,可使β-amyloid25-35引起的细胞存活率下降恢复正常。200μmol/L二苯乙烯甙使β-amyloid25-35引起的细胞LDH%增多恢复正常。②5μmol/L二苯乙烯甙与细胞预孵育6h,即可明显拮抗过氧化氢引起的细胞存活率下降及LDH%增多犤LDH%:(62.47±2.43)%;MTT(A):0.1093±0.0074犦,至200μmol/L保护作用最强犤LDH%:(46.10±2.10)%;MTT(A):0.2487±0.0283犦。二苯乙烯甙与细胞预孵育24h,5～400μmol/L二苯     

莪术醇对小鼠黑色素瘤B16细胞增殖和迁移的影响

【目的】探讨莪术醇对小鼠黑色素瘤B16细胞增殖和迁移的影响。【方法】10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养小鼠黑色素瘤B16细胞。不同剂量莪术醇(50、100、200μmol/L)处理B 16细胞后,检测细胞增殖、迁移和miR-7-5p含量;miR-7-5p inhibitor预处理后,再用莪术醇100μmol/L处理B16细胞,检测细胞增殖和迁移。【结果】不同剂量莪术醇(50、100、200μmol/L)处理B 16细胞后,细胞490nm吸光度值均低于对照组,且随着莪术醇浓度的增加,细胞490 n m吸光度值降低显著,差异均有统计学意义(P<0.05)。不同剂量莪术醇(50、100、200μmol/L)处理B 16细胞后,穿膜细胞数均低于对照组,且随着莪术醇浓度的增加,穿膜细胞数降低显著,差异均有统计学意义(P<0.05)。通过real-time PCR验证miR-7-5p inhibitor转染B16细胞后的抑制效果,NC-inhibitor和miR-7-5p inhibitor转染后细胞miR-7-5p表达分别为(1.02±0.10)和(0.41±0.14),差异有统计学意义(P<0.05)。抑制B16细胞miR-7-5p表达后,观察莪术醇对细胞增殖的调控,与NC inhibitor相比(1.413±0.108),miR-7-5p inhibitor升高莪术醇处理B16细胞490nm吸光度值(1.697±0.089),差异有统计学意义(P<0.05)。【结论】莪术醇能够抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖和迁移,其机制可能与增加miR-7-5p表达有关。     

融合蛋白TAT-NEP1-40对PC12细胞氧糖剥脱模型保护作用的研究

目的观察融合蛋白TAT-NEP1-40的细胞转导功能及其对PC12细胞氧糖剥脱模型(OGD)损伤的保护作用。方法含80nmol/L浓度TAT-NEP1-40的DMEM培养液孵育PC12细胞60min后,用免疫荧光染色法检测该融合蛋白的细胞转导功能;以Na2S2O4造成缺氧合并缺糖模拟PC12细胞缺血性损伤,分别给予TAT-NEP1-40、TAT-β-gal及β-gal等进行处理,利用MTT比色法、FCM法及Hoechst33258染色法检测PC12细胞存活情况并计算保护率,观察TAT-NEP1-40对模拟PC12细胞缺血性损伤的保护作用。结果 (1)TAT-NEP1-40蛋白能跨细胞膜进入PC12细胞;(2)该蛋白具有保护作用,最大保护率为66.8%;(3)该蛋白能提高PC12细胞拟缺血损伤时的存活率,TAT-NEP1-40较OGD模型组高,活细胞生存率分别为(90.05±1.83)%、(77.10±2.00)%,P<0.05。结论融合蛋白TAT-NEP1-40具有细胞转导功能,对体外模拟PC12细胞缺血性损伤具有保护作用。